原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中Syntaxin 8表達(dá)變化及意義

許新征，高福洋，黃淑紅，張化玉（承德市中心醫(yī)院，河北承德067000；山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院）

·臨床研究·

原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中Syntaxin 8表達(dá)變化及意義

許新征1，高福洋1，黃淑紅2，張化玉1
（1承德市中心醫(yī)院，河北承德067000；2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院）

目的 觀察突觸融合蛋白8（Synatxin 8）在原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）組織中的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 收集75例HCC患者術(shù)后肝癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁肝硬化組織，采用組織芯片免疫組織化學(xué)染色及Western blotting方法檢測(cè)Syntaxin 8蛋白表達(dá)，分析Syntaxin 8蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 HCC組織中Syntaxin 8蛋白表達(dá)較癌旁肝硬化組織明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Syntaxin 8蛋白表達(dá)與HCC患者的性別、年齡無(wú)關(guān)，而與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。結(jié)論 Syntaxin 8蛋白在HCC組織中呈低表達(dá)，Synatxin 8可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展。

肝腫瘤；原發(fā)性肝細(xì)胞癌；肝癌組織；突觸融合蛋白8；腫瘤分化程度

原發(fā)性肝癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)生率和病死率均較高，其中70%～85%屬于原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）［1］。HCC誘因復(fù)雜，起病隱匿，發(fā)展迅速，且極易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這些特點(diǎn)是影響其術(shù)后治療效果和預(yù)后的最大障礙［2］。了解HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找HCC特異性分子標(biāo)志物，對(duì)于HCC的診療有重要意義。越來(lái)越多的研究表明可溶性N-己基順丁烯二酰亞胺敏感因子（NSF）附著蛋白受體（SNARE）蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并作為腫瘤的治療靶點(diǎn)受到越來(lái)越多重視［3～5］。突觸融合蛋白8（Synatxin 8）屬于SNARE家族中Syntaxin亞家族的成員之一，在胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸及膜融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6～8］。2008 年5月～2014年12月，我們采用組織芯片免疫組織化學(xué)染色及Western blotting方法檢測(cè)75例HCC組織中Syntaxin 8蛋白表達(dá)，分析Syntaxin 8蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 75例HCC患者，均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)診斷，男62例、女13例，年齡34～73歲，中位年齡56歲，其中≥60歲18例，＜60歲57例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例?；颊呔懈尾糠智谐g(shù)，術(shù)中分別切取非壞死區(qū)肝癌組織（肝癌組織）及距腫瘤邊緣至少2 cm肝硬化組織（癌旁組織），體積約0.5 cm ×0.5 cm×0.5 cm。組織塊經(jīng)脫水、包埋、切片后制成組織切片。

1.2 Syntaxin 8蛋白在肝癌組織及癌旁肝臟組織中的表達(dá)檢測(cè) ①免疫組織化學(xué)染色法：60℃烘烤切片2 h，4 μm厚度石蠟切片脫蠟至水；雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中90℃微波抗原修復(fù)8 min；5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h；Syntaxin 8鼠抗人一抗1∶200稀釋后室溫孵育1 h后4℃過(guò)夜；聚合物增強(qiáng)劑室溫孵育20 min，酶標(biāo)抗鼠聚合物室溫孵育25 min，常規(guī)DAB顯色。以磷酸緩沖液PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，同時(shí)作空白對(duì)照。根據(jù)陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照的顯色情況，在排除假陽(yáng)性和假陰性的前提下，計(jì)數(shù)每例份腫瘤組織中的所有腫瘤細(xì)胞，當(dāng)＞10%細(xì)胞著色判斷為表達(dá)陽(yáng)性，且以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染成棕黃為弱陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)［9］。②Western blotting法：為進(jìn)一步證實(shí)免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果，選取8例樣本對(duì)Syntaxin 8蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。取新鮮冰凍肝癌組織和癌旁組織按照重量體積比1∶3加入組織裂解液（Tris-Cl 10 mmol/L，pH 8.0，NaCl 150 mmol/L，EDTA 1 mmol/L，1%NP-40，10%甘油及蛋白酶抑制劑）進(jìn)行裂解，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。配置10%分離膠和8%濃縮膠，取組織總蛋白50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳：32 mA，60 min；轉(zhuǎn)膜：110 V，120 min，將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h后，抗Syntaxin 8（1∶1 000）及抗β-tubulin （1∶20 000）抗體室溫孵育1 h；TBST漂洗后，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h；TBST漂洗后電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)Syntaxin 8蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Syntaxin 8蛋白在肝癌組織及癌旁肝臟組織中的表達(dá)比較 Syntaxin 8蛋白定位于肝細(xì)胞胞質(zhì)及核周，呈棕色顆粒狀，彌漫或灶性分布；肝癌組織及癌旁肝臟組織均能被染色，只是肝癌組織中癌細(xì)胞染色為淺棕色，而癌旁肝臟組織肝細(xì)胞呈深棕色，提示肝癌組織中Syntaxin 8蛋白表達(dá)量低于癌旁組織（圖1）。與癌旁組織相比48%（36/75）肝癌組織有不同程度的Syntaxin 8基因表達(dá)水平下調(diào)。Western blotting結(jié)果顯示，Syntaxin 8蛋白在癌旁肝臟組織及肝癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為77.3%、29.3%，二者比較，P＜0.05。

圖1 Syntaxin 8蛋白在人肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 Syntaxin 8蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系 肝癌組織中Syntaxin 8蛋白表達(dá)與HCC患者腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 Syntaxin 8蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

Syntaxin 8在多種組織中均有表達(dá)，如心臟、腦、脾、肺、腎、肝等［10］。在胞內(nèi)其主要定位于高爾基體、內(nèi)體和溶酶體的膜組分中，作為SNARE成員，在物質(zhì)運(yùn)輸和膜融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用［9，11］。研究表明Syntaxin 8與其他三個(gè)SNARE成員Syntaxin 7、vti1b或vti1a及VAMP7或VAMP8在膜融合過(guò)程中形成復(fù)合物促進(jìn)晚期內(nèi)體之間的同源融合及晚期內(nèi)體與溶酶體間的融合，從而促進(jìn)蛋白的降解過(guò)程［11］。Syntaxin 8還參與到某些離子通道或受體的胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，如氯離子通道囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)器CFTR及神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrkA等［12～14］。

我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及Western blotting方法檢測(cè)到Syntaxin 8蛋白在HCC患者肝癌組織中表達(dá)水平較癌旁組織明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)分析Syntaxin 8蛋白表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)Syntaxin 8蛋白表達(dá)與患者年齡、性別無(wú)關(guān)，但與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且腫瘤越大，TNM分期越晚，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則Syntaxin 8蛋白表達(dá)下調(diào)越明顯；即Syntaxin 8蛋白與HCC的預(yù)后有關(guān)，Syntaxin 8蛋白表達(dá)越高，腫瘤越小、TNM分期越早、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越少。提示Syntaxin 8蛋白作為抑癌因子在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)、減少腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

研究［4］發(fā)現(xiàn)SNARE成員在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其中Syntaxin 8被發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中與抑癌基因Mig-6結(jié)合，通過(guò)影響表皮生長(zhǎng)因子受體EFGR內(nèi)吞后的轉(zhuǎn)運(yùn)及其降解過(guò)程，從而影響EGFR介導(dǎo)的促腫瘤信號(hào)［15］，而EGFR被報(bào)道能促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［16］，因此Syntaxin 8 在HCC中可能通過(guò)促進(jìn)EGFR的降解過(guò)程發(fā)揮其抑癌機(jī)制。除此之外，Syntaxin 8亦可通過(guò)參與其他癌基因的降解過(guò)程或其他癌基因或抑癌基因的胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程來(lái)影響這些基因生物學(xué)功能的發(fā)揮，從而達(dá)到抑癌效果，而Syntaxin 8的具體抑癌機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，肝癌組織中低表達(dá)Syntaxin 8蛋白能明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這在HCC基因治療中有一定臨床應(yīng)用前景。Syntaxin 8蛋白可能通過(guò)促進(jìn)EGFR的降解抑制肝癌的發(fā)生，但在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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