NS-398聯(lián)合奧曲肽對人胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響及機制

朱威，饒雷平，趙登秋，王叢（岳陽市二人民醫(yī)院，湖南岳陽44000；上海市第六人民醫(yī)院；上海市公共衛(wèi)生臨床中心）

NS-398聯(lián)合奧曲肽對人胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響及機制

朱威1，饒雷平2，趙登秋2，王叢3
（1岳陽市二人民醫(yī)院，湖南岳陽414000；2上海市第六人民醫(yī)院；3上海市公共衛(wèi)生臨床中心）

目的 探討選擇性Cox-2抑制劑NS-398和生長抑素類似物奧曲肽對體外培養(yǎng)的人胃癌SGC-7901細胞株增殖、凋亡的影響及機制。方法 取對數(shù)生長期人胃癌SGC-7901細胞，隨機分為空白組、對照組、NS-398組、奧曲肽組及聯(lián)合用藥組，空白組僅含培養(yǎng)液和等體積的DMSO，對照組為SGC7901細胞的單細胞懸液200 μL+等體積的DMSO，NS-398組給予NS-398 100 μmol/L，奧曲肽組給予奧曲肽10 μmol/L，聯(lián)合用藥組給予NS-398 100 μmol/L+奧曲肽10 μmol/L，分別培養(yǎng)24、48、72 h，采用CCK-8法檢測各組胃癌SGC-7901細胞增殖抑制率，顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)學變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實時定量熒光PCR及蛋白印跡法檢測Cox-2蛋白表達。結果 干預后72 h，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組SGC7901細胞增殖抑制率分別為（39.0±3.2）%、（41.3± 1.8）%、（78.8±1.4）%，聯(lián)合用藥組與NS-398組、奧曲肽組比較，P均＜0.01。顯微鏡下觀察NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組可見典型的細胞凋亡形態(tài)改變，尤以聯(lián)合用藥組為著。NS-398組、奧曲肽組和聯(lián)合用藥組細胞凋亡率分別為（12.06±1.26）%、（19.87±1.45）%和（29.74±2.52）%，顯著高于對照組的（2.13±0.28）%（P均＜0.01），聯(lián)合用藥組細胞凋亡率顯著高于NS-398組、奧曲肽組（P均＜0.01）。NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組Cox-2表達均顯著下降（P均＜0.01），尤以聯(lián)合用藥組降低更明顯。結論 NS-398聯(lián)合奧曲肽可協(xié)同抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖并誘導其凋亡，其機制可能與下調Cox-2表達有關。

胃癌；NS-398；奧曲肽；細胞增殖；細胞凋亡

胃癌指發(fā)生于胃上皮組織的惡性腫瘤，為世界上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一［1］。臨床以處于進展期的胃癌患者多見，手術根治率低，部分患者甚至無法手術切除，而化療又存在一定不良反應及多重耐藥性等缺點。近年發(fā)展起來的選擇性環(huán)氧合酶2（Cox-2）抑制劑不僅使選擇性地抑制Cox-2發(fā)揮抗腫瘤作用成為可能，且避免了傳統(tǒng)NSAIDs由于同時抑制Cox-1而導致的不良反應。奧曲肽是人工合成的生長抑素類似物，通過與靶細胞上的生長抑素受體（SSTR）結合后發(fā)揮抗腫瘤作用。目前研究已證實選擇性Cox-2抑制劑和生長抑素類似物對胃癌細胞SGC7901的增殖均有抑制作用［2，3］，但兩種藥物聯(lián)用能否增強對胃癌的抑制作用研究較少。2013年6月～2014年6月，我們探討了NS-398和奧曲肽對體外培養(yǎng)的人胃癌SGC-7901細胞株增殖、凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌SGC-7901細胞株購于上海博谷生物科技有限公司。Cox-2抑制劑NS-398購自Sigma公司；奧曲肽購自瑞士諾華公司；RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS，Gibco公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所）；Annexin-FITC/PI雙染色試劑盒（BD公司）；PrimeScriptTMRT Reagent Kit （Perfect Real Time）和SYBR Premix Ex TaqTM（寶生物工程大連有限公司）；Cox-2和GAPDH引物合成（上海博尚生物技術有限公司）；Cox-2多克隆抗體（兔來源）（Santa Cruz公司）。CO2細胞培養(yǎng)箱和酶標儀（Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（Leica公司）；流式細胞儀（BD公司）；iCycler iQ多色實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio-rad公司）；蛋白SDS-PAGE電泳儀（Amersham Pharmacia Biotech）。

1.2 細胞增殖抑制率測算 采用CCK-8法。SGC-7901細胞用RPMI1640培養(yǎng)液加10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化，制成細胞懸液。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，消化成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板內，每孔200 μL，細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。將細胞隨機分為空白組、對照組、NS-398組、奧曲肽組及聯(lián)合用藥組，空白組僅含培養(yǎng)液和等體積的DMSO，對照組為SGC7901細胞的單細胞懸液200 μL+等體積的DMSO，NS-398組NS-398濃度為100 μmol/L，奧曲肽組奧曲肽濃度為10 μmol/L，聯(lián)合用藥組NS-398濃度為100 μmol/L，奧曲肽濃度為10 μmol/L，每組設3個復孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h，向各孔中加入10 μL的CCK-8溶液37℃下孵育4 h。酶標儀測定450 nm處的OD值。實驗重復3次。根據(jù)各組OD值求得各組抑制率后，用金正均［4］法判斷兩藥的相互作用，根據(jù)在量效曲線線性區(qū)內，兩藥合并用藥的抑制率及兩個單用藥的抑制率，用以下公式計算q值：q值=兩藥合用的抑制率/兩單藥預計抑制率= E（A+B）/（EA+EB-EA×EB）。當q值=1±0.15時，兩藥有相加作用，q值＞1.15時，兩藥有協(xié)同作用，當q值＜0.85時，兩藥有拮抗作用。

1.3 細胞凋亡形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期細胞，NS-398、奧曲肽和聯(lián)合用藥組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化（顯微鏡放大倍數(shù)為100倍）。

1.4 細胞凋亡率測算 取對數(shù)生長期細胞，NS-398、奧曲肽和聯(lián)合用藥組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，常規(guī)收集各組細胞，用胰酶消化細胞，將含細胞的培養(yǎng)液吸至離心管內，PBS離心、清洗2次，用預冷的結合緩沖液重懸細胞Annexin V-FITC和PI雙染色法，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

1.5 胃癌細胞內Cox-2 mRNA表達檢測 采用Real-time PCR法。取對數(shù)生長期細胞，NS-398、奧曲肽和聯(lián)合用藥組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，常規(guī)收集各組細胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，實時熒光定量PCR反應體系測定Cox-2 mRNA表達，結果以GAPDH為內參計算相對值，實驗重復3次，取平均值。

1.6 胃癌細胞內Cox-2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取對數(shù)生長期細胞，NS-398、奧曲肽和聯(lián)合用藥組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，常規(guī)收集各組細胞。提取細胞中的總蛋白，BCA法測定Cox-2蛋白濃度，SD-PAGE電泳，將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉移至硝酸纖維素膜上轉膜成功后，用5%脫脂奶粉封閉2 h；加一抗，Cox-2多克隆抗體以1∶500稀釋，GAPDH單克隆抗體以1∶2 000稀釋，4℃放置過夜。用PBS-T液洗滌3次，每次10 min。加二抗，振蕩孕育1 h。用PBS-T洗滌3次，每次10 min。使用Image J圖像分析軟件測定蛋白條帶積分光密度值，實驗重復3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NS-398和奧曲肽對SGC-7901細胞增殖的影響 見表1。藥物的相互作用結果：q24 h=1.19，q48 h=1.20，q72 h=1.23。兩藥聯(lián)用對SGC-7901細胞增殖有協(xié)同抑制作用，且呈時間依賴性。

表1 各組不同時點SGC-7901細胞增殖抑制率比較（%±s）

表1 各組不同時點SGC-7901細胞增殖抑制率比較（%±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與NS-398組及奧曲肽組比較，#P ＜0.01。

SGC-7901細胞增殖抑制率組別24 h48 h72 h對照組000 NS-398組14.3±3.1*27.2±1.9*39.0±3.2*奧曲肽組22.4±3.4*28.1±2.0*41.3±1.8*聯(lián)合用藥組39.5±2.8*#57.2±3.8*#78.8±1.4*#q 1.19 1.20 1.23

2.2 SGC-7901細胞凋亡形態(tài)改變 光鏡下對照組SGC-7901胃癌細胞呈多邊形或梭形，貼壁生長。NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組24 h后開始出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學改變，表現(xiàn)為細胞懸浮、細胞胞體縮小、細胞膜皺縮，細胞核濃縮，部分細胞發(fā)生融合，細胞數(shù)量明顯減少，聯(lián)合用藥組與NS-398組、奧曲肽組相比，上述改變更明顯。

2.3 NS-398和奧曲肽對SGC-7901細胞凋亡的影響 SGC-7901細胞被干預24 h后，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組、對照組細胞凋亡率分別為12.06%±1.26%、19.87%±1.45%、29.74%± 2.52%、2.13%±0.28%，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組與對照組比較，P均＜0.01；NS-398組、奧曲肽組與聯(lián)合用藥組比較，P均＜0.01。

2.4 NS-398和奧曲肽處理對SGC-7901細胞Cox-2 mRNA表達的影響 NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組、對照組Cox-2 mRNA的相對表達量分別為23.069±2.033、19.763±2.168、6.133±0.554、52.913±4.723，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組與對照組比較，P均＜0.01；NS-398組、奧曲肽組與聯(lián)合用藥組比較，P均＜0.01。

2.5 NS-398和奧曲肽處理對SGC-7901細胞Cox-2蛋白表達的影響 NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組、對照組Cox-2蛋白的相對表達量分別為0.318± 0.040、0.465±0.029、0.182±0.014、0.721± 0.027，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組與對照組比較，P均＜0.01；NS-398組、奧曲肽組與聯(lián)合用藥組比較，P均＜0.01。

3 討論

Cox-2是花生四烯酸（AA）轉化為PGH2的限速酶，近年來研究表明，Cox-2在胃癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，其作用機制可能包括促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，參與腫瘤血管生成，促進腫瘤侵襲及轉移，抑制抗腫瘤免疫［5］。此外Cox-2還可通過參與致癌物代謝、影響細胞周期等途徑參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。Cox-2抑制劑可能通過Cox-2依賴和非依賴途徑發(fā)揮抗胃癌作用［6］。傳統(tǒng)的Cox-2抑制劑非甾體類抗炎藥可抑制Cox-2表達而誘導癌細胞凋亡，但同時可抑制Cox-1，有嚴重的不良反應。近年發(fā)展起來的選擇性Cox-2抑制劑（如NS-398、塞來昔布等）使選擇性地抑制Cox-2發(fā)揮抗腫瘤作用成為可能，且不良反應少。

奧曲肽是人工合成的生長抑素類似物，通過與靶細胞上的生長抑素受體（SSTR）結合后發(fā)揮抗腫瘤作用，但其確切機制尚不清楚，可能的機制［7］：①直接與腫瘤細胞表面的SSTR結合，通過多種信號傳導途徑，阻滯腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡；②與非腫瘤細胞表面的SSTR結合，并通過抑制多種促腫瘤生長的激素或細胞因子的釋放，抑制腫瘤血管生成、誘導腫瘤細胞凋亡。

本研究經CCK-8試驗證實選擇性Cox-2抑制劑NS-398聯(lián)合生長抑素類似物奧曲肽對胃癌SGC7901細胞的增殖呈協(xié)同抑制作用，并隨作用時間的延長而增強。采用流式細胞技術對細胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，NS-398和奧曲肽均能誘導SGC7901細胞凋亡，而兩藥聯(lián)用能顯著誘導胃癌細胞凋亡，具有協(xié)同作用。選擇性Cox-2抑制劑和生長抑素類似物在胃癌細胞上雖有各自作用的靶點，但卻有共同的信號通路，如轉錄活化蛋白1（AP-1）是炎癥或腫瘤情況下調節(jié)Cox-2表達的重要轉錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，選擇性Cox-2抑制劑可抑制p38 MAPK的磷酸化，抑制c-fos和c-jun二聚體復合物與AP-1 DNA位點的結合，下調AP-1的活性，從而降低Cox-2表達［8］。而生長抑素類似物奧曲肽亦能通過抑制ERK-1/ ERK-2表達，進而抑制c-fos表達，降低AP-1結合DNA的能力，下調AP-1的活性［9］。當兩者聯(lián)用時，可能抑制AP-1 DNA結合活性加強，使Cox-2的表達下調至很低水平，從而更加有效地阻斷了Cox-2促癌生長作用，發(fā)揮協(xié)同抗癌效應［10］。本研究結果顯示，兩藥聯(lián)用抑制胃癌細胞生長的機制可能與協(xié)同下調胃癌細胞內Cox-2表達有關。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.013

R735.2

A

1002-266X（2016）25-0041-03

上海市金山區(qū)衛(wèi)生計生委課題（GSKG-KTQN-2013-06）。

趙登秋（E-mail：zhaodengqiu@126.com）

2015-12-28）