異氟醚后處理對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制

楊雅婷，王媛，徐瑩，潘峰，趙平（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004）

異氟醚后處理對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制

楊雅婷，王媛，徐瑩，潘峰，趙平
（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004）

目的 探討異氟醚后處理對(duì)缺血缺氧性腦損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 選取7日齡新生SD大鼠100只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血缺氧組（HI組）、1.5%異氟醚后處理組（Iso組）、1.5%異氟醚后處理+激動(dòng)劑組（Iso+AMPA組）、1.5%異氟醚后處理+抑制劑組（Iso+CNQX組），每組20只。除Sham組大鼠僅找到左側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，其余各組大鼠均雙重結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，后放回母鼠身邊喂哺2 h，再以8%O2+92%N2的濕化混合氣體以2 L/min流量低氧處理2 h，制備HIBD模型。模型制備成功后，Iso組、Iso+AMPA組、Iso+CNQX組均即刻吸入1.5%異氟醚30 min，以30%O2+70%N2濕化混合氣體輸送，流量2 L/min，其余各組僅吸入30%O2+70%N2濕化混合氣體，流量2 L/min處理30 min。大鼠蘇醒后，30 min內(nèi)完成側(cè)腦室注射：Sham組、HI組、Iso組左側(cè)腦室注射生理鹽水5 μL，Iso+AMPA組左側(cè)腦室注射AMPA 5 μL，濃度為50 μg/mL，Iso+CNQX組左側(cè)腦室注射CNQX 5 μL，濃度為50 μg/mL。手術(shù)后7 d，測(cè)定大鼠體質(zhì)量，測(cè)定左/右大腦半球質(zhì)量并計(jì)算質(zhì)量比，切片HE染色計(jì)數(shù)左、右側(cè)大腦海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元并計(jì)算密度比。結(jié)果 各組大鼠體質(zhì)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），與Sham組比較，各組大鼠左/右大腦半球質(zhì)量比均下降（P均＜0.05），左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比下降（P均＜0.05），與HI組比較，Iso組、Iso+CNQX組大鼠左/右大腦半球質(zhì)量比及左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比明顯升高（P均＜0.05），而Iso+AMPA組大鼠左/右大腦半球質(zhì)量比及左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比卻無明顯變化（P均＞0.05）。相較Iso組，Iso+CNQX組大鼠左/右大腦半球質(zhì)量比及左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比無明顯變化（P均＞0.05），而Iso+AMPA組大鼠左/右大腦半球質(zhì)量比及左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比明顯降低（P均＜0.05）。結(jié)論 異氟醚后處理對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制AMPA受體過度活化有關(guān)。

顱腦損傷；缺血缺氧；異氟醚；異氟醚后處理；新生大鼠；AMPA受體

新生兒缺血缺氧性腦損傷（HIBD）是圍產(chǎn)期因某種因素引起的新生兒窒息導(dǎo)致的腦損傷，致死率高達(dá)25%，幸存患兒致殘率高達(dá)25%，目前臨床尚無有效的治療方法［1，2］。HIBD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及神經(jīng)毒性學(xué)說、能量代謝學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、免疫炎癥學(xué)說等方面。其中，神經(jīng)毒性學(xué)說在諸如缺血缺氧性腦病、癲癇、阿爾茨海默病、帕金森等各種中樞神經(jīng)系疾病的發(fā)生發(fā)展中占重要地位，因此中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸及其受體成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本課題組前期研究證實(shí)異氟醚后處理對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷有保護(hù)作用，且該保護(hù)作用可能與抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放有關(guān)。mPTP開放可導(dǎo)致能量合成及細(xì)胞氧化反應(yīng)障礙，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致ATP水平下降，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高與ATP水平密切相關(guān)［3～5］。AMPA受體作為谷氨酸受體的重要離子亞型，大量研究表明谷氨酸與受體結(jié)合后，AMPA受體激活先于NMDA受體，其受體數(shù)量和類型的改變對(duì)Ca2+通透性起關(guān)鍵作用［6］，國內(nèi)有研究證明在新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型中應(yīng)用AMPA受體阻斷劑可減輕新生大鼠的腦損傷程度［7］，丙泊酚后處理在成年大鼠缺血再灌注損傷模型中對(duì)AMPA受體亞型亦有影響［8］，而有關(guān)異氟醚后處理對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的保護(hù)作用是否與AMPA受體有關(guān)尚未見相關(guān)報(bào)道。2014年6～12月，我們通過構(gòu)建新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型，觀察AMPA受體拮抗劑和激動(dòng)劑對(duì)異氟醚后處理腦保護(hù)作用的影響，進(jìn)一步探討異氟醚后處理對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 7日齡新生SD大鼠100只，體質(zhì)量12～16 g，雌鼠與雄鼠由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，雌鼠體質(zhì)量200～250 g，雄鼠250～350 g，動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)，孕鼠分籠飼養(yǎng)。異氟醚（活寧）購自上海雅培制藥有限公司；AMPA由英國Abcam公司分裝進(jìn)口；CNQX由英國Abcam公司分裝進(jìn)口；7-0絲線購自中國杭州愛普醫(yī)療器械有限公司；4%多聚甲醛固定液購自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心；蔗糖：國產(chǎn)分析純；伊紅染色液、蘇木素染色液購自上海百蕊生物科技有限公司；氣體監(jiān)護(hù)儀購自美國Datex-Ohmeda公司；電熱恒溫水浴箱購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FA1004天平購自上海天平儀器廠；光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus公司。

1.2 模型制備及分組 將大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組（Sham組）、缺血缺氧組（HI組）、1.5%異氟醚后處理組（Iso組）、1.5%異氟醚后處理+激動(dòng)劑組（Iso+AMPA組）、1.5%異氟醚后處理+抑制劑組（Iso+CNQX組）。參考文獻(xiàn)［9，10］方法制備HIBD模型。新生大鼠異氟醚麻醉，將其固定于消毒手術(shù)板上，并用面罩持續(xù)吸入異氟醚維持麻醉，于解剖顯微鏡下用7-0絲線兩次結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合傷口于母鼠身邊喂哺2 h。自制缺氧箱置于水浴箱內(nèi)，維持水浴溫度37℃，缺氧箱底鋪鈉石灰以吸收CO2和水蒸氣，將大鼠置于鈉石灰上的軟墊上。氣體監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)，以2 L/min的流量持續(xù)濕化輸入8%O2+92%N2的混合氣體，低氧處理2 h后取出。Sham組只暴露頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎，不進(jìn)行低氧處理，其余各組均進(jìn)行缺血缺氧處理。之后Iso組、Iso+AMPA組、Iso+CNQX組即刻吸入由30%O2+70%N2濕化混合氣體以2 L/min輸送的1.5%異氟醚30 min，Sham組、HI組同樣環(huán)境只吸入30%O2+70%N2濕化混合氣體2 L/min，30 min。異氟醚處理后30 min內(nèi)完成側(cè)腦室注射：參考文獻(xiàn)［11］的方法，Iso+AMPA組左側(cè)腦室注射AMPA 5 μL（50 μg/mL），參考文獻(xiàn)［12］的方法，Iso+CNQX組左側(cè)腦室注射CNQX 5 μL（50 μg/mL），其余各組左側(cè)腦室注射生理鹽水5 μL。

1.3 新生大鼠存活情況及體質(zhì)量監(jiān)測(cè) 缺血缺氧后，記錄1周內(nèi)各組新生大鼠存活只數(shù)及體質(zhì)量變化，對(duì)比術(shù)后7 d與大鼠缺氧前的體質(zhì)量改變。

1.4 左/右大腦半球質(zhì)量比測(cè)算 缺血缺氧后7 d，新生大鼠于深麻醉狀態(tài)下，暴露心臟剪破左心室放血，迅速斷頭取腦，冰上用冷鹽水沖洗，腦組織表面血跡干凈后用濾紙吸干多余的水分，分離左右大腦半球各自稱重，計(jì)算左/右大腦半球質(zhì)量比。

1.5 左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比測(cè)算缺血缺氧后7 d，新生大鼠于深麻醉狀態(tài)下心臟灌流生理鹽水30 mL，之后灌注4%多聚甲醛30 mL內(nèi)固定，迅速斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中，室溫固定8 h，再分別用20%、30%蔗糖溶液行梯度脫水。取大腦中后1/3，行冰凍冠狀切片，片厚8 μm。室溫晾干6 h后行HE染色，中性樹膠封片、晾干。檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度：光學(xué)顯微鏡下400倍照相，于左右對(duì)應(yīng)海馬CA1區(qū)選取三個(gè)視野，0.002 5 mm2范圍計(jì)數(shù)正常細(xì)胞數(shù)并取平均值，計(jì)算左/右正常神經(jīng)元密度比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較用單因素方差分析，樣本均數(shù)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況及體質(zhì)量比較 各組大鼠死亡主要發(fā)生在缺血缺氧過程中，結(jié)果顯示僅HI組、Iso組、Iso+AMPA組各死亡1只，Sham組、Iso+ CNQX組無死亡。各組大鼠體質(zhì)量統(tǒng)計(jì)顯示，缺血缺氧前與缺血缺氧后7 d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表1。

表1 各組新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d體質(zhì)量比較（g±s）

表1 各組新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d體質(zhì)量比較（g±s）

組別n 7 d體質(zhì)量缺血缺氧前缺血缺氧后Sham組2014.18±0.2128.62±0.37 HI組1914.32±0.3528.95±0.30 Iso組1914.35±0.3228.70±0.47 Iso+AMPA組1914.40±0.4028.43±0.34 Iso+CNQX組2014.46±0.2628.66±0.37

2.2 左/右大腦半球質(zhì)量比比較 與Sham組比較，各組大鼠左/右大腦半球質(zhì)量比均顯著降低（P＜0.05）；與HI組比較，Iso組、Iso+CNQX組左/右大腦半球質(zhì)量比顯著升高（P均＜0.05），而Iso+AMPA組無明顯改變（P＞0.05）；與Iso組比較，Iso+CNQX組左/右大腦半球質(zhì)量比無明顯變化（P＞0.05），Iso+AMPA組左/右大腦半球質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠左/右大腦半球質(zhì)量及比值比較±s）

表2 各組大鼠左/右大腦半球質(zhì)量及比值比較±s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與HI組比較，△P＜0.05；與Iso組比較，○P＜0.05。

組別n左大腦半球質(zhì)量（g）左右大腦半球質(zhì)量比右大腦半球質(zhì)量（g）Sham組100.500±0.0140.492±0.0151.015±0.033 HI組90.370±0.036*0.498±0.0130.742±0.070*Iso組90.451±0.020*△0.494±0.0110.913±0.049*△Iso+AMPA組90.382±0.018*○0.490±0.0090.779±0.039*○Iso+CNQX組100.459±0.017*△0.496±0.0140.927±0.033*△

2.3 左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比比較

Sham組、HI組、Iso組、Iso+AMPA組、Iso+CNQX組左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比分別為0.970±0.021、0.599±0.020、0.759±0.021、0.594 ±0.011、0.765±0.028，與Sham組比較，各組大鼠左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比均顯著降低（P＜0.05）；與HI組比較，Iso組、Iso+CNQX組左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比顯著升高（P＜0.05），Iso+AMPA組無明顯升高或降低（P＞0.05）；與Iso組比較，Iso+CNQX組左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比無明顯改變（P＞0.05），而Iso+AMPA組左/右側(cè)海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元密度比明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

HIBD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無有效的臨床治療方法。本課題組前期研究結(jié)果顯示，在新生大鼠缺血缺氧性腦損傷后6 h內(nèi)，1.5%異氟醚后處理30 min，可以明顯減輕大鼠的腦損傷程度，證明異氟醚后處理對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷有腦保護(hù)作用。研究還從細(xì)胞能量代謝方面進(jìn)行探究，對(duì)缺血缺氧性腦損傷的新生大鼠給予了mPTP特異性抑制劑環(huán)孢素A，對(duì)缺血缺氧性腦損傷大鼠有保護(hù)作用，但并不與異氟醚后處理有疊加作用，而給予mPTP的特異性開放劑蒼術(shù)苷后可以逆轉(zhuǎn)異氟醚后處理的腦保護(hù)作用，證明異氟醚后處理可能是通過抑制mPTP的開放起到腦保護(hù)作用［13］。而細(xì)胞能量代謝紊亂與細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平異常有密切聯(lián)系，因此本實(shí)驗(yàn)研究了對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平起關(guān)鍵作用的AMPA受體。結(jié)果顯示，對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠給予異氟醚后處理可以起到腦保護(hù)作用，同時(shí)給予AMPA受體拮抗劑CNQX，與異氟醚后處理對(duì)大鼠的腦保護(hù)作用并無疊加作用，但給予興奮性神經(jīng)遞質(zhì)AMPA可以逆轉(zhuǎn)異氟醚后處理的腦保護(hù)作用。

目前研究普遍認(rèn)為，缺血缺氧時(shí)谷氨酸大量釋放而消除能力降低，細(xì)胞外谷氨酸濃度大幅度升高達(dá)到毒性水平，谷氨酸受體過度活化，Ca2+大量內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞腫脹凋亡，而這一過程主要由AMPA受體介導(dǎo)［14，15］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的CNQX為競(jìng)爭(zhēng)性拮抗AMPA受體，抑制AMPA受體的過度活化，穩(wěn)定其在突觸后膜的穩(wěn)定表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載從而起到腦保護(hù)作用。有文獻(xiàn)證明，單純對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠給予AMPA受體拮抗劑可降低腦細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)及過氧化物水平，減輕腦損傷程度［7］。而興奮性神經(jīng)遞質(zhì)AMPA則激動(dòng)AMPA受體，使其發(fā)生構(gòu)型的改變而造成損傷作用，亦有研究表明其可造成腦組織損傷［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)缺血缺氧性腦損傷的新生大鼠進(jìn)行異氟醚后處理可明顯改善腦損傷程度，缺血缺氧7 d時(shí)海馬CA1區(qū)左側(cè)正常神經(jīng)元數(shù)量明顯增加。而同時(shí)給予AMPA受體拮抗劑CNQX與異氟醚后處理，前者并未增強(qiáng)異氟醚后處理的保護(hù)作用，即二者并無疊加效應(yīng)。而給予興奮性神經(jīng)遞質(zhì)AMPA與異氟醚后處理，該組左側(cè)正常神經(jīng)元數(shù)量明顯低于異氟醚后處理組，表明AMPA逆轉(zhuǎn)了異氟醚后處理的腦保護(hù)作用。

綜上所述，異氟醚后處理對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷具有保護(hù)作用，其可能通過抑制AMPA受體的過度活化而發(fā)揮作用。

［1］Doi K，Sameshima H，Kodama Y，et al.Perinatal death and neurological damage as a sequential chain of poor outcome［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2012，25（6）：706-709.

［2］Clark SL，Hankins GDV.Temporal and demographic trends in cerebral palsy-fact and fiction［J］.Am J Obstet Gynecol，2003，188 （3）：628-633.

［3］Armstrong JS.The role of the mitochondrial permeability transition in cell death［J］.Mitechondrion，2006，6（5）：225-234.

［4］Galluzzi L，Morselli E，Kepp O，et al.Targeting post-mitochondrial effectors of apoptosis for neuroprotection［J］.Biochim Biophys Aeta，2009，1787（5）：402-413.

［5］BmugIlton BR，Reutens DC，Sobey CG.Apeptotic mechanisms after cerebral ischemia［J］.Stroke，2009，40（5）：e331-e339.

［6］Wang G，Gilbert J，Man HY.AMPA receptor trafficking in homeostatic synaptic plasticity；functional molecules and signaling cascades［J］.Neural Plast，2012，2012：825364.

［7］王麗雁，趙聰敏，張雨平.AMPA受體拮抗劑對(duì)新生鼠缺氧缺血性腦損傷自由基的影響［J］.中國臨床康復(fù)，2004，8（13）：2484-2485.

［8］Wang H，Luo M，Li C，et al.Propofol post-conditioning induced long-term neuroprotection and reduced internalization of AMPAR GluR2 subunit in a rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion ［J］.J Neurochem，2011，119：210-219.

［9］Zhao P，Ji G，Xue H，et al.Isoflurane postconditioning improved long-term neurological outcome possibly via inhibiting the mitochondrial permeability transition pore in neonatal rats after brain hypoxia-ischemia［J］.Neuroscience，2014，280：193-203.

［10］紀(jì)國余，薛航，于威威，等.異氟醚后處理對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠長期腦保護(hù)作用用及機(jī)制探討［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2014，54（26）：1-4.

［11］Al Rahi M，Hossain MA.Genetic Deletion of NP1 Prevents Hypoxic-Ischemic Neuronal Death Via Reducing AMPA Receptor Synaptic Localization in Hippocampal［J］.J Am Heart Assoc，2013，112：1-11.

［12］岳利峰，陳家旭，霍素坤，等.肝郁脾虛證大鼠雙側(cè)杏仁核注射CNQX后行為變化及逍遙散的調(diào)節(jié)作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（10）：2272-2275.

［13］紀(jì)國余，薛航，于威威，等.異氟醚后處理對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的影響［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2014，34（4）：466-469.

［14］Henley JM，Barker EA，Glebov OO.Routes，destinations and delays：recent advances in AMPA receptor trafficking［J］.Trends Neurosci，2011，34（5）：258-268.

［15］Isaac JT，Ashby MC，McBain CJ.The role of the gIuR2 subunit in AMPA receptor function and synaptic plasticity［J］.Neuron，2007，54（6）：859-871.

［16］岳利峰，王玲，奚勝艷.基于海馬CA1區(qū)微量注射AMPA對(duì)肝郁脾虛癥模型大鼠杏仁核BLA區(qū)陽性細(xì)胞的影響探討逍遙散的調(diào)節(jié)機(jī)制［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（11）：743-751.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.011

R651.15

A

1002-266X（2016）25-0036-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81171782）。

趙平（E-mail：zhaop@sj-hospital.org）

2015-12-20）