HLA-G1及Th17/Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子在B-ALL中的表達變化及其相關(guān)性分析

王欣玉，胡峻巖，2，金真伊，陳少華，楊力建，盧育洪，吳秀麗，李揚秋，（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣州5062；2廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院；暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院）

HLA-G1及Th17/Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子在B-ALL中的表達變化及其相關(guān)性分析

王欣玉1，胡峻巖1，2，金真伊1，陳少華1，楊力建1，盧育洪3，吳秀麗1，李揚秋1，3
（1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣州510632；2廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院；3暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院）

目的 觀察急性B淋巴細胞白血病（B-ALL）患者外周血中人白細胞抗原G1（HLA-G1）及Th17/Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的基因表達變化，并分析其相關(guān)性。方法 收集經(jīng)MICM分型確診的29例B-ALL患者外周血樣本，初發(fā)B-ALL 14例（初發(fā)組），復(fù)發(fā)難治的BALL 8例（復(fù)發(fā)組），完全緩解的B-ALL 7例（緩解組）；同時收集10例健康志愿者外周血樣本作為對照組。采用實時熒光定量PCR法檢測各組外周血中膜結(jié)合型HLA-G1及Th17/Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的mRNA相對表達水平。結(jié)果 初發(fā)組、復(fù)發(fā)組、緩解組、對照組膜結(jié)合型HLA-G1 mRNA相對表達水平分別為0.415%、0.565%、0.108%、0.110%，初發(fā)組、復(fù)發(fā)組與緩解組及對照組比較，P均＜0.05。初發(fā)組IL-17A、IL-23、t-bet和CD25基因表達水平顯著高于復(fù)發(fā)組（P均＜0.05）。初發(fā)組的FOXP3、IL-17A、IL-23、t-bet、GATA3和CD25基因表達水平亦顯著高于緩解組（P均＜0.05）；復(fù)發(fā)組、初發(fā)組、緩解組ROR-γ mRNA相對表達水平分別為2.777%、1.425%、0.089%，復(fù)發(fā)組與初發(fā)組、緩解組比較，P均＜0.05。初發(fā)組HLAG1 mRNA表達水平與IL-17A和FOXP3相對表達水平呈正相關(guān)（r分別為0.635、0.647；P均＜0.05），且HLA-G1 mRNA表達水平與IL-17A呈正相關(guān)（r=0.573，P＜0.05）。初發(fā)組HLA-G1 mRNA表達水平與IL-23、ROR-γ、RORα、t-bet、GATA-3、CD25表達水平無明顯相關(guān)關(guān)系（P均＞0.05）。復(fù)發(fā)組HLA-G1表達水平與各免疫相關(guān)調(diào)節(jié)分子均未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性（P均＞0.05）。緩解組HLA-G1表達水平與IL-17A和FOXP3表達水平呈負相關(guān)（r分別為-0.857、-0.785，P均＜0.05），而與其他免疫相關(guān)調(diào)節(jié)分子表達水平無顯著相關(guān)關(guān)系（P均＞0.05）。對照組HLA-G1表達水平與t-bet表達水平呈負相關(guān)（r=-0.665；P＜0.05），與其他免疫相關(guān)調(diào)節(jié)分子均未見顯著相關(guān)關(guān)系（P均＞0.05）。結(jié)論 初發(fā)及復(fù)發(fā)B-ALL患者外周血中膜結(jié)合型HLA-G1基因表達水平顯著升高，緩解后HLA-G1基因水平下降；且初發(fā)患者HLA-G1表達水平與IL-17A和FOXP3存在正相關(guān)關(guān)系，ROR-γ基因與復(fù)發(fā)BALL關(guān)系密切。HLA-G1和ROR-γ可能參與調(diào)節(jié)Th17/Tregs軸的平衡，影響B(tài)-ALL預(yù)后。

急性B淋巴細胞白血??；人白細胞抗原G1；調(diào)節(jié)性T細胞

急性B淋巴細胞白血?。˙-ALL）是一種具有異質(zhì)性的疾病，以原始、幼稚B淋巴細胞惡性克隆增殖為主要特征，患者的療效和預(yù)后存在明顯個體差異。探尋新的與B-ALL預(yù)后相關(guān)的靶基因?qū)τ谔接懓籽“邢蛑委熜虏呗院椭笇?dǎo)臨床分層治療有重要意義。人白細胞抗原G（HLA-G）屬于HLA-Ⅰb類分子，具有一定免疫調(diào)節(jié)作用［1］，其表達水平可能與慢性B淋巴細胞白血病預(yù)后相關(guān)，且其臨床敏感度較慢性B淋巴細胞白血病的獨立預(yù)后指標(biāo)CD38、ZETA相關(guān)蛋白ZAP-70更高［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在B-ALL患者中，高表達膜結(jié)合型HLA-G1基因組的B-ALL復(fù)發(fā)率高于低表達HLAG1基因組［3］。HLA-G影響白血病的預(yù)后可能與其能誘導(dǎo)生成新型的調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）［4］，從而影響TH17/Tregs軸平衡有關(guān)［1］，然而其具體免疫調(diào)節(jié)相關(guān)機制暫且不明確。2014年4月～2015年3月，我們定量分析了不同臨床狀態(tài)B-ALL患者外周血中HLA-G1及Th17/Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的基因表達水平及其相關(guān)性，初步探究B-ALL相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集經(jīng)MICM分型（細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)分型）確診的29 例B-ALL患者外周血樣本，其中男13例、女16例，年齡3～70歲，中位年齡27歲。初發(fā)B-ALL 14例（初發(fā)組），復(fù)發(fā)難治的B-ALL 8例（復(fù)發(fā)組），完全緩解的B-ALL 7例（緩解組）。同時收集10例健康志愿者外周血樣本作為對照組，男5例、女5例，年齡19～35歲，中位年齡27歲。研究樣本征得健康志愿者及患者的同意并簽署知情同意書，且本研究采樣通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 外周血單個核細胞（PBMNCs）分離、RNA提取和cDNA合成［5，6］采集B-ALL患者和健康志愿者外周靜脈血，采用Ficoll密度梯度離心法常規(guī)分離PBMNCs，以1×PBS重懸細胞并計數(shù)；應(yīng)用TRIzol試劑盒（Invitrogen，USA）提取mRNA，并應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（PowerScriptTM Reverse，BD，USA）合成cDNA。合成的cDNA經(jīng)RT-PCR檢測β2微球蛋白（β2M）管家基因的表達情況并確定其質(zhì)量。根據(jù)HLA-G1、FOXP3、IL-17A、IL-23、ROR-γ、RORα、tbet、GATA-3、CD25及β2M基因分別設(shè)計上下游引物。

1.3 HLA-G1基因和Th17/Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子在B-ALL患者外周血中的表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。以β2M基因作為內(nèi)參基因，采用RealMaster Mix試劑盒（Tiangen，北京），通過SYBR Green I染料法檢測PBMNCs中HLA-G1基因及Th17/Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的表達水平。反應(yīng)體系包括2.5×RealMaster Mix 10 μL、0.6 mmol/L上、下游引物及1 μL cDNA，總反應(yīng)體系為20 μL；每一標(biāo)本設(shè)2個復(fù)孔。反應(yīng)在CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，USA）中進行，反應(yīng)條件：95℃15 min，95℃30 s，60℃1 min，80℃讀板，共45個循環(huán)，隨后，以0.5℃/s變化速度從95℃到55℃每隔5 s記錄熒光值，最后獲得熔解曲線。樣本均重復(fù)檢測2次。采用相對定量法分析B-ALL患者和健康志愿者HLA-G1基因及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的mRNA相對表達水平，目的基因mRNA相對表達量= 2-Δ（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。兩樣本比較采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗，采用Pearson和Spearman相關(guān)分析法分析HLA-G基因與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子的相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血中HLA-G1基因和Th17/Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子的表達水平比較 初發(fā)組、復(fù)發(fā)組、緩解組、對照組膜結(jié)合型HLA-G1 mRNA相對表達水平（M）分別為0.415%、0.565%、0.108%、0.110%，初發(fā)組、復(fù)發(fā)組與緩解組及對照組比較，P均＜0.05；緩解組與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P= 0.96）。初發(fā)組IL-17A、IL-23、t-bet和CD25基因表達水平顯著高于復(fù)發(fā)組（P均＜0.05）。初發(fā)組的FOXP3、IL-17A、IL-23、t-bet、GATA3和CD25基因表達水平亦顯著高于緩解組（P均＜0.05）；復(fù)發(fā)組、初發(fā)組、緩解組ROR-γ mRNA相對表達水平（M）分別為2.777%、1.425%、0.089%，復(fù)發(fā)組與初發(fā)組、緩解組比較，P均＜0.05。復(fù)發(fā)組IL-17A、IL-23、GATA3和FOXP3 mRNA相對表達水平顯著高于緩解組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25 mRNA相對表達水平比較（M%）

2.2 HLA-G基因與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子的相關(guān)性分析 初發(fā)組HLA-G1 mRNA表達水平與IL-17A和FOXP3相對表達水平呈正相關(guān)（r分別為0.635、0.647，P均＜0.05），且HLA-G1 mRNA表達水平與IL-17A呈正相關(guān)（r=0.573，P＜0.05）。初發(fā)組HLA-G1 mRNA表達水平與IL-23、ROR-γ、RORα、tbet、GATA-3、CD25表達水平無明顯相關(guān)關(guān)系（P均＞0.05）。復(fù)發(fā)組HLA-G1表達水平與各免疫相關(guān)調(diào)節(jié)分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）均未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性（P均＞0.05）。緩解組HLA-G1表達水平與IL-17A和FOXP3表達水平呈負相關(guān)（r分別為-0.857、-0.785，P均＜0.05），而與其他免疫相關(guān)調(diào)節(jié)分子表達水平無顯著相關(guān)關(guān)系（P均＞0.05）。對照組HLA-G1表達水平與t-bet表達水平呈負相關(guān)（r=-0.665，P=0.035），與其他免疫相關(guān)調(diào)節(jié)分子FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23 和CD25均未見顯著相關(guān)關(guān)系（P均＞0.05）。

3 討論

HLA-G的初始轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過差異剪接，產(chǎn)生7種mRNA異構(gòu)體，分別編碼4種膜結(jié)合性抗原（HLAG1～G4）和3種三種可溶性抗原［4］。正常生理狀態(tài)下，HLA-G抗原主要限制表達于成人胸腺上皮、絨毛外滋養(yǎng)層細胞、胰島和胎盤等組織［1］，與機體免疫耐受有關(guān)。在病理狀態(tài)下，HLA-G抗原亦能表達于病毒感染［7］、炎癥反應(yīng)、器官移植術(shù)后等病理組織，并且可能在巨細胞病毒等病毒感染逃避機體免疫監(jiān)控中發(fā)揮重要作用。HLA-G與腫瘤免疫亦有密切相關(guān)性，在肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、乳腺癌及淋巴瘤等腫瘤組織中可見HLA-G抗原表達［8］。HLA-G可通過與表達在T細胞上的受體聯(lián)合而轉(zhuǎn)導(dǎo)負調(diào)控信號，幫助腫瘤細胞逃避機體CD8+T細胞和NK細胞的殺傷［9］，并有效地抑制CD4+T細胞的增殖。HLA-G還能抑制樹突狀細胞（DC）等抗原提呈細胞的成熟和活化，影響抗原提呈，阻礙未致敏T細胞的分化。此外，HLA-G能誘導(dǎo)T細胞分化成有免疫抑制功能的新型CD3+CD8low或CD3+CD4low調(diào)節(jié)性T細胞［1，4］，可能影響TH17/Tregs的平衡。

HLA-G能影響白血病的預(yù)后［2，3］，可能是通過誘導(dǎo)生成新型調(diào)節(jié)性T細胞［4］，從而影響TH17/ Tregs平衡［1］，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。然而其免疫調(diào)節(jié)相關(guān)機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)B-ALL外周血中HLA-G表達水平發(fā)生顯著變化，初發(fā)及復(fù)發(fā)BALL患者外周血中膜結(jié)合型HLA-G1基因表達水平顯著增高，緩解后HLA-G1基因水平下降；提示HLA-G1的異常高表達可能與B-ALL的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，B-ALL腫瘤細胞可能通過分泌HLA-G1分子，降低機體的免疫監(jiān)視功能，幫助腫瘤細胞進行免疫逃逸。

Th17細胞是由初始CD4+T細胞分化而來，在自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)性疾病、腫瘤及移植物抗宿主等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［10］。Treg細胞則是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，具有低反應(yīng)性和免疫抑制性，與腫瘤細胞免疫逃逸相關(guān)。Th17/Treg細胞間的平衡與疾病的轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［11］。因此，本研究中檢測了B-ALL中Th17/ Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)初發(fā)組IL-17A、IL-23、t-bet和CD25基因表達水平顯著高于復(fù)發(fā)組，初發(fā)組FOXP3、IL-17A、IL-23、t-bet、GATA3和CD25基因表達水平亦顯著高于緩解組，提示在初發(fā)B-ALL中，外周血T細胞激活增強，免疫調(diào)節(jié)分子的表達水平發(fā)生改變，可能引起相關(guān)的T細胞亞群如Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞的表達分布變化，并可能參與B-ALL的整個發(fā)病過程。在初發(fā)B-ALL中，HLA-G1表達水平與IL-17A和FOXP3表達水平呈正相關(guān)，且HLAG1與IL-17A呈正相關(guān)；而在緩解B-ALL中，HLAG1表達水平與IL-17A和FOXP3表達水平呈負相關(guān)。提示在B-ALL疾病發(fā)展過程中，HLA-G1可能通過影響Th17細胞和Treg細胞相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子的表達，從而調(diào)控Th17/Treg軸的譜系平衡，參與BALL的發(fā)生發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)B-ALL中ROR-γ基因的表達量顯著高于初發(fā)組和緩解組。由于ROR-γ是Th17細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th17細胞分化發(fā)育中起重要作用，復(fù)發(fā)B-ALL患者中ROR-γ基因表達量的增高，可能與Th17/Treg細胞比例失衡有關(guān)。監(jiān)測B-ALL患者的ROR-γ基因表達水平對于評價B-ALL的預(yù)后可能有潛在參考價值。

總之，本研究首先提供了初發(fā)、復(fù)發(fā)難治及完全緩解狀態(tài)的B-ALL外周血中HLA-G1及Th17/Tregs軸相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子的基因表達情況，為深入研究B-ALL中的免疫調(diào)控機制提供了基礎(chǔ)資料。

［1］Alegre E，Rizzo R，Bortolotti D，et al.Some basic aspects of HLA-G biology［J］.J Immunol Res，2014，2014：657625.

［2］Attia MA，Nosair NA，Gawally A，et al.HLA-G expression as a prognostic indicator in B-cell chronic lymphocytic leukemia［J］. Acta Haematol，2014，132（1）：53-58.

［3］Liu H，Chen Y，Xuan L，et al.Soluble human leukocyte antigen G molecule expression in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation：good predictor of acute graft-versus-host disease［J］. Acta Haematol，2013，130（3）：160-168.

［4］Amodio G，Sales De Albuquerque R，Gregori S.New insights into HLA-G mediated tolerance［J］.Tissue Antigens，2014，84（3）：255-263.

［5］胡峻巖，吳秀麗，陳少華，等.B-ALL患者外周血γδT細胞TCR亞家族譜系分布和增殖特點［J］.免疫學(xué)雜志，2013，29（2）：147-151.

［6］Zheng H，Wang X，Ma Y，et al.The TCR gammadelta repertoire and relative gene expression characteristics of T-ALL cases with biclonal malignant Vdelta1 and Vdelta2 T cells［J］.DNA Cell Biol，2014，33（1）：49-56.

［7］Morandi F，Rouas-Freiss N，Pistoia V.The emerging role of soluble HLA-G in the control of chemotaxis［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2014，25（3）：327-335.

［8］Curigliano G，Criscitiello C，Gelao L，et al.Molecular pathways：human leukocyte antigen G（HLA-G）［J］.Clin Cancer Res，2013，19（20）：5564-5571.

［9］尚書恒.非小細胞肺癌組織中人類白細胞抗原G的表達變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2015，55（2）：87-88.

［10］李嬋，吳鐵軍.Treg/Th17細胞亞群與子癇前期關(guān)系的研究進展［J］.山東醫(yī)藥，2016，56（4）：100-102.

［11］Lad DP，Varma S，Varma N，et al.Regulatory T-cell and T-helper 17 balance in chronic lymphocytic leukemia progression and autoimmune cytopenias［J］.Leuk Lymphoma，2015，56（8）：2424-2428.

Expression and correlation of HLA-G1 and Th17/Tregs axis associated regulatory factors in B-ALL

WANG Xinyu1，HU Junyan，JIN Zhenyi，CHEN Shaohua，YANG Lijian，LU Yuhong，WU Xiuli，LI Yangqiu
（1 Institute of Hematology，Medical College of Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Objective To investigate the expression changes of human leukocyte antigen-G1（HLA-G1）and Th17/ Tregs axis associated regulatory factors（FOXP3，IL-17A，IL-23，ROR-γ，RORα，t-bet，GATA-3 and CD25）in peripheral blood from adult patients with B-cell acute lymphocytic leukemia（B-ALL）and its correlation.Methods The mRNA expression levels of HLA-G and Th17/Tregs axis associated regulatory factors（FOXP3，IL-17A，IL-23，ROR-γ，RORα，t-bet，GATA-3 and CD25）were detected in peripheral blood from 29 cases of MICM type-confirmed patients with B-ALL，including 14 cases of primary patients（primary group），8 cases of patients with refractory relapse B-ALL（recurrence group）and 7 cases of patients with complete remission（CR）（remission group）by real-time quantification RT-PCR. Meanwhile，10 healthy individuals（HI）were selected as the control group.Results The expression levels of HLA-G1gene in the primary group，recurrence group，remission group and control group were 0.415%，0.565%，0.108%and 0.110%，respectively.Significant differences were found among the primary group，recurrence group，remission group and control group（all P＜0.05）.The expression levels of IL-17A，IL-23，t-bet and CD25 genes in the primary group were significantly higher than those of the recurrence group（all P＜0.05）.The expression levels of FOXP3，IL-17A，IL-23，tbet，GATA-3 and CD25 genes in the primary group were also significantly higher than those of the remission group（all P＜0.05）.The expression levels of ROR-γ mRNA in the recurrence group，primary group and remission group were 2.777%，1.425%and 0.089%，respectively（all P＜0.05）.The mRNA expression of HLA-G1 was positively correlated with IL-17A and FOXP3 in the primary group（r=0.635，0.647，respectively；all P＜0.05），and meanwhile，the mRNA expression of HLA-G1 was positively correlated with IL-17A（rs=0.573，P＜0.05）.No statistically significant correlation was found between the expression levels of HLA-G1 and IL-23，ROR-γ，RORα，t-bet，GATA-3 and CD25 in the primary group（all P＞0.05）.In the recurrence group，no statistically significant correlation was found between the HLA-G1 expression and Th17/Tregs axis associated regulatory factors（FOXP3，IL-17A，IL-23，ROR-γ，RORα，t-bet，GATA-3 and CD25）（all P＞0.05）.In the remission group，a negative correlation was found between the HLA-G1 expression and IL-17A（r=-0.857，P＜0.05）or HLA-G1 and FOXP3（r=-0.785，P＜0.05）.In the control group，the HLA-G1 expression was negatively correlated with t-bet（r=-0.665，P=0.035），but was not related with the other regulatory molecules（all P＞0.05）.Conclusions HLA-G expression increases in untreated and refractory relapse B-ALL patients and decreases after CR.A positive correlation is found between the HLA-G1 expression and IL-17A，HLA-G1 and FOXP3 in the primary B-ALL patients.In the Th17/Tregs axis associated regulatory factors，ROR-γ gene is closely related with the recurrence of B-ALL.HLA-G1 and ROR-γ gene may influence the balance of Th17/Tregs and further affect the prognosis of B-ALL.

B-cell acute lymphocytic leukemia；human leukocyte antigen-G1；regulatory T cells

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.007

R733.7

A

1002-266X（2016）25-0024-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（81570143）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項目（B2013183）。

王欣玉（1990-），女，醫(yī)師，碩士研究生，主要研究方向為血液腫瘤免疫。E-mail：xiaote007@qq.com

簡介：吳秀麗（1978-），女，副研究員，博士，主要研究方向為血液腫瘤免疫。E-mail：siulier@163.com

2016-03-02）