LC-MS/MS法測定小鼠腦組織中色氨酸及其3種代謝物

田　歡,翟俊樂,李孟秋,劉新民,?！＄?潘瑞樂,張澤生,廖永紅,*

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457;2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所,北京 100193)

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LC-MS/MS法測定小鼠腦組織中色氨酸及其3種代謝物

田歡1,2,翟俊樂1,2,李孟秋1,2,劉新民2,常琪2,潘瑞樂2,張澤生1,*,廖永紅2,*

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457;2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所,北京 100193)

目的:建立檢測小鼠腦組織中色氨酸、5-羥基色氨酸、5-羥色胺和5-羥基吲哚乙酸含量的LC-MS/MS分析方法。方法:采用 TSK Gel amide 80(2.0 mm×15 cm,3 μm)色譜柱,柱溫35 ℃,乙腈:甲酸銨水溶液(15 mmol·L-1,pH5.5)(40∶60,v/v)為流動相,流速0.4 mL·min-1,采用正離子多反應監(jiān)測(MRM)模式進行掃描。結果:4種待測物均在5 min內完成測定,色氨酸、5-羥基色氨酸、5-羥色胺和5-羥基吲哚乙酸最低定量限分別為0.2、0.1、0.2、0.2 ng·mL-1,最低檢測限分別為0.05、0.02、0.05、0.05 ng·mL-1,在1～500 ng·mL-1濃度范圍內線性關系均良好,方法的精密度和加樣回收率均符合生物樣品的分析要求。將該方法應用于口服萱草花總黃酮的小鼠腦提取物檢測后發(fā)現(xiàn):腦內四種待測物濃度明顯發(fā)生改變,且變化規(guī)律與陽性藥物帕羅西汀相同。結論:本方法簡便、準確、靈敏度高,專屬性強,重復性好,適用于腦組織中色氨酸-五羥色胺代謝過程中的4種成分的測定,可應用于神經精神類藥物的藥理作用機制研究。

液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用,色氨酸,代謝產物,小鼠腦組織,萱草花總黃酮

抑郁癥是嚴重威脅人類健康的常見疾病,在各類精神疾病中發(fā)病率最高[1]。抑郁癥的發(fā)病機制目前不十分清楚,5-羥色胺(5-HT)缺乏是導致抑郁癥發(fā)病的可能原因之一。5-羥色胺是色氨酸(TRP)的代謝中間產物,其代謝途徑如圖1所示。色氨酸代謝途徑(5-羥色胺通路)[2-3]為色氨酸(TRP)經色氨酸羥化酶生成5-羥基色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP),進一步脫羧生成5-羥色胺,最終代謝生成5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)。TRP水平降低可使5-HT的生成減少,引起情緒失調、抑郁及認知功能障礙等[4-5]。截止目前,色氨酸及其代謝路徑中間產物同時被檢測的分析技術未見報道,該檢測技術的建立是全面探知抑郁癥發(fā)病機制的技術保障。另外,現(xiàn)代藥理學證明萱草花提取物具有鎮(zhèn)靜[6-8]、抗抑郁[9]作用,并提出萱草花抗抑郁作用可能與其中黃酮類物質有關。本文采用液相色譜與電噴霧離子阱串聯(lián)質譜(Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Mass/Mass,LC-ESI-MS/MS)聯(lián)用技術[10-12],建立了小鼠腦中色氨酸代謝途徑(包括5-羥色胺)的快速分析的方法。通過對小鼠腦內4種待測物的檢測說明,該方法可方便、快捷、準確地實現(xiàn)代謝過程的監(jiān)控。并用建立的分析方法檢測了小鼠口服萱草花總黃酮對急性抑郁模型腦組織中四種待測物變化的規(guī)律。

圖1　色氨酸的代謝途徑Fig.1　Catabolic pathways of TRP

1　材料與方法

1.1材料與儀器

萱草花采自湖南省衡陽市祁東縣,萱草花總黃酮提取物由廖永紅實驗室提取、純化、濃縮,貯存于4 ℃冰箱中備用;帕羅西汀購自中國食品藥品檢定研究所(產品批號010-67095219);TRP、5-HT、5-HIAA、3,4-二羥基芐胺(DHBA,內標)對照品均購自美國Sigma公司(產品批號分別為101451968,028K1582,1413645和0703232);5-HTP對照品購自北京壇墨質檢科技有限公司(產品批號為20140903);甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

SPF級ICR雄性健康小鼠60只,體重(20±2)g,購自北京維通利華實驗動物公司。實驗喂養(yǎng)于實驗動物房,自由供給標準飼料[13]和清潔飲用水,光照12 h:12 h(光:暗),室溫22～25 ℃,許可證號SCXK(京)2012-0001。

1200型液相色譜系統(tǒng)美國Agilent公司;Q-Trap 5500型串聯(lián)四級桿-離子阱質譜分析儀美國Applied Biosystems公司;Sorvall Legend Micro 17R微量離心機美國Thermo公司;CPA225D十萬分之一電子天平德國sartorius公司;Vibra-Cell型超聲波破碎儀美國Sonics公司;Vibra-Cell型超聲波破碎儀美國Sonics公司。

1.2實驗方法

1.2.1色譜條件TSK Gel amide 80色譜柱(2.0 mm×15 cm,3 μm);柱溫35 ℃;乙腈:甲酸銨水溶液(15 mmol·L-1,pH=5.5)(40∶60,v/v)為流動相;流速0.4 mL·min-1;進樣量5 μL[14]。

1.2.2質譜條件質譜檢測器采用電噴霧方式進行離子化,采用正離子化方式,以多重反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式進行掃描,離子源及其他相關參數(shù)優(yōu)化為噴霧電壓5500 V,離子源加熱溫度500 ℃,Gas1為50 Psi,Gas2為70 Psi,其他參數(shù)見表 1。

表1　檢測離子對及質譜離子化條件

1.2.3對照品溶液的配制精密稱取四種檢測物對照品各2.0 mg,分別用含0.2%甲酸的甲醇-水(1∶1,v/v,下同)溶解配制成1 mg·mL-1的對照品儲備液,于-20 ℃冰箱備用。同法配制0.3 mg·mL-1的 DHBA內標溶液。分別精密吸取四種檢測物對照品儲備液各40 μL,加含0.2%甲酸的甲醇-水至2 mL,混勻配制成20 μg·mL-1的混合對照品溶液,分別用含0.2%甲酸的甲醇-水稀釋配制濃度分別為1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2和0.1 ng·mL-1的系列標準曲線混合液。對照品溶液均在每次用前新鮮配制。高、中、低質量控制樣品通過添加適量對照品儲備液到已測濃度的空白腦勻漿液中,然后分別稀釋到5、50、500 ng·mL-1三個濃度。

表2　TRP、5-HTP、5-HT和5-HIAA的標準曲線和線性范圍(n=5)

1.2.4供試品溶液的制備小鼠斷頭處死,冰臺上立即取腦,放于冰冷的生理鹽水中漂洗,用濾紙吸干水分后精密稱重(精確至0.01 mg),加入0.3 mL生理鹽水,在冰浴中超聲勻漿得腦勻漿液。取腦勻漿液0.2 mL,加入冰冷乙腈0.6 mL沉淀蛋白,混勻后于4 ℃放置30 min,于4 ℃離心(12000 r·min-1)5 min,取上清液,每200 μL上清液中加入內標液(0.3 mg·mL-1DHBA)20 μL,混勻后精密吸取50 μL進行LC-MS/MS分析。

1.2.5標準曲線及線性范圍取1.2.3項下各混合對照品溶液200 μL,分別加入0.3 mg·mL-1內標液 20 μL,混勻后取50 μL進行LC-MS/MS分析,以各檢測物的質量濃度為橫坐標,被測物與內標峰面積比為縱坐標,進行線性回歸,得到標準曲線。

1.2.6精密度日內精密度(intra-day precision):同一組織勻漿液配制成5、50、500 ng·mL-1高、中、低3個濃度的混合對照品溶液,以及配制加入相同量空白溶劑的空白腦組織液,分別精密吸取50 μL進行LC-MS/MS 分析,每個樣品重復進樣5次,計算TRP,5-HT,5-HTP,5-HIAA濃度的RSD為日內精密度。

日間精密度(inter-day precision):同一組織勻漿液配制成5、50、500 ng·mL-1高、中、低3個濃度的混合對照品溶液,以及配制加入相同量空白溶劑的空白腦組織液分別精密吸取 50 μL進行 LC-MS/MS 分析,于1、2、3 d進樣,每天連續(xù)進樣 3次,計算 TRP,5-HT,5-HTP,5-HIAA濃度的RSD為日間精密度。

1.2.7加樣回收率取腦組織勻漿液,作為回收率實驗用樣品,測定5次,求出勻漿中各物質平均含量作為基準值,隨后分別加入5、50、500 ng·mL-1高、中、低3個濃度的混合對照品溶液,各取5份,進行LC-MS/MS 分析,得到加樣回收率。

1.2.8穩(wěn)定性考察了四種對照質控樣品在不同溫度和貯存條件下穩(wěn)定性。取腦組織勻漿液,配制成5、50、500 ng·mL-1高、中、低3個濃度的混合對照質控樣品溶液,分別在室溫下放置8 h、-20 ℃凍融三個循環(huán)和-80 ℃放置30 d后,各進行三次LC-MS/MS分析測定樣品中四種待測物的含量。穩(wěn)定性用最終測定值與初始測定值的比值來表達。

1.2.9動物樣品中含量的測定小鼠適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為5組,每組12只,分別為空白對照組、陽性對照組和3個不同劑量的萱草花總黃酮提取物[15-16]組(22.5,45.0和90.0 mg·kg-1,以生藥量計),構建小鼠急性抑郁模型?？瞻讓φ战M的小鼠每天灌胃給予飲用水,陽性對照組小鼠灌胃給予帕羅西汀(10 mg·kg-1),3個給藥組小鼠灌胃萱草花總黃酮提取物,每天灌胃1次,連續(xù)15 d。于第16 d,頸椎脫臼處死,取全腦,按1.2.4項下方法處理和分析樣品,計算腦組織中四種檢測物的含量。

2　結果與分析

2.1方法學考察

2.1.1專屬性按“供試品溶液的制備”項下操作時不加入腦組織,分別制備空白對照,以及加入對照品溶液而制得的標準品對照。比較空白對照(A)、標準品對照(B)與腦組織樣品(C)三者的提取離子流色譜圖,結果表明腦組織中的內源性成分不干擾TRP,5-HT,5-HTP,5-HIAA的測定。

2.1.2標準曲線及線性范圍按照1.2.1項和1.2.2項色譜和質譜條件,以標準品峰面積對濃度進行回歸,結果見表2。按2.1.3項下方法配制 100 ng·mL-1的混合對照品溶液,用含0.2%甲酸的甲醇-水不斷稀釋,信噪比(S/N)為10∶1為最低定量限,信噪比(S/N)為3∶1是最低檢測限,發(fā)現(xiàn)各待檢物質的定量限介于0.1～0.2 ng·mL-1,達到生物樣品液質檢測的要求。

2.1.3精密度精密度結果見表3。四種檢測物日內、日間精密度的RSD均小于7%,符合生物樣品分析的要求[17]。

表3　TRP、5-HTP、5-HT和5-HIAA的精密度(n=5)

表4　TRP、5-HTP、5-HT和5-HIAA的加樣回收率(n=5)

表5　TRP、5-HTP、5-HT和5-HIAA的穩(wěn)定性(n=5)

2.1.4加樣回收率加樣回收率結果見表4。加樣回收率在88.8%～105%之間,說明該前處理方法適用于生物樣品的測定。

2.1.5穩(wěn)定性穩(wěn)定性結果表明室溫條件下放置8 h、-20 ℃凍融三個循環(huán)和-80 ℃放置30 d內生物樣品穩(wěn)定性較好,無明顯降解。

2.2動物樣品中含量的測定

帕羅西汀是一種苯基哌啶類衍生物[18-20],是一種具有良好耐受性的抗抑郁藥物,它可以從消化道被很好地吸收且不受進食的影響,能迅速提高5-HT神經突觸間隙的5-HT濃度,其作用與抑制5-HT轉運體,使5-HT的清除減低有關。腦組織中四種檢測物的含量見圖2,結果發(fā)現(xiàn)口服給予小鼠萱草花總黃酮提取物后,小鼠腦內四種檢測物明顯發(fā)生改變,且變化規(guī)律與陽性藥物帕羅西汀相同,說明萱草花黃酮提取物有較顯著的抗抑郁作用。

圖2　口服給予萱草花總黃酮提取物后小鼠腦內4種檢測物的變化(mean±SD,n=12)Fig.3　Changes of four analyses in mouse brainsafter oral administration of Hemerocallis Total Flavonoids Extract(mean±SD,n=12)注:與空白組比較 *p<0. 05,**p<0. 01。

3　結論

液液相色譜-串聯(lián)質譜方法為近年來發(fā)展較快的分析手段,特別是在體內樣品分析中。本研究建立了可同時測定腦組織樣品中色氨酸3種代謝產物(包括5-HTP,5-HT和5-HIAA)的 LC-MS/MS 分析方法,實現(xiàn)了色氨酸五羥色胺代謝途徑產物的同時測定。本方法中4種分析物性關系較好,方法回收率高,穩(wěn)定性良好,且樣品需要量小、操作簡單。本研究利用液質聯(lián)用的優(yōu)勢,分別優(yōu)化液相條件和質譜條件,選擇合適的電離模式,對質譜參數(shù)中的母離子、子離子進行了摸索,對裂解能量和碰撞能量進行了優(yōu)化,最終實現(xiàn)對多種氨基酸的分離提取及確證,實現(xiàn)了它們的定性與定量分析。

5-HT是調節(jié)情緒,抗抑郁的重要神經遞質,其水平的降低與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展有密切關系。所以監(jiān)測抑郁癥患者TRP及其主要代謝產物的變化,可以從整體上了解患者TRP代謝狀況,對病情發(fā)展及預防有一定的幫助,而且可以對治療患者的療效進行觀察,從而指導臨床用藥。研究中萱草花總黃酮提取物按22.5,45.0,90.0 mg·kg-1,給藥劑量組與空白組相比,TRP,5-HTP,5-HT,5-HIAA含量均明顯升高,萱草花總黃酮提取物具有一定的抗抑郁作用,其抗抑郁的作用機理可能與增加5-HT的含量有關,調節(jié)色氨酸-五羥色胺代謝來達到抗抑郁的效果,這可能是實現(xiàn)抗抑郁作用機制之一。

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Determination of Tryptophan and its three metabolites in mice brain tissue by LC-MS/MS

TIAN Huan1,2,ZHAI Jun-le1,2,LI Meng-qiu1,2,LIU Xin-min2,CHANG Qi2,PAN Rui-le2,ZHANG Ze-sheng1,*,LIAO Yong-hong2,*

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking UnionMedical College,Beijing 100193,China)

Objective:To establish a LC-MS/MS method for the determination of tryptophan(TRP)5-hydroxy-tryptophan(5-HTP),5-hydroxytryptamine(5-HT)and 5-hydroxyindole acetic acid(5-HIAA)in mouse brain tissues. Method:Chromatographic separation was performed on a TSK Gel amide 80 column(2.0 mm×15 cm,3 μm)at column temperature of 35 ℃. The mobile phase system was a mixture of acetonitrile-ammonium formate solution(15 mmol·L-1,pH=5.5)(40∶60)whereas the flow rate was set at 0.4 mL·min-1. The instrument was operated under the multiple reaction monitoring(MRM)mode using electrospray ionization(ESI)in the positive ion mode. Results:Four analyses were separated within 5 minutes. The lowest limits of quantification in tryptophan(TRP)5-hydroxy-tryptophan(5-HTP),5-hydroxytryptamine(5-HT)and 5-hydroxyindole acetic acid(5-HIAA)were 0.2,0.1,0.2 ng·mL-1and 0.2 ng·mL-1,respectively. The minimum detection limit were 0.05,0.02,0.05 ng·mL-1and 0.05 ng·mL-1,respectively. A good linear relationship was achieved within the concentration ranges from 1 to 500 ng·mL-1for the analyses. Precision and recovery of this method are in line with the requirements of biological sample analysis. The method was applied to determine the concentrations of four analyses in brain after oral administration of Hemerocallis flavonoid extract and results showed that four kinds of analyses were significantly changed which was similar with the positive drug of paroxetine. Conclusion:This method is simple,accurate,highly sensitive,strongly,specific and repeatable which indicated that is suitable for the determination of four metabolites of tryptophan-5-HT metabolic pathways in mice. This method could be used to the pharmacological mechanism of the neuropsychiatric drugs.

LC-MS/MS;tryptophan;metabolites;brain tissue of mice;Hemerocallis flavonoid

2015-05-15

田歡(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：m18634330761@163.com。

張澤生(1956-)，男，博士研究生，教授，研究方向：食品添加劑與功能配料，E-mail：zhangzesheng@tust.edu.cn。

廖永紅(1969-)，男，博士研究生，研究員，研究方向：新型給藥系統(tǒng)、新型生物相容聚合物材料及腫瘤靶向給藥、神經精神性天然藥物生物藥劑學等研究方向，E-mail：yhliao@implad.ac.cn。

重大新藥創(chuàng)制(航天應激所致認知功能損傷防治新型化合物DS的成藥性研究，2012ZX09J12110-04C)。

TS201.7

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000