應用固定化醋酸菌生產(chǎn)番木瓜果醋的研究

蘭維杰,陳琴媛,劉繼,葉昕軼,何靖柳,郭元照,秦文,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院,四川雅安 625014;2.成都市農(nóng)林科學院,四川成都 610000)

?

應用固定化醋酸菌生產(chǎn)番木瓜果醋的研究

蘭維杰1,陳琴媛1,劉繼2,葉昕軼1,何靖柳1,郭元照1,秦文1,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院,四川雅安 625014;2.成都市農(nóng)林科學院,四川成都 610000)

以番木瓜為原料,用3%海藻酸鈉與0.05 mol/L氯化鈣對醋酸菌進行固定,并以正交實驗方法對固定化醋酸菌釀造木瓜果醋的醋酸發(fā)酵工藝進行了研究。結果表明,固定化醋酸菌釀造木瓜果醋的較適工藝參數(shù)為初始pH5.0、溫度32.5 ℃、接種量13%、初始酒度8%,最終酸度達到4.78 g/100 mL;與游離醋酸菌發(fā)酵木瓜果醋對比,固定化方法發(fā)酵具有較高的產(chǎn)酸速率;在批次發(fā)酵木瓜醋的實驗中,最短只需要24 h,木瓜果醋酸度即達到4.40 g/100 mL,連續(xù)發(fā)酵10個批次,產(chǎn)酸率基本保持在0.40 g/L·h左右。

木瓜,果醋,固定化醋酸菌,醋酸發(fā)酵

番木瓜(Carica papaya L.)是一種熱帶常綠果樹,為番木瓜科番木瓜屬多年生肉質草本植物[1],又名乳瓜、石瓜、萬壽果、番瓜、木冬瓜、木瓜、蓮生果[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學證明:番木瓜果實含木瓜堿、木瓜蛋白、凝乳、胡蘿卜素等。其中所含的齊墩果酸是一種具有護肝降壓、抗炎抑菌、降低血脂等功效的化合物[3]。熟番木瓜果肉呈黃色或紅色,黃色果肉主要含胡蘿卜素,紅色果肉主要含番茄紅素,均具有卓越的保健功效和重要的食用價值與工業(yè)價值[4]。早在2000年,夏杏洲等[5]人就用成熟番木瓜為主要原料,經(jīng)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵生產(chǎn)果醋;2013年,王宇鴻等[6]人以番木瓜、芒果為原料,釀制出番木瓜芒果復合果醋。本實驗采用的實驗材料是番木瓜新品種——穗中紅[7]。

固定化細胞發(fā)酵法易于實現(xiàn)生產(chǎn)的連續(xù)化和提高產(chǎn)品質量的穩(wěn)定性,已被廣泛應用于工業(yè)及藥物等領域[8]。但目前國內(nèi)尚未見到此法生產(chǎn)木瓜果醋的研究報道。海藻酸鹽是一種廣泛應用的固定化介質,具有化學穩(wěn)定性好、無毒、包埋效率高且價格低廉等優(yōu)點[9]。本研究以番木瓜為原料,選用優(yōu)良的醋酸菌,采用海藻酸鈉包埋法按液態(tài)法釀造工藝進行固定化醋酸菌發(fā)酵,以期為木瓜果醋的生產(chǎn)提供可靠的技術依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

番木瓜(Carica Papaya L.)穗中紅,原產(chǎn)廣東省,收購于攀枝花;巴氏醋酸桿菌巴氏亞種(Acetobacter pasteurianus subsp. Pasteurianus)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供,CICC編號:7005;海藻酸鈉、氯化鈣、氫氧化鈉、酵母膏均為分析純;醋酸菌液體培養(yǎng)基葡萄糖100.0 g,酵母提取物10.0 g,碳酸鈣20.0 g,蒸餾水1000 mL,pH=6.8;固定化醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基自行釀制木瓜果酒。

LDZX-40AI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海三申醫(yī)療核子儀器廠;SW-CJ-1F潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司;OLYMPUS顯微鏡OLYMPUS;PB-2B pH計SARTORIUS;DHG-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;B4i-BR4i冷凍離心機BR4i multifunction,Thermo;酒精計。

1.2實驗方法

1.2.1番木瓜果醋的釀制技術路線如圖1所示。

圖1　技術路線Fig.1　The technical route

1.2.2番木瓜果酒的制備取原料木瓜,除殘果去核,榨汁,接種0.6%釀酒酵母,用蔗糖調(diào)整可溶性固形物為16°Brix,用檸檬酸鈉調(diào)節(jié)pH=3,28 ℃靜置發(fā)酵,測定木瓜果酒的酸度0.204 g/100 mL,可溶性固形物5.1°Brix,pH3.6,酒精度10%(v/v)。

1.2.3固定化醋酸菌的制備取等量的菌懸液和3%海藻酸鈉溶液混合均勻后,用一次性注射器將混合液滴入0.05 mol/L氯化鈣溶液中造粒,于4 ℃條件下在氯化鈣溶液中保存過夜備用[10]。固定化顆粒性質見表1。

表1　固定化顆粒的性質

1.2.4醋酸發(fā)酵的單因素實驗每個實驗號取100 mL木瓜果酒放入300 mL錐形瓶中進行振蕩發(fā)酵,每天取樣測定發(fā)酵液的總酸,至酸度不變,以發(fā)酵結束時的酸度為指標確定單因素的最佳水平。每組三個重復。

1.2.4.1初始酒精度對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響加水稀釋分別調(diào)整初始酒精度(v/v)為5%、6%、7%、8%、9%,調(diào)初始pH為4.5,再分別接入15%固定化醋酸菌粒子,31 ℃搖床發(fā)酵。

1.2.4.2接種量對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響將木瓜酒液的酒精度調(diào)整為7%,調(diào)初始pH為4.5,分別接種固定化醋酸菌(w/v)5%、10%、15%、20%、25%,31 ℃搖床發(fā)酵。

1.2.4.3初始pH對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響將木瓜酒液的酒精度調(diào)整為7%,接種量為15%,用氫氧化鈉分別調(diào)整pH為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5,31 ℃搖床發(fā)酵。

1.2.3.4溫度對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響調(diào)整木瓜果酒初始酒精度為7%,接種量為15%,調(diào)初始pH為4.5,分別在25、28、31、34、37 ℃下?lián)u床發(fā)酵。

1.2.3.5醋酸發(fā)酵正交實驗在單因素實驗的基礎上,進行正交實驗L9(34),研究酒精度、接種量、初始pH、溫度對木瓜果醋發(fā)酵的影響,正交實驗因素水平見表2。以第3 d的最終酸度(g/100 mL)為測定指標來確定醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件。每個實驗號取木瓜果酒100 mL。

表2　正交實驗因素水平表

1.2.4澄清處理以6 g/L殼聚糖為澄清劑,搖勻,于25 ℃的條件下靜置24 h后,取上清液測定透光率[11-12]。

1.2.5游離與固定化醋酸菌釀造木瓜果醋的比較按13%(w/v)的接種量取兩份菌懸液,一份進行固定化,用于固定化發(fā)酵,另一份用于游離醋酸菌發(fā)酵。無菌操作下將兩份醋酸菌分別移入100 mL初始酒度為7.5%、pH4.5的木瓜果酒中,置于32.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)(220 r/min),發(fā)酵7 d,每天測定酸度。以最終酸度及產(chǎn)酸率比較固定化醋酸菌與游離醋酸菌的發(fā)酵性能。

1.2.6固定化醋酸菌連續(xù)發(fā)酵實驗取13%(w/v)固定化醋酸菌放入500 mL三角瓶中,加120 mL木瓜果酒(8% vol),32.5 ℃搖床發(fā)酵(220 r/min)。每天測定酸度,當酸度達到4.5 g/100 mL左右時,取出60 mL的醋酸發(fā)酵液,然后再流加60 mL的酒液(8%vol),連續(xù)10個批次。

1.3測定方法

1.3.1固定化顆粒包埋量的測定取固定化顆粒10顆,用pH5.0的檸檬酸緩沖液溶解后再用平板計數(shù),最后折算為每個粒子的包埋量[13]。

1.3.2固定化顆粒滲漏量的測定將固定化顆粒培養(yǎng)24 h,用平板計數(shù)法計數(shù)發(fā)酵液中的細胞數(shù),用發(fā)酵液中的細胞濃度表示固定化細胞的滲漏量[14]。

1.3.3固定化顆粒機械強度的測定挑選3個大小均勻的固定化顆粒,放在水平玻片上,用50 g砝碼加壓60 s,用游標卡尺分別測定顆粒加壓前后的直徑,結果取平均值。以顆粒加壓后與加壓前直徑比來表示機械強度[15]。

1.3.4產(chǎn)酸速率的測定根據(jù)發(fā)酵前和發(fā)酵后的總酸,計算產(chǎn)酸速率[16]

式中:X為產(chǎn)酸率,g/L·h;X1為發(fā)酵后總酸含量(以醋酸計),g/100 mL;X2為發(fā)酵前總酸含量(以醋酸計),g/100 mL;h為發(fā)酵時間,h。

1.3.5理化指標的測定pH用pH計進行測定,可溶性固形物測定采用手持折光儀(°Brix)進行測定[12],根據(jù)GB/T 12456-2008酸堿中和法測定總酸、GB/T 11856-2008蒸餾法測定酒精度和考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質。

1.4數(shù)據(jù)分析方法

利用Origin、SPSS(數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件)和Excel對實驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2　結果與分析

2.1單因素結果與分析

2.1.1初始酒精度對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響由圖2可知,酒精度為7%的處理組酸度顯著高于5%和6%,這主要是由于酒精是醋酸發(fā)酵的底物,在一定底物濃度范圍內(nèi),發(fā)酵酸度隨底物濃度的增高而增大。5%、6%、7%、8%、9%酒精度的各處理達到最大酸度值的時間分別為3、3、3、6、6 d,這主要是由于過高的酒精度對醋酸菌的生長繁殖有抑制作用,導致產(chǎn)酸速率較低。酒精度為7%的處理組能夠在較短時間內(nèi)達到較高的酸度,因此,該酒精度較適合于固定化醋酸菌醋酸發(fā)酵。

圖2　初始酒精度對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響Fig.2　Effect of initial alcohol degree on acetic acid fermentation

2.1.2接種量對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響由圖3可知,接種量為15%的處理組酸度顯著大于其他處理組,接種量25%的處理組酸度顯著小于其他處理組,這可能是由于接種量過少時初期菌體量不夠,產(chǎn)酸能力較弱;接種量過大,菌體生長繁殖消耗了過多底物,導致產(chǎn)酸速率和最終酸度較低。其中5%、10%、15%、20%、25%接種量的各處理達到最大酸度值的時間分別為5、5、3、5、3 d。因此接種量為15%的處理組能夠在較短時間內(nèi)達到較高的酸度,該接種量較適合于固定化醋酸菌醋酸發(fā)酵。

圖3　接種量對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響Fig.3　Effect of inoculums amount on acetic acid fermentation

2.1.3初始pH對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響由圖3可知,初始pH為4.5的處理組酸度顯著高于其他實驗組,其中pH為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5的各處理組達到最大酸度的時間分別6、5、3、5、5 d。因此pH為4.5的處理組能夠在較短時間內(nèi)達到較高的酸度,該pH較適合于固定化醋酸菌醋酸發(fā)酵。

圖4　初始pH對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響Fig.4　Effect of inoculums pH on acetic acid fermentation

2.1.4溫度對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響由圖4可知,溫度為31 ℃和34 ℃的處理組酸度顯著高于其他處理組,溫度為37 ℃的處理組酸度顯著低于其他處理組。其中25、28、31、34、37 ℃溫度的各處理達到最大酸度的時間分別為5、5、3、3、5 d。因此溫度為31 ℃和34 ℃的處理組能夠在較短時間內(nèi)達到較高的酸度,故初步確定醋酸菌發(fā)酵適宜溫度范圍為31～34 ℃。

圖5　溫度對固定化醋酸菌發(fā)酵的影響Fig.5　Effect of temperature on acetic acid fermentation

2.2正交實驗結果

由表3的實驗結果,結合方差分析表4可知:從比較實驗中A、B、C、D極差R的大小,可以看出三因素的主次關系是D(初始酒精度)>C(接種量)>A(pH)>B(溫度)。顯著性檢驗表明初始酒度(D)、接種量(C)和初始pH(A)對醋酸發(fā)酵的影響表現(xiàn)為極顯著,溫度(B)對醋酸發(fā)酵的影響表現(xiàn)為不顯著。

2.3木瓜果酒固定化發(fā)酵最佳工藝的驗證實驗

從在正交表的9組實驗中,A1B2C1D3并未包括在內(nèi),因此需要做進一步實驗。將理論所得的最佳組合A1B2C1D3與正交表中的最佳工藝組合A3B2C1D3進行比較,結果見表5。

表5　驗證實驗結果

表6　120 mL連續(xù)發(fā)酵實驗結果

注:表中同一列數(shù)據(jù)后標有相同字母表示在進行Duncan’s檢驗時在0.05水平無顯著差異。

由表5可知木瓜果酒固定化發(fā)酵正交表中的最佳工藝組合(A3B2C1D3)最終酸度為4.78 g/100 mL,理論得到的最佳工藝組合(A1B2C1D3)最終酸度為4.76 g/100 mL,由此可確定木瓜果酒固定化發(fā)酵最佳工藝條件是A3B2C1D3,即初始pH5.0、溫度32.5 ℃、接種量13%、初始酒度8%。

2.4固定化醋酸菌細胞與游離細胞發(fā)酵比較結果

由圖6可知,固定化醋酸菌前期產(chǎn)酸是直線上升的,到第3 d左右達到高峰,酸度為4.688%。在同樣條件下,木瓜果酒接種游離醋酸菌,前期產(chǎn)酸較慢,經(jīng)過24 h左右的培養(yǎng),產(chǎn)酸加快,到第4 d左右達到高峰,最終酸度與固定化醋酸菌產(chǎn)生的醋酸度相近。

圖6　固定化醋酸菌細胞與游離細胞發(fā)酵比較Fig.6　Comparison of acetic fermentationbetween immobilized and planktonic acetic acid bacteria

2.5固定化醋酸菌連續(xù)發(fā)酵實驗

由表6可知,連續(xù)流加10個批次,酸度都保持在4.10 g/100 mL以上,產(chǎn)酸率在0.37 g/L·h以上,前3批產(chǎn)酸率較低,第4批有所上升,第5批達最高0.77 g/L·h,第6批又開始下降,到第8批之后保持在0.40 g/L·h左右。

以上結果表明:菌株前期需活化、增殖,所以第一批發(fā)酵時間較長,為96 h;隨著菌數(shù)穩(wěn)定后,發(fā)酵時間逐漸縮短,第5批次產(chǎn)酸率最高,只需24 h酸度即達到4.40 g/100 mL,第8批之后菌株開始退化,產(chǎn)酸率又有所下降,發(fā)酵時間最終穩(wěn)定為48 h。

3　討論

采用固定化發(fā)酵工藝比游離細胞發(fā)酵工藝周期短,產(chǎn)酸率比游離醋酸菌高,這可能是因為固定化發(fā)酵系統(tǒng)中的反饋抑制效應要比游離發(fā)酵系統(tǒng)中小,在發(fā)酵前期尤為明顯,使得固定化發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)細胞濃度明顯高于游離發(fā)酵系統(tǒng),從而加快了產(chǎn)酸速率。該結果與李西騰等[18]人利用固定化細胞技術發(fā)酵草莓醋的結果一致。其次,固定化醋酸菌發(fā)酵較游離細胞發(fā)酵易于實現(xiàn)連續(xù)化,且不同批次間產(chǎn)品質量更穩(wěn)定。

木瓜果醋發(fā)酵之后,發(fā)酵液中菌數(shù)上升,這是由于在發(fā)酵過程中,由于醋酸菌細胞的不斷生長會造成固定化醋酸菌的機械強度不斷下降,從而發(fā)生細胞泄漏,最終導致固定化醋酸菌的發(fā)酵性能有所下降,因此,我們在使用過程中,要解決好固定化醋酸菌容易破裂的問題。

4　結論

固定化醋酸菌釀造木瓜果醋的較適工藝參數(shù)為初始pH5.0、溫度32.5 ℃、接種量13%、初始酒度8%,最終酸度達到4.78 g/100 mL。

在相同的發(fā)酵條件下,固定化醋酸菌發(fā)酵速度較游離醋酸菌快,發(fā)酵周期較游離醋酸菌短。

固定化技術連續(xù)發(fā)酵木瓜果醋10批次研究結果表明,最短只需24 h,木瓜果醋酸度即達4.40 g/100 mL,連續(xù)發(fā)酵10個批次的產(chǎn)酸率基本保持為0.40 g/L·h左右。

[1]李向宏,何凡,華敏.海南番木瓜產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢及發(fā)展對策[J].柑桔與亞熱帶果樹信息,2004,20(3):1-2.

[2]張文學,胡承,李仕強.番木瓜資源的應用狀況[Z]. 2000:01.

[3]黃猛.水果型番木瓜的營養(yǎng)保健價值及發(fā)展前景[J].農(nóng)業(yè)研究與應用,2011(4):52-54.

[4]劉思,沈文濤,黎小瑛,等.番木瓜的營養(yǎng)保健價值與產(chǎn)品開發(fā)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2007(02):68-71.

[5]夏杏洲,黃小草,李賢生,等.番木瓜果醋的試制[J].中國調(diào)味品,2000(10):16-18.

[6]王宇鴻,雷湘蘭,梁青.番木瓜芒果復合發(fā)酵果醋工藝研究[J].中國釀造,2013(10):142-145.

[7]彭瑞琴.番木瓜新品種-穗中紅[J].福建農(nóng)業(yè),1998(09):18.

[8]高磊.固定化技術應用于火棘果醋發(fā)酵工藝的研究[J].保鮮與加工,2012(05):35-38.

[9]陳維.酵母細胞固定化實驗的改進和拓展探究[J].實驗教學與儀器,2011(10):25.

[10]RICKERT D G C G B. Improved organic acid production by calcium alginate-immobilzed propionibacteria[J]. Enzy Microb Technol,1998(22):409-414.

[11]周文化,周曄,周其中,等.殼聚糖在荔枝果酒澄清中的應用研究[J].中南林業(yè)科技大學學報,2007,27(3):106-108.

[12]安玉紅.木瓜果醋的生產(chǎn)技術研究[D]. 西南大學,2010.

[13]賀江,樊明濤,包飛.固定化酵母粒子的制備及特性[J].釀酒科技,2007(11):29-31.

[14]賀江,樊明濤,包飛.多菌種共固定化技術釀造蘋果醋研究[J].中國食物與營養(yǎng),2008(11):35-38.

[15]侯紅萍,閆躍文.吸附包埋結合法共固定化糖化酶和酵母菌的研究[J].食品科學,2009(5):201-204.

[16]孫菲菲,秦艷,韋星明等.固定化細胞技術應用于芒果醋的研究[J].中國釀造,2008(17):56-58.

[17]李西騰.固定化技術應用于西瓜醋的研究[J].中國釀造,2010(10):117-119.

[18]李西騰. 固定化技術應用于草莓醋的研究[J]. 中國調(diào)味品,2010,35(6):54-56.

Study on fermentation of papaya vinegar with immobilized acetobacter aceti

LAN Wei-jie,CHEN Qin-yuan,LI Ji,YE Xin-yi,HE Jin-liu,GUO Yuan-zhao,QIN Wen*

(1.College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;2.Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Science,Chengdu 610000,China)

Using Papaya as raw material,3% sodium alginate was used to immobilize acetic acid bacteria in the 0.05 mol/L calcium chloride,the production of Papaya vinegar by the fermentation of immobilized acetic acid bacteria was studied.Results showed that optimum parameters were as follows 8% alcohol degree,13% inoculums amount,pH5.0,32.5 ℃,the total acid content was 4.78 g/100 mL;The yield of acid produced by immobilized acetic acid bacteria was higher compared to that of planktonic acetic acid bacteria;It was found that the highest acidity could reach 4.40 g/100 mL after 24 h and the rate of acid production was around 0.40 g/L·h in 10 batches of continuous fermentation.

Carica Papaya L.;vinegar;immobilized acetic acid bacteria;acetic acid fermentation

2015-02-12

蘭維杰(1992-),男,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:lwj18728158690@163.com。

秦文(1967-),女,博士,四川農(nóng)業(yè)大學教授,研究方向:果蔬加工及貯藏,E-mail:qinwen1967@yahoo.com.cn。

TS

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000