酸敏感離子通道阻斷劑對(duì)酸誘導(dǎo)偏頭痛模型小鼠的影響

康玉琪，陳康，何小華，尹皓，毛立武，盧祖能#，肖哲曼#

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·論著·

酸敏感離子通道阻斷劑對(duì)酸誘導(dǎo)偏頭痛模型小鼠的影響

康玉琪1*，陳康1*，何小華2，尹皓1，毛立武3，盧祖能1#，肖哲曼1#

目的：觀察酸敏感離子通道阻斷劑對(duì)酸誘導(dǎo)偏頭痛模型小鼠行為學(xué)及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法：24只小鼠隨機(jī)分為pH7.4組、pH6.0組、阿米洛利治療組、PcTx1治療組，每組6只。pH7.4組采用pH值7.4的合成組織間液（SIF）涂抹硬腦膜，后3組采用pH值6.0的SIF建立小鼠實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型，阿米洛利治療組、PcTx1治療組分別給予阿米洛利和PcTx1治療。觀察小鼠制模后1 h內(nèi)撓頭次數(shù)、3 h后三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核內(nèi)c-fos及腦干中酸敏感離子通道（ASIC1a）蛋白的表達(dá)。結(jié)果：在造模后1 h內(nèi)pH6.0組的撓頭次數(shù)明顯多于pH7.4組（P＜0.01），阿米洛利治療組和PcTx1治療組則明顯少于其他兩組（P＜0.01）。與pH7.4組相比，pH6.0組的小鼠腦干中三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核內(nèi)的c-fos免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.01）；阿米洛利治療組和PcTx1治療組與pH6.0組相比，相應(yīng)部位c-fos免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）。與pH7.4組相比，pH 6.0組腦干中的ASIC1a蛋白表達(dá)較高（P＜0.05）；阿米洛利治療組、PcTx1治療組與pH6.0組相比，ASIC1a蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論：酸敏感離子通道阻斷劑能夠減少偏頭痛模型小鼠行為學(xué)異常及相關(guān)蛋白表達(dá)，提示酸敏感離子通道參與偏頭痛的發(fā)生機(jī)制。

阿米洛利；PcTx1；偏頭痛；c-fos；ASIC1a

偏頭痛是臨床上較常見的一種反復(fù)發(fā)作的原發(fā)性頭痛，主要為頭部一側(cè)或雙側(cè)搏動(dòng)樣疼痛，可伴惡心、嘔吐，部分患者發(fā)作前有眼前閃光或視野缺損等先兆癥狀，可有家族史，病程長(zhǎng)者往往伴有焦慮、抑郁，嚴(yán)重影響患者工作和生活[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，偏頭痛全球發(fā)病率約為11%，在《2010年全球疾病負(fù)擔(dān)評(píng)估》中高居第3位，并且此病具有很高的致殘率，在致殘?zhí)厥庠蛑芯佑诘?位[2]。偏頭痛的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，有研究顯示，該病的發(fā)生可能與遺傳因素、雌激素、5-羥色胺、緩激肽、前列腺素E等有關(guān)，而焦慮、緊張、疲勞等精神因素、光、冷、聲等物理因素及飲酒、咖啡等食物亦可誘發(fā)此病[3]，主要有血管學(xué)說、三叉神經(jīng)血管學(xué)說、皮質(zhì)擴(kuò)散性抑制學(xué)說。最近研究表明炎癥通路在偏頭痛的發(fā)作中發(fā)揮重要作用，酸敏感離子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）又參與炎癥反應(yīng)[4]，因此本文以酸誘導(dǎo)頭痛小鼠為研究對(duì)象，探討ASICs對(duì)偏頭痛模型小鼠行為學(xué)及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡雄性SPF級(jí)C57小鼠24只，體質(zhì)量20～25 g，由武漢大學(xué)ABSL-Ⅲ實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。保證正常晝夜規(guī)律，生理環(huán)境飼養(yǎng)1周，室溫20℃，自然光照，通風(fēng)良好，自由攝食和飲水。適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境1周。

1.1.2主要試劑 阿米洛利、PcTx1（購(gòu)于美國(guó)Sigma公司），由DMSO稀釋；兔抗鼠c-fos抗體、驢抗鼠ASIC1a（購(gòu)于美國(guó)Abcam公司）；合成組織間液（synthetic interstitial fluid，SIF）由10 mmol/L Hepes、5 mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2、135 mmol/L NaCl組成。

1.2方法

1.2.1分組及偏頭痛模型的建立 小鼠隨機(jī)分為pH7.4組、pH6.0組、阿米洛利治療組、PcTx1治療組，每組6只。參考Wieseler等[5]的實(shí)驗(yàn)方法，在此基礎(chǔ)上稍作修改。10%水合氯醛（0.004 mL/g）腹腔注射麻醉小鼠，消毒后剪開頭皮暴露顱骨。在立體定位儀下定位于后囟點(diǎn)，兩側(cè)旁開1.5 mm定位，并由此兩點(diǎn)分別向前3 mm處定位，以此四點(diǎn)為界用牙科水泥鉆鉆開3 mm×3 mm的顱骨，暴露矢狀竇，避免損傷硬腦膜。用微量移液器在硬腦膜上分別涂上20 μL不同pH值的SIF，pH7.4組給予pH值7.4的SIF，其他3組均給予pH值6.0的SIF。為避免液體外漏用膠水將0.5 mL EP管蓋粘于顱骨上，以免頭皮碰到膠水，隨后縫合傷口。阿米洛利治療組在術(shù)后給予腹腔注射阿米洛利（100 mg/kg），PcTx1治療組在硬腦膜給酸后給予 PcTx1毒素（500 ng/mL×5 μL）。

1.2.2偏頭痛行為學(xué)檢測(cè) 術(shù)后，將老鼠分別放入透明籠子中，待小鼠蘇醒后計(jì)時(shí)1 h，記錄小鼠撓頭次數(shù)。

1.2.3腦標(biāo)本采集 給藥3 h后，用10%水合氯醛（0.004 mL/g）腹腔注射麻醉小鼠，開胸后于心尖部進(jìn)針進(jìn)入左心室，先用0.9%的生理鹽水沖洗，隨后用預(yù)冷4%多聚甲醛先快后慢灌注后取出小鼠腦部，將組織置于4%多聚甲醛固定液中4～6 h后，放于20%蔗糖中脫水，置于4℃冰箱，直至組織沉底。石蠟包埋。

1.2.4免疫組化 用石蠟切片機(jī)制備連續(xù)切片，片厚約2 μm，貼于預(yù)先涂0.1%多聚賴氨酸的載玻片上，67℃溫箱烘干后，切片脫蠟脫水，3%雙氧水封閉10 min，高溫修復(fù)，自然晾干至室溫，滴加兔抗鼠c-fos抗體（稀釋倍數(shù)1∶200），4℃孵育24 h，滴加羊抗兔IgG室溫孵育2 h。以上各步驟之間均用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS pH值7.4）洗5 min，重復(fù)3次，最后用新鮮配制的0.05%DAB-0.01%H2O2混合液顯色，鏡下控制顯色程度，復(fù)染，藍(lán)化，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后觀察。

1.2.5Western blotting取腦干組織（中腦、橋腦、延髓）樣本加入RIAP細(xì)胞裂解液，用勻漿器充分勻漿，直至裂解。將上述EP管中液體 12 000rpm，4℃離心10 min，取上清置于新的離心管中。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，向蛋白中加入5×SDS上樣緩沖液（按4∶1的體積比混勻），100℃沸水浴10 min。取適量樣品上樣，SDS-PAGE電泳，先用80 V恒壓電泳約40 min，后改為120 V恒壓電泳約70 min。電泳結(jié)束后將凝膠上蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。將PVDF膜放入50 mL含5%脫脂牛奶的1×TBST中，于室溫下封閉2 h。將膜放入稀釋的一抗中（驢抗鼠ASIC1a，1∶200），4℃緩慢搖振孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次15 min。加入羊抗驢二抗（1∶5 000），4℃緩慢搖振孵育90 min。TBST洗膜3次，每次15 min。ECL顯色，在暗房中用膠片曝光，用Quantity One對(duì)灰度值進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1頭痛行為學(xué)

與造模后的0～30 min相比，30～60 min內(nèi)pH7.4組、pH6.0組、阿米洛利治療組和PcTx1治療組撓頭次數(shù)均呈上升趨勢(shì)。在造模后1 h內(nèi)pH6.0組的撓頭次數(shù)明顯要多于pH7.4組（P＜0.01），阿米洛利治療組和PcTx1治療組則明顯少于其他兩組（P＜0.01），見圖1。

2.2腦干c-fos的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，與相應(yīng)時(shí)間段pH7.4組相比，pH6.0組的小鼠腦干中三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核內(nèi)的c-fos免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多（P＜0.01）；阿米洛利治療組和PcTx1治療組與pH6.0組相比，相應(yīng)部位c-fos免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），見圖2。

圖1　酸誘導(dǎo)偏頭痛小鼠模型行為學(xué)

圖2　c-fos陽性表達(dá)（免疫組化染色，×40）

2.3腦干ASIC1a的表達(dá)

Western blotting顯示，pH7.4組、pH6.0組、阿米洛利治療組和PcTx1治療組的ASIC1a表達(dá)分別為（0.34±0.01）、（0.40±0.01）、（0.25±0.03）和（0.07±0.01）。與pH7.4組相比，pH6.0組的ASIC1a表達(dá)較高（P＜ 0.05）；阿米洛利治療組、PcTx1治療組與pH6.0組相比，ASIC1a表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01），見圖3。

圖3　腦干中ASICla蛋白表達(dá)水平

3　討論

ASICs是一種配體門控型離子通道，屬于上皮鈉離子通道/退化蛋白超家族（epithelial Na+channel/ degenerin，ENaC/DEG）成員，由4種編碼酸敏感離子通道基因共編碼6種ASICs亞基蛋白，即ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。Krishtal和Pidoplichko[6]于1980年發(fā)現(xiàn)pH值驟降可引起大鼠三叉神經(jīng)元產(chǎn)生鈉離子傳導(dǎo)，由此提出ASICs的概念和體內(nèi)存在“質(zhì)子受體”的理論[7]。由于這種現(xiàn)象與酸中毒具有極強(qiáng)的聯(lián)系，故推斷該反應(yīng)過程可能與疼痛相關(guān)[8]。經(jīng)30余年的研究，Yan等[9]不僅確定ASICs在三叉神經(jīng)感受傷害中的作用，并證實(shí)酸堿依賴所誘發(fā)的硬腦膜傳入纖維激活為炎癥條件下被敏化。這些研究均提示ASICs在偏頭痛的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，且為主要中介物。因此，人們對(duì)ASICs有了新的認(rèn)識(shí)，并為尋找有效治療偏頭痛提出了一個(gè)新的研究方向。

另有研究顯示，約有80%的硬腦膜傳入纖維表達(dá)ASICs免疫標(biāo)志[9,10]，酸性溶液在清醒動(dòng)物硬腦膜上的應(yīng)用通過激活A(yù)SICs引起偏頭痛相關(guān)的疼痛行為，表明細(xì)胞外液輕微的酸堿度變化即能夠通過激活A(yù)SICs而直接激發(fā)硬腦膜傳入纖維[11]。筆者對(duì)酸性溶液引起偏頭痛及ASIC1a在偏頭痛中的作用進(jìn)行了一系列前期研究，通過制作小鼠偏頭痛模型，觀察小鼠行為學(xué)的變化及組織學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)酸性溶液使小鼠撓頭次數(shù)明顯增多，腦干中三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核內(nèi)c-fos表達(dá)顯著增加，同時(shí)ASIC1a蛋白表達(dá)上調(diào)，提示酸性溶液能引起偏頭痛，并且ASIC1a在酸誘導(dǎo)偏頭痛中起著重要作用。

阿米洛利是ASICs非特異性阻斷劑，通過阻斷ASICs而引導(dǎo)人體傷害性感受器上酸感受器的表達(dá)，并且產(chǎn)生劑量依賴性抗傷害作用[12]。PcTx1是ASIC1a特異阻斷劑。一項(xiàng)對(duì)7例嚴(yán)重偏頭痛患者的觀察性研究顯示，阿米洛利可有效降低患者（4例）先兆癥狀并改善頭痛程度[13]。本研究顯示，阿米洛利和PcTx1處理后，偏頭痛小鼠的撓頭次數(shù)明顯減少，腦干中三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核內(nèi)c-fos表達(dá)顯著減少，同時(shí)ASIC1a蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)，這說明，ASICs阻斷劑通過阻斷ASICs來減少偏頭痛的發(fā)作。

總之，ASICs阻斷劑可以減少偏頭痛的發(fā)作，而這種作用與ASICs有關(guān)，為偏頭痛的治療提供了新的方向。

[1]陳娟,黃淼,瞿昌華,等.湖北恩施土家族地區(qū)偏頭痛患者經(jīng)顱多普勒分析[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2015,5:444-463．

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（本文編輯：王晶）

Effect of Acid-sensing Ion Channels Blocker on Acid Induced Migraine Mice Model

KANG Yu-qi1,CHEN Kang1,HE Xiao-hua2,YIN Hao1,MAO Li-wu3,LU Zu-neng1,XIAO Zhe-man1.1.Department of Neurology,Renmin Hospital,Wuhan University,Wuhan 430060,China;2.Department of Pathophysiology,School of Basic Medical Sciences,Wuhan University,Whuhan 430060,China;3.Department of Neurology,The Centre Hospital of Suizhou,Hubei 441300,China

Objective:To observe the effect of acid-sensing ion channels(ASICs)blocker on ethology and related protein expression of acid induced migraine mice model.Methods:Twenty-four mice were randomly divided into groups pH7.4,pH6.0,amiloride,PcTx1(n=6 in each group).The dura mater of the pH7.4 group was daubed by pH7.4 synthetic interstitial fluid(SIF).And the dura mater of the other three groups were daubed by pH6.0 SIF to induce headache.The groups Amiloride and PcTx1 were given amiloride or PcTx1 for treatment respectively.The number of scratching head was counted within 1 h after building model.The expressions of c-fos in the caudal spinal trigeminal nucleus(cSTN)and ASIC1a in the brain stem were observed 3 h later.Results:The number of scratching head of the pH6.0 group was obviously more than that of the pH7.4 group(P＜0.01).The number of scratching head of the groups amiloride and PcTx1 were obviously less than the other two groups(P＜0.01).Compared with the pH7.4 group,the number of c-fos immunoreactive positive cells of pH6.0 group was significantly increased in the caudal spinal trigeminal nucleus of mice(P＜0.01).Compared with the pH6.0 group,the numbers of c-fos immunoreactive positive cells of amiloride group and PcTx1 group were significantly decreased(P＜0.01). Compared with the pH7.4 group,the ASIC1a expression of pH6.0 group was higher in the brain stem of mice(P＜0.05).Compared with the pH6.0 group,the ASIC1a expressions of amiloride group and PcTx1 group were significantly lower(P＜0.01).Conclusion:That ASICs blocker could reduce behavior abnormalities of migraine mice model and the expression of related protein suggests ASICs involved in the mechanism of migraine.

Amiloride;PcTx1;migraine;C-fos;ASIC1a

R741；741.02

A

10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.01.002

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

武漢430060

2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室

武漢430060

3.隨州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

武漢441300

基金課題

國(guó)家自然科學(xué)基金

（No.81471133，309 00459）；

湖北省衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)項(xiàng)目

（No.WJ2015MA00 7）；

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金課題

（No.200804861046）；湖北省自然科學(xué)基金

（No.2014CFB734）；武漢市科技局2015年應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目

（No.201506010101 0047）

2015-11-03

盧祖能

lzn196480@126.

com

肖哲曼

zmxiao@whu.edu. cn

注：*為并列第一作者，#為并列通訊作者