HPLC-MS測(cè)定多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中的壬基酚

李翔宇,柴莎莎,向　麗,舒　敏,肖　敏,董長(zhǎng)春,杜明立,汪志明

(嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司 湖北省營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品生物合成工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430223)

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HPLC-MS測(cè)定多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中的壬基酚

李翔宇,柴莎莎,向麗,舒敏,肖敏,董長(zhǎng)春,杜明立,汪志明*

(嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司 湖北省營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品生物合成工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430223)

建立了多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中壬基酚的液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)檢測(cè)方法。樣品經(jīng)環(huán)己烷∶乙酸乙酯(1∶1,v/v)提取,低溫冷凍離心凈化,液相色譜-電噴霧質(zhì)譜測(cè)定,內(nèi)標(biāo)法定量。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了樣品提取條件,最佳提取條件為提取次數(shù)為1次、超聲15 min、稱樣質(zhì)量為1.5 g,渦旋時(shí)間20 s。檢出限為0.3 μg/kg,線性范圍1～150 ng/mL(r=0.9998),樣品測(cè)定結(jié)果為36.21～123.98 μg/kg,樣品回收率為94.6%～108.1%,RSD=3.9%～14.3%(n=6)。該法簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確,可用于多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中壬基酚的分析測(cè)定。

壬基酚,液相色譜-電噴霧質(zhì)譜,多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑

壬基酚(Nonylphenol,NP)是一種內(nèi)分泌干擾物,其對(duì)人體癌細(xì)胞增長(zhǎng)及生殖能力均會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,壬基酚一旦進(jìn)入生物體內(nèi)之后,就會(huì)影響生物體正常的生殖和發(fā)育[1-2]。

壬基酚是重要的化工原料,作為增塑劑和表面活性劑原料等被廣泛用于各種產(chǎn)品[3-4],可通過(guò)多種途徑污染食品,其親脂性較強(qiáng),易在高脂肪、高蛋白的動(dòng)物性食品中富集[5-6]。

多不飽和脂肪酸主要包含二十二碳六烯酸(DHA,Docosahexaenoic Acid)及二十碳四烯酸(ARA,Arachidonic Acid)兩種,是嬰幼兒奶粉中不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。DHA、ARA在視網(wǎng)膜和大腦皮質(zhì)中含量豐富,對(duì)視網(wǎng)膜和大腦功能具有重要的作用[7],特別是對(duì)嬰兒的視力和大腦發(fā)育非常重要[8-9]。NP廣泛存在于肉、蛋和奶等基質(zhì)中,其中奶粉和液奶的污染較為嚴(yán)重,作為奶粉的重要配料,多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑的質(zhì)量控制備受奶粉制造企業(yè)的關(guān)注[10]。本文通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品前處理進(jìn)行了優(yōu)化研究,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,能快速準(zhǔn)確的測(cè)定多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中的壬基酚,為壬基酚污染監(jiān)控打下重要基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

甲醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷,為L(zhǎng)C-MS級(jí)美國(guó)Fisher公司;4-NP標(biāo)準(zhǔn)品(純度100%),同位素內(nèi)標(biāo)4-n-NP-d4(純度98.9%)加拿大CDN isotopes公司;色譜柱安捷倫poroshell 120 EC-C18柱(50 mm×4.6 mm,2.7 μm);不同批次的多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑(DHA含量在39%～40%左右)嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)用水Milli-Q 超純水.

Agilent1260高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司,QTRAP4500質(zhì)譜儀美國(guó)Sciex公司,冷凍離心機(jī)美國(guó)sigma公司,氮吹儀上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取20 mg標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇定容至100 mL,配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,置于-20 ℃下保存。吸取1 mL壬基酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇定容至100 mL,作為標(biāo)準(zhǔn)中間液。使用時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)中間溶液稀釋為合適濃度。

1.2.2樣品提取稱取微膠囊粉劑產(chǎn)品1.0 g(精確到0.0001 g)于15 mL玻璃離心管中,加入10 mL乙酸乙酯∶環(huán)己烷混合溶液(1∶1,v/v)[11],加入4-n-NP-d4內(nèi)標(biāo)100 μL,渦旋20 s,超聲提取15 min,6000 r/min離心15 min,取上清液5 mL于氮吹管中,60 ℃水浴氮吹干,定容至2 mL,-10 ℃冷凍離心12000 r/min離心15 min后取上清于進(jìn)樣瓶中供液質(zhì)分析。根據(jù)之前預(yù)實(shí)驗(yàn)的單因素結(jié)果發(fā)現(xiàn)稱取樣品的質(zhì)量、提取次數(shù)、渦旋時(shí)間和超聲時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響最大,并由此確定了因素水平。正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表見(jiàn)表1。選取超聲時(shí)間、提取次數(shù)、渦旋時(shí)間和稱取質(zhì)量,以回收率為目標(biāo)值,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),確定樣品提取的最佳條件。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

實(shí)驗(yàn)中所用的均為玻璃器皿,使用前在馬弗爐中400 ℃烘烤4 h[12],液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的管線均為不銹鋼或聚四氟乙烯材質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品測(cè)試需要做試劑空白。

1.2.3液相色譜流動(dòng)相:甲醇-純水梯度洗脫,梯度條件表見(jiàn)表1,流動(dòng)相A為純水,流動(dòng)相B為甲醇;進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.6 mL/min,柱溫:(40±1)℃。

表2　色譜分離梯度條件Table 2　The chromatography separation conditions

1.2.4質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源正離子掃描;離子化電壓,3500 V;加熱溫度600 ℃;噴霧氣,55 psi;輔助加熱氣,55 psi。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)具體的離子采集參數(shù)見(jiàn)表3。

表3　多反應(yīng)監(jiān)測(cè)具體的離子采集參數(shù)Table 3　The parameter of Multiselected reaction monitoring

2　結(jié)果與討論

2.1樣品提取條件優(yōu)化

多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑為基質(zhì)復(fù)雜的樣品,其中包括蛋白、油脂、乳糖等。若提取的不徹底,將對(duì)檢測(cè)結(jié)果有較大的影響。乙酸乙酯-環(huán)己烷體系能夠有效的沉淀蛋白,溶解壬基酚。選取影響提取結(jié)果的四個(gè)主要因素超聲時(shí)間、提取次數(shù)、渦旋時(shí)間和稱取質(zhì)量,以回收率為目標(biāo)值,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定樣品提取的最佳條件。實(shí)驗(yàn)因素水平、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見(jiàn)表4。由表4可知:各因素主次順序?yàn)?C(稱樣質(zhì)量/g)>A(提取次數(shù)/次)>B(超聲時(shí)間/s)>D(渦旋時(shí)間/s),最佳條件為A1B2C3D2即提取次數(shù)為1次、超聲15 min、稱樣質(zhì)量為1.5 g,渦旋時(shí)間20 s。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,此最佳條件下回收率達(dá)到98.6%,并且重現(xiàn)性較好,三個(gè)平行樣間的RSD為8%。

表4　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 4　The orthogonal experiment design and result analysis

2.2樣品的凈化條件

由于壬基酚在環(huán)境中普遍存在,塑料器皿或者橡膠制品等都可能遷移出大量的壬基酚,這些對(duì)分析結(jié)果將會(huì)造成較大的干擾[13]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)用一次性注射器吸取少量的甲醇溶液通過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜和不過(guò)膜直接進(jìn)樣對(duì)比發(fā)現(xiàn),接觸注射器和濾膜后明顯有壬基酚溶出,因此不能直接過(guò)膜。不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中含有部分油脂,經(jīng)樣品提取后未能完全與壬基酚分開(kāi),因此凈化時(shí)還需要去除油脂。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)固相萃取小柱也會(huì)發(fā)生壬基酚溶出現(xiàn)象,因此也不能選擇固相萃取作為凈化方式。

考慮到上述影響因素,參考其他資料發(fā)現(xiàn)[14],低溫冷凍可以很好地去除油脂。因此可以使用低溫冷凍高轉(zhuǎn)速離心,離心后觀察到有明顯的油脂析出,經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定了最佳離心條件,低溫-10 ℃,12000 r/min離心15 min取上清,這樣不過(guò)膜也可以有效地去除油脂及其他雜質(zhì)。使用純甲醇進(jìn)樣和經(jīng)低溫冷凍后的純甲醇進(jìn)樣,發(fā)現(xiàn)壬基酚并沒(méi)有明顯增加,具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　樣品MRM色譜圖Fig.1　Chromatograms of samples under MRM mode

圖1中A為純甲醇的色譜圖,B為經(jīng)低溫冷凍離心后的純甲醇的色譜圖,由圖1可以看出,冷凍離心過(guò)程幾乎不會(huì)引入壬基酚,不會(huì)對(duì)樣品結(jié)果造成影響。這種方式快捷簡(jiǎn)便的實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的凈化。

2.3色譜及質(zhì)譜條件

比較了甲醇-水和乙腈-水兩種流動(dòng)相體系,發(fā)現(xiàn)甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)壬基酚和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)值較高,是乙腈-水為流動(dòng)相的3～6倍,故選用甲醇-水為流動(dòng)相。選擇ESI負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,得到壬基酚的分子離子峰m/z 219.1,以m/z 219.1作二級(jí)質(zhì)譜,并優(yōu)化質(zhì)譜條件,具體見(jiàn) 1.2.4。以豐度較高133.0的作為定量離子,豐度較低146.9的作為定性離子并采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行定性定量計(jì)算。圖1為壬基酚及內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖,保留時(shí)間為4.22 min的為目標(biāo)物壬基酚的峰,保留時(shí)間為4.40 min為內(nèi)標(biāo)的峰。

圖2　壬基酚及內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖Fig.2　Chromatograms of NP and internal standard under MRM mode

2.4線性范圍和定量限

配制質(zhì)量濃度為0.5～200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,內(nèi)標(biāo)濃度均為20 ng/mL。以目標(biāo)組分峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值X對(duì)相應(yīng)濃度Y(ng/mL)進(jìn)行線性回歸,線性回歸方程為y=0.5866x-0.0374,線性范圍為1～150 ng/mL,在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r)為0.9998。以加標(biāo)樣品中待測(cè)化合物色譜峰的信噪比等于3(S/N=3)對(duì)應(yīng)的濃度為方法的檢出限(LOD),S/N=10對(duì)應(yīng)的濃度為方法的定量限(LOD),最終確定樣品中LOD為0.3 μg/kg,LOQ為1.0 μg/kg。

2.5重復(fù)性

取三個(gè)不同批次配方不同的微膠囊粉劑樣品,每個(gè)樣品設(shè)六個(gè)平行,分別測(cè)定并計(jì)算樣品的壬基酚含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表5,說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

表5　重復(fù)性結(jié)果Table 5　Results of repeatability

2.6穩(wěn)定性

取微膠囊粉劑樣品,經(jīng)過(guò)提取和凈化后得到待檢測(cè)樣品溶液,分別放置0、2、4、8、12 h后,上機(jī)進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)6次,樣品測(cè)試結(jié)果的RSD為11.45%,表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7回收率和精密度

取三個(gè)不同批次的樣品(配方不同),在基質(zhì)中添加不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,加標(biāo)水平分別為5,50,100 μg/kg,每個(gè)水平設(shè)6個(gè)平行,計(jì)算三個(gè)樣品的回收率和RSD,結(jié)果見(jiàn)表6。表6為回收率測(cè)定結(jié)果,其三個(gè)加標(biāo)水平測(cè)定結(jié)果在94.6%～108.1%之間。

表6　回收率測(cè)定結(jié)果Table 6　Determination results of recovery

3　結(jié)論

采用HPLC-MS/MS的檢測(cè)技術(shù),建立了微膠囊粉劑中的壬基酚檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)便、快速,具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。該方法的建立為多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中的壬基酚監(jiān)控打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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Determination of Nonylphenol in polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder by liquid chromatography tandem mass spectrometry

LI Xiang-yu,CHAI Sha-sha,XIANG Li,SHU Min,XIAO Min,DONG Chang-chun,DU Ming-li,WANG Zhi-ming*

(CABIO Bioengineering(Wuhan)Co.,Ltd Hubei Province Nutrition Chemicals Biosynthetic Engineering Technology Research Center,Wuhan 430223,China)

A sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry method(LC-MS/MS)was developed for the determination of Nonylphenol(NP)in polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder.The Nonylphenol in samples was extracted with the mixture of cyclohexane and ethyl acetate(1∶1,v/v).The extractions were purified by centrifuge with low temperature and LC-MS/MS analysis was performed by positive ion electrospray ionization applying multiple reaction monitoring with internal standard method for quantitative analysis.The condition of the sample extraction was optimized by the orthogonal experiment.The optimized fermentation conditions were found to be:extraction 1 time,ultrasonic time 15 min,1.5 g samples and vortex time 20 s.The limits of quantitation(LOQ)was 0.3 μg/kg,and the method showed good linearity between 1～150 ng/mL(r=0.9998).The results of the samples were 36.21～123.98 μg/kg.The recoveries were between 94.6% to 108.1% and RSD were between 3.9% to 14.3%.The method was simple,quick and accurate.The method was proved to be appliable in the determination of NP in polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder.

Nonylphenol;HPLC-ESI-MS;polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder

2015-11-05

李翔宇(1979-),男,碩士,高級(jí)工程師,研究方向:營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品,E-mail:xiangyu_lee@cabio.cn。

汪志明(1969-),男,本科,高級(jí)工程師,研究方向:生物化工、脂質(zhì)研究、營(yíng)養(yǎng)化工,E-mail:jimmy_wang@cabio.cn。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目資助(2014AA021701)、(2014AA021703)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)09-0323-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.054