水酶法提取北太平洋魷魚肝臟油脂及其脂肪酸組成分析

徐彤硯,張　茹,楊欣星,楊文鴿,張進(jìn)杰,樓喬明

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315211)

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水酶法提取北太平洋魷魚肝臟油脂及其脂肪酸組成分析

徐彤硯,張茹,楊欣星,楊文鴿,張進(jìn)杰,樓喬明*

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315211)

研究了水酶法提取北太平洋魷魚肝臟油脂的工藝,考察了蛋白酶種類、料液比、反應(yīng)溫度、提取時間和加酶量對油脂提取率的影響,并采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對所提油脂的脂肪酸組成進(jìn)行分析。通過單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到水酶法提取北太平洋魷魚肝臟油脂的最佳條件:中性蛋白酶為水解酶、料液比1∶0(g/mL)、反應(yīng)溫度55 ℃、提取時間6 h、加酶量1800 U/g;在該優(yōu)化條件下,油脂提取率為79.21%。北太平洋魷魚肝臟油脂脂肪酸主要為C16∶0(16.27%)、C18∶1n-9(11.68%)、C20∶1n-11(12.94%)、EPA(9.81%)和DHA(23.61%),其中n-3型多不飽和脂肪酸高達(dá)35.97%,且∑n-3 PUFA/∑n-6 PUFA為7.99,表明北太平洋魷魚肝臟油脂具有很高的營養(yǎng)價值和保健功能,可作為EPA和DHA等功能性脂肪酸的重要食藥來源。

北太平洋魷魚,肝臟,水酶法,油脂,脂肪酸

魷魚是世界上重要的海洋頭足類動物,其生長周期短、繁殖能力強(qiáng)和資源恢復(fù)迅速,是一種可持續(xù)的海洋漁業(yè)資源。近年來,隨著我國海洋漁業(yè)的迅速發(fā)展,魷魚已成為我國主要的海洋捕撈和水產(chǎn)加工品種。目前,我國每年魷魚加工量高達(dá)40～50萬t,居世界第一位,加工品種主要為北太平洋魷魚(Ommastrephesbartrami)、阿根廷魷魚(Illesargentines)和秘魯魷魚(Dosidicusgigas)[1]。我國魷魚加工產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)品層次較低,基本以魷魚干、魷魚絲和魷魚片等魷魚酮體加工為主,從而產(chǎn)生魷魚肝臟等大量加工副產(chǎn)物,這些副產(chǎn)物一般作為廢棄物直接丟棄、充當(dāng)肥料或低值飼料,這大大降低了魷魚資源的綜合利用率,造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。魷魚肝臟是魷魚加工的主要副產(chǎn)物,約占魷魚總重的15%～20%;同時魷魚肝臟富含油脂,且其脂肪酸以EPA和DHA等多不飽和脂肪酸為主,具有良好的保健功能[2-3]。因此,如能有效利用和開發(fā)魷魚肝臟,生產(chǎn)具有保健功能的高附加值魷魚肝臟油脂,不僅能有效減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染,還能進(jìn)一步拓展魷魚肝臟的利用新途徑,延長魷魚加工產(chǎn)業(yè)鏈,提高魷魚的綜合利用率和附加值。

水酶法是將酶制劑應(yīng)用于油脂提取的方法,其通過酶制劑作用降低油脂與蛋白質(zhì)等物質(zhì)的結(jié)合程度,在簡單機(jī)械力作用下使油脂釋放,并利用水油不相容而使油脂得到分離提取;該方法具有出油率高、油質(zhì)好、色澤淺、環(huán)保、安全和廉價等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。目前,水酶法廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)加工副產(chǎn)物的油脂提取,如劉文倩等[6]研究了復(fù)合蛋白酶提取蝦黃油脂的工藝;臧麗芹等[7]優(yōu)化了堿性蛋白酶酶解鰩魚肝臟提取魚油的處理?xiàng)l件;Betty等[8]優(yōu)化了菠蘿蛋白酶提取鱸魚頭和三文魚頭油脂的工藝。北太平洋魷魚作為我國魷魚加工的主要品種,其年加工量在15～30萬t間,如能加以開發(fā)利用將能提高其利用價值。因此本文選用北太平洋魷魚肝臟為原料,通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蛋白酶提取魷魚肝臟油脂的工藝條件,并對魷魚肝臟油脂的脂肪酸組成進(jìn)行分析,以期為北太平洋魷魚肝臟油脂的提取和開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮北太平洋魷魚(Ommastrephesbartrami)寧波豐群食品有限公司提供,經(jīng)解剖分離出肝臟,勻漿后裝袋,于-40 ℃下凍藏備用;并參照國標(biāo)方法,依次測得北太平洋魷魚肝臟的水分、粗蛋白和總脂含量為51.97%±1.03%、23.60%±0.60%和20.92%±0.24%。

37種脂肪酸甲酯混標(biāo)美國Sigma公司;中性蛋白酶(20萬U/g)、酸性蛋白酶(80萬U/g)、堿性蛋白酶(20萬U/g)、木瓜蛋白酶(80萬U/g)、菠蘿蛋白酶(50萬U/g)江蘇銳陽生物科技有限公司;氯仿、甲醇、無水硫酸鈉、濃硫酸等分析純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

7890A型氣相色譜儀美國Agilent儀器有限公司;M7-80EI型質(zhì)譜儀北京普析通用儀器有限公司;BIOFUGE STRATOS型臺式高速冷凍離心機(jī)賽默飛世爾科技有限公司;Laborota 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國海道爾夫公司;Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)美國Millipore公司;AB135-S型精密電子分析天平瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛋白水解酶的選擇取20 g北太平洋魷魚肝臟勻漿液,按1200 U/g的加酶量分別加入中性蛋白酶(Neu)、酸性蛋白酶(Aci)、堿性蛋白酶(Alc)、木瓜蛋白酶(Pap)和菠蘿蛋白酶(Bro),以不加任何蛋白酶的實(shí)驗(yàn)組為空白組,并按料液比1∶0.5(g/mL)加入蒸餾水,攪拌均勻,于50 ℃水浴水解提取4 h,最后5000 r/min離心15 min,取上層油脂,油脂提取率計算公式如下。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在確定蛋白酶的基礎(chǔ)上,根據(jù)楊小克[9]的方法,以料液比、反應(yīng)溫度、提取時間和加酶量為因素,以油脂提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用極差法對上述4個因素進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1料液比對提取率的影響確定蛋白酶后,在加酶量1200 U/g、反應(yīng)溫度50 ℃、提取時間4 h條件下,測定不同料液比對魷魚肝臟油脂提取率的影響。

1.2.2.2反應(yīng)溫度對提取率的影響確定蛋白酶后,在料液比1∶0.5(g/mL)、加酶量1200 U/g、提取時間 4 h條件下,測定不同反應(yīng)溫度對魷魚肝臟油脂提取率的影響。

1.2.2.3提取時間對提取率的影響確定蛋白酶后,在料液比1∶0.5(g/mL)、加酶量1200 U/g、反應(yīng)溫度50 ℃條件下,測定不同提取時間對魷魚肝臟油脂提取率的影響。

1.2.2.4加酶量對提取率的影響確定蛋白酶后,在料液比1∶0.5(g/mL)、反應(yīng)溫度50 ℃、提取時間4 h條件下,不同加酶量對魷魚肝臟油脂提取率的影響。

1.2.2.5正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以最佳提取率的蛋白酶為水解酶,選取料液比、反應(yīng)溫度、提取時間和加酶量為實(shí)驗(yàn)因素,以提取率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),采用正交實(shí)驗(yàn)方法考察各因素對魷魚肝臟油脂提取率的影響,正交因素水平表如下。

表1　正交因素水平表Table 1　Orthogonal factor level table

1.2.3脂肪酸分析

1.2.3.1甲酯化衍生取10 mg油脂,加入1 mL 5%的濃硫酸-甲醇溶液,于70 ℃水浴加熱1 h,冷卻后加1 mL正己烷,靜置分層,取上層清液經(jīng)無水硫酸鈉干燥后用于GC-MS分析。

1.2.3.2色譜條件DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),高純氦氣為載氣,采用恒壓模式,壓力0.4 MPa;進(jìn)樣量1 μL,分流比30∶1,進(jìn)樣口溫度250 ℃,檢測器溫度250 ℃,柱流量為1 mL/min。升溫程序?yàn)?00 ℃保持3 min;以16 ℃/min升溫至200 ℃,保持6 min;再以5 ℃/min升溫至240 ℃,保持5 min,整個分析過程28 min。

1.2.3.3質(zhì)譜條件GC-MS接口溫度250 ℃,EI離子源,電離能量70 eV,離子源溫度250 ℃,掃描周期2.84次/s,質(zhì)量掃描范圍m/z 50～500 u。

1.3數(shù)據(jù)處理

每個樣品平行測定3次,采用SAS 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,單因素方差分析(ANOVE,Tukey檢驗(yàn))進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),并采用Duncan’s法進(jìn)行單因子多重比較分析,p<0.05為差異性顯著,p<0.01為差異性極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1蛋白酶選擇

由圖1可知,添加蛋白酶后,魷魚肝臟油脂提取率顯著提高(p<0.05),且不同蛋白酶對魷魚肝臟油脂提取率有顯著差異(p<0.05),這是因?yàn)椴煌鞍酌缸饔糜诘鞍踪|(zhì)的位點(diǎn)和催化活力不同[10]。對于本實(shí)驗(yàn)中魷魚肝臟油脂的提取,中性蛋白酶的提取率最高(73.98%±2.10%),這與文獻(xiàn)[11-12]所得結(jié)果一致。因此,選用中性蛋白酶作為蛋白水解酶進(jìn)行單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1　不同蛋白酶對魷魚肝臟油脂提取率的影響Fig.1　The effects of proteinases on the extraction yields of squid liver oil注:不同的字母表示在(p<0.05)水平上有顯著差異,下同。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1料液比對提取率的影響由圖2可知,當(dāng)料液比為1∶0(即不加水)時,魚油提取率最高(76.99±2.99%);且隨著料液比的增大,提取率逐漸下降,這是由于魷魚肝臟自身富含水分,其水分含量高達(dá)51.97%±1.03%,在此水分條件下,底物濃度相對較高,增加了蛋白酶水解幾率,致使魷魚肝臟油脂提取率最高;但隨著料液比的增加,酶促體系中的酶濃度和底物濃度均逐漸降低,進(jìn)而影響酶促反應(yīng)速度,致使油脂提取率顯著降低(p<0.05),同時料液比過高,易使油脂發(fā)生乳化現(xiàn)象,同時溶劑過多造成浪費(fèi)并使后續(xù)離心工藝難度加大。因此魷魚肝臟油脂提取的最佳料液比為1∶0。

圖2　料液比對魷魚肝臟油脂提取率的影響Fig.2　The effects of material-to-solvent ratio on the extraction yields of squid liver oil

2.2.2反應(yīng)溫度對提取率的影響由圖3可知,在一定反應(yīng)溫度范圍內(nèi),隨著反應(yīng)溫度的增加,油脂提取率先增大,并在55 ℃時魷魚肝臟油脂提取率達(dá)到最大值(75.84%±1.57%);之后隨著反應(yīng)溫度的增加,油脂提取率略有下降。這是因?yàn)檫m當(dāng)提高反應(yīng)溫度,有利于提高蛋白酶活性,中性蛋白酶的最適溫度為55 ℃,故此時的魷魚肝臟油脂的提取率最高;繼續(xù)增加反應(yīng)溫度則會破壞中性蛋白酶的水解活力,降低魷魚肝臟油脂提取率,且反應(yīng)溫度的增加還易造成油脂氧化。因此綜合考慮油脂提取率和氧化程度,魷魚肝臟油脂提取的最佳反應(yīng)溫度為55 ℃。

圖3　反應(yīng)溫度對魷魚肝臟油脂提取率的影響Fig.3　The effects of extractiontemperature on the extraction yields of squid liver oil

2.2.3提取時間對提取率的影響由圖4可知,魷魚肝臟油脂提取率隨著提取時間的增加逐漸提高,當(dāng)提取時間4 h以后,油脂提取率趨于平緩,繼續(xù)延長提取時間對油脂提取率沒有顯著影響(p<0.05),且隨著提取時間的進(jìn)一步延長,易使油脂發(fā)生氧化作用,致使所提油脂過氧化值增加和顏色加深,影響油脂品質(zhì)。除此之外,提取時間過長還會增加工藝成本。因此為提高魷魚肝臟油脂提取效率和油脂的理化品質(zhì),魷魚肝臟油脂提取的最佳提取時間為6 h。

圖4　提取時間對魷魚肝臟油脂提取率的影響Fig.4　The effects of extraction time on the extraction yields of squid liver oil

2.2.4加酶量對提取率的影響由圖5可知,隨著加酶量的增加魷魚肝臟油脂提取率先增加后減小,當(dāng)加酶量為1800 U/g時,油脂提取率達(dá)到最大(76.15%±0.65%);繼續(xù)增大中性蛋白酶的用量,油脂提取率不再增加,并呈現(xiàn)一定的下降趨勢。這是因?yàn)檫m當(dāng)增加中性蛋白酶用量,提高了單位體積內(nèi)的中性蛋白酶濃度,增加了底物與蛋白酶的接觸幾率,促進(jìn)了酶促反應(yīng)的發(fā)生,故提取率增加;但當(dāng)中性蛋白酶濃度超過一定范圍時,致使酶促體系發(fā)生深度水解,進(jìn)而易使油脂發(fā)生乳化現(xiàn)象,增加油脂分離難度,并降低油脂提取率[13],因此魷魚肝臟油脂的最佳加酶量為1800 U/g。

圖5　加酶量對魷魚肝臟油脂提取率的影響Fig.5　The effects of enzyme amount on the extraction yields of squid liver oil

2.3正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),以中性蛋白酶為水解酶,選取料液比、反應(yīng)溫度、提取時間和加酶量為實(shí)驗(yàn)因素,以提取率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),采用正交實(shí)驗(yàn)方法考察各因素對魷魚肝臟油脂提取率的影響,實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果列于表2,其方差分析結(jié)果列于表3。

表2　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2　Design and results of orthogonal experiment

表3　正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3　Variance analysis of orthogonal experiment

注:F0.05(2,2)=19.000,F0.01(2,2)=99.000;*表示p<0.05,差異性顯著;**表示p<0.01,差異性極顯著。

由表2可知,水酶法提取魷魚肝臟油脂的過程中,各因素對油脂提取率的影響依次為:加酶量>料液比>提取時間>反應(yīng)溫度,即加酶量對油脂提取率的影響最大,料液比和提取時間次之,反應(yīng)溫度最小。表3方差結(jié)果表明,加酶量和料液比對魷魚肝臟油脂提取率有極顯著影響(p<0.01),提取時間對提取率有顯著影響(p<0.05),而反應(yīng)溫度對提取率的影響不顯著(p>0.05),優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件為A1B2C3D2,即料液比1∶0,反應(yīng)溫度55 ℃,提取時間6 h,加酶量1800 U/g;并在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),魷魚肝臟油脂提取率達(dá)到79.21%。

2.4魷魚肝臟油脂的脂肪酸組成分析

魷魚肝臟總脂經(jīng)酸甲酯化衍生處理,采用GC-MS對其脂肪酸組成進(jìn)行分析,其總離子流色譜圖見圖6;通過標(biāo)準(zhǔn)品對照和數(shù)據(jù)庫檢索對其脂肪酸進(jìn)行定性,并按峰面積歸一化法進(jìn)行定量,分析結(jié)果列于表4。

圖6　魷魚肝臟油脂脂肪酸組成的 GC-MS總離子流色譜圖Fig.6　Total ion chromatogram of fatty acid compositions of squid liver oil by GC-MS

由表4可知,從北太平洋魷魚肝臟油脂中共鑒定出21種脂肪酸,主要為C16∶0(16.27%)、C18∶1n-9(11.68%)、C20∶1n-11(12.94%)、EPA(9.81%)和DHA(23.61%);且多不飽和脂肪酸(PUFA,40.46%)>單不飽和脂肪酸(MUFA,33.31%)>飽和脂肪酸(SFA,26.23%),其中SFA以C16∶0和C18∶0為主,MUFA以C18∶1n-9和C20∶1n-11為主,而PUFA以EPA和DHA等n-3型多不飽和脂肪酸為主,兩者總含量高達(dá)33.42%,高于馬鮫魚(27.1%)[14]、竹夾魚(29.15%)[14]和鰩魚(19.70%)[15]。EPA能有效調(diào)節(jié)血脂,降低血液膽固醇,抑制血小板凝集,預(yù)防血栓和動脈硬化等心血管疾病,被稱為“血管清道夫”;DHA能有效提高免疫力,促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,提高記憶力和預(yù)防老年癡呆癥,被譽(yù)為“腦黃金”[16-17]。北太平洋魷魚肝臟油脂中富含EPA和DHA等n-3型多不飽和脂肪酸,且其∑PUFAn-3/∑PUFAn-6的比值為7.99,遠(yuǎn)高于國際糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的ΣPUFAn-3/ΣPUFAn-6日常膳食比值0.1～0.2,表明北太平魷魚肝臟油脂具有很高的營養(yǎng)價值和保健功能,可作為EPA和DHA等功能性脂肪酸的重要食藥來源[18]。

表4　魷魚肝臟總脂脂肪酸組成Table 4　Fatty acid compositions of total lipids of squid liver

3　結(jié)論

經(jīng)單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到水酶法提取北太平洋魷魚肝臟油脂的最佳條件:中性蛋白酶為水解酶,料液比1∶0(g/mL),反應(yīng)溫度55 ℃,提取時間6 h,加酶量1800 U/g;在該提取條件下,北太平洋魷魚肝臟油脂提取率為79.21%。

北太平洋魷魚肝臟油脂脂肪酸以C16∶0、C18∶1n-9、C20∶1n-11、EPA和DHA為主,且EPA和DHA兩者總含量高達(dá)33.42%,表明北太平洋魷魚肝臟油脂具有很高的營養(yǎng)價值和脂質(zhì)開發(fā)潛力,可以作為EPA和DHA等n-3型多不飽和脂肪酸的重要食藥來源。

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Aqueous enzymatic extraction of Liver oil fromOmmastrephesbartramiandits fatty acid composition analysis

XU Tong-yan,ZHANG Ru,YANG Xin-xing,YANG Wen-ge,ZHANG Jin-jie,LOU Qiao-ming*

(School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Aqueous enzymatic extraction(AEE)of liver oil fromOmmastrephesbartramiwas performed,the enzyme type,ratio of material to solvent,reaction temperature,extraction time and enzyme amount were investigated,meanwhile the fatty acid compositions of squid liver oil were analyzed by GC-MS in this paper.The single factor test and orthogonal experiment showed the optimal conditions for the aqueous enzymatic extraction of squid liver oil were as follows:neutral protease was the optimal hydrolytic enzyme,ratio of material to solvent was 1∶0(g/mL),reaction temperature was 55 ℃,extraction time was 6 h,enzyme amount was 1800 U/g and the maximum oil extraction yield(79.21%)was obtained under the optimal conditions.The main fatty acids of squid liver oil were C16∶0(16.27%),C18∶1n-9(11.68%),C20∶1n-11(12.94%),EPA(9.81%)and DHA(23.61%),and the total amount of n-3 polyunsaturated fatty acids was up to 35.97%,and the ratio of ∑n-3 PUFA to ∑n-6 PUFA was 7.99,indicating that the liver oil fromOmmastrephesbartramihad high nutritional values and development prospects,which could be used as the important dietary source of n-3 polyunsaturated fatty acids,such as EPA and DHA especially.

Ommastrephesbartrami;liver;aqueous enzymatic extraction;oil;fatty acids

2015-09-21

徐彤硯(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)脂質(zhì)化學(xué)，E-mail：281203528@qq.com。

樓喬明(1981-)，男，博士，講師，研究方向：海洋功能性脂質(zhì)，E-mail：louqm2005@163.com。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201283)；“水產(chǎn)”浙江省重中之重學(xué)科開放基金項(xiàng)目(xkzsc1531)；農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(nybjg201208)。

TS224.4

B

1002-0306(2016)09-0213-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.033