響應(yīng)面分析法優(yōu)化姬松茸多糖的脫色工藝

趙肖通,解軍波,2,*,潘炳成,魏濰璐,曾　軍,李英蕊

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134;2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室,天津 300134)

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響應(yīng)面分析法優(yōu)化姬松茸多糖的脫色工藝

趙肖通1,解軍波1,2,*,潘炳成1,魏濰璐1,曾軍1,李英蕊1

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134;2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室,天津 300134)

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化姬松茸多糖的脫色工藝。在單因素實驗基礎(chǔ)上,選取姬松茸多糖脫色過程中的上樣質(zhì)量濃度、上樣量、洗脫流速為影響因素,以姬松茸多糖脫色工藝中脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)綜合得出的歸一值(OD)為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理對姬松茸多糖脫色工藝進行響應(yīng)面法分析,優(yōu)化姬松茸多糖脫色工藝。結(jié)果表明:在上樣質(zhì)量濃度為40 mg/mL,上樣量為3 mL,洗脫流速為2 BV/h條件下脫色效果最佳。在此優(yōu)化條件下進行驗證性實驗,測得多糖脫色率(Y1)為88.5%,多糖保留率(Y2)為69.5%,其OD值為0.48,與模型預(yù)測值0.47相比,兩者誤差較小,實際驗證值與模型預(yù)測值接近,表明該優(yōu)化工藝具有良好的可行性。

響應(yīng)面分析法,姬松茸多糖,脫色工藝

姬松茸(AgaricusblazeiMurrill,ABM)又稱巴西蘑菇、巴氏蘑菇、小松菇,原產(chǎn)于南美巴西等地[1],屬于真菌界、擔(dān)子菌亞門、傘菌綱、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬[2]。ABM是一種藥食兼用的名貴真菌,其含有豐富的多糖[3]、蛋白質(zhì)[4]、脂肪[5]、植物固醇[6]、人體必需的氨基酸等活性成分,是當(dāng)今世界上可人工栽培的珍惜食用菌之一,目前廣泛種植于中國和日本。姬松茸多糖(AgaricusblazeiMurrill polysaccharide)是從優(yōu)質(zhì)姬松茸子實體中提取的具有螺旋狀三維立體結(jié)構(gòu)的一種β型葡聚糖[7],是姬松茸主要的有效活性成分之一。ABM多糖現(xiàn)已成為當(dāng)今生物醫(yī)藥研究和食品保健開發(fā)的主要對象之一,研究發(fā)現(xiàn),姬松茸多糖具有肝保護[8],抗氧化[9]、抗腫瘤[10]、降血糖、抗免疫[11-14]、抗癌[15-16]、抗病毒[17]等廣泛的藥理活性。

由于ABM多糖本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜,種類繁多,利用傳統(tǒng)工藝提取的ABM粗多糖顏色深,純度低,不利于ABM多糖在生物醫(yī)藥和食品保健藥品行業(yè)的進一步研究和開發(fā)。為了能夠更好的利用ABM多糖,需要對其進行脫色處理?；钚蕴课椒?、雙氧水法以及大孔樹脂法等方法是目前最常用的多糖脫色方法,但活性炭吸附法脫色時間長,多糖損失大,雙氧水是強氧化劑,容易對ABM多糖結(jié)構(gòu)造成破壞,影響其活性,與前兩種方法相比大孔樹脂具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、吸附速度快、比表面積大、工藝簡單、成本低等諸多優(yōu)點[18-22]。而Box-Behnken實驗設(shè)計作為國內(nèi)外近年來應(yīng)用較多的一種基于統(tǒng)計技術(shù)的優(yōu)化方法,它具有實驗次數(shù)少,精密度高,預(yù)測性好等優(yōu)點,并且已經(jīng)成功應(yīng)用于自然科學(xué)的多個領(lǐng)域。因此,本實驗通過利用大孔吸附樹脂對ABM多糖進行脫色處理,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken實驗設(shè)計對ABM多糖脫色工藝條件進行優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

姬松茸粗多糖(多糖含量40%)粉末狀干品由天津萬發(fā)祥工貿(mào)有限公司提供;D3520樹脂、D1400樹脂、S-8樹脂天津南大樹脂科技有限公司;苯酚、95%乙醇、濃硫酸和葡萄糖等均為分析純;實驗所用水均為超純水。

UV-7504單光束紫外-可見分光光度計上海欣茂儀器有限公司;UV-2550紫外掃描儀日本島津;TDA-8002恒溫水浴鍋天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;KQ-500B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;LG10-2.4A高速離心機北京醫(yī)用離心機廠;TS-100 數(shù)顯脫色搖床上海書培實驗設(shè)備有限公司;FA1004Max 100 g型電子天平上海精科天平有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1姬松茸多糖溶液的配制 稱取一定量的粉末狀A(yù)BM干品,加入適量的超純水,超聲20 min,60 ℃水浴加熱至其完全溶解,進行定容,離心,取上清液,過濾,所得濾液即為ABM多糖溶液,留以備用。

1.2.2樹脂的預(yù)處理稱取一定量的大孔吸附樹脂,放于燒杯中,用95%乙醇浸泡,低速磁力攪拌12 h,然后用超純水洗滌至洗滌液不顯混濁為止,重復(fù)操作三次,以確保使其充分溶脹,最后用超純水洗至無醇味,留以備用。

1.2.3大孔吸附樹脂的篩選 在實驗室現(xiàn)有的基礎(chǔ)上選取D3520、D1400、S-8三種不同型號的大孔吸附樹脂進行篩選。取經(jīng)過預(yù)處理的大孔吸附樹脂4.0 g,裝入250 mL的具塞錐形瓶中,然后向錐形瓶中加入濃度為30 mg/mL的ABM多糖50 mL,放置于搖床上低速振蕩吸附,3 h后過濾,得濾液[23],測定濾液脫色率和多糖保留率,對大孔吸附樹脂進行篩選。

1.2.4大孔吸附樹脂的再生及其再生后脫色能力考察對“1.2.3”實驗中的大孔吸附樹脂進行強化再生處理,其方法是向錐形瓶中加入4%的鹽酸溶液,使液面高于樹脂層10 cm左右浸泡4 h,用同樣濃度6倍體積量的鹽酸溶液進行洗滌,再用純水充分洗滌,直至洗滌液pH呈中性,然后以4%氫氧化鈉溶液按上述方法浸泡4 h,并用同樣方法洗滌6倍體積量的氫氧化鈉溶液,再用水充分進行洗滌直至洗滌液pH呈中性[24],再次根據(jù)“1.2.3”所述實驗方法投入使用,測定濾液前后的脫色率及多糖保留率,重復(fù)3次以上實驗,考察大孔吸附樹脂的再生能力。

1.2.5標準曲線的配制將葡萄糖標準品在105 ℃下烘干至恒重,精密稱取27.52 mg,加超純水溶解,定容到250 mL容量瓶中,搖勻,得到濃度為0.1108 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別配置成濃度梯度為0.01108、0.02216、0.03325、0.04432、0.0554、0.06648、0.07756、0.08864 mg/mL的標準葡萄糖溶液于試管中,分別加超純水補至1 mL,然后分別加入5%的苯酚溶液1 mL,之后快速加入濃硫酸5.0 mL,搖勻,靜置30 min。在490 nm波長測定吸光度,以1.0 mL的水按照同樣的顯色操作做空白,以葡萄糖標準溶液的濃度(C)為橫坐標,測得的吸光度值(A)為縱坐標,繪制標準曲線,得標準曲線方程:C=9.120A+0.011,葡萄糖濃度范圍為:0.01108～0.08864 mg/mL,相關(guān)性系數(shù)R2=0.997。

1.2.6多糖脫色率的測定及計算方法將ABM粗多糖溶于超純水中配制成一定濃度的溶液,在200～700 nm波長范圍內(nèi)進行可見-紫外全波長掃描,確定色素的最大吸收波長。掃描結(jié)果為:ABM粗多糖溶液在可見光區(qū)域無最大吸收波長,根據(jù)互補色原理,溶液本身所呈現(xiàn)的顏色即為它吸收的互補色,由于ABM粗多糖溶液稀釋前后的顏色均為橙黃色,可以斷定溶液主要吸收藍色波段的可見光。因此選擇處于該波段中心的450 nm波長為檢測波長,測定溶液的吸光度,并計算其脫色率[25]。

脫色率(%)=脫色前吸光度-脫色后吸光度/脫色前吸光度×100

孫子在后文中提出“兵之所加，如以碫投卵者，虛實是也”。他認為在戰(zhàn)爭中最有效的方法就是集中優(yōu)勢火力，針對對方的薄弱環(huán)節(jié)進行攻擊。因此在戰(zhàn)爭中應(yīng)當(dāng)著眼于全局，審時度勢，通過調(diào)動、牽制敵人，科學(xué)的部署自身力量，分散對方的兵力，集中自己的兵力，造成局部的以眾擊寡的態(tài)勢。在這里，合眾并不是單純數(shù)量的集中，更重要的是質(zhì)量的集中；不是兵力兵器的集中，而是戰(zhàn)斗力的凝聚；不是多多益善，而是善于調(diào)度，在短時間內(nèi)形成優(yōu)勢。在戰(zhàn)場上，形勢往往瞬息萬變，戰(zhàn)機抓不住，弱勢就會得到支援而成為強勢。所以應(yīng)當(dāng)抓住戰(zhàn)機，一擊致命。

1.2.7多糖保留率的測定及計算方法采用苯酚-硫酸法測定ABM多糖脫色前后的多糖含量[25]。

1.2.8單因素實驗對大孔樹脂脫色的影響實驗在參考文獻及大量預(yù)實驗的基礎(chǔ)上選取ABM多糖的上樣濃度、上樣量和洗脫流速三個因素對大孔樹脂脫色的影響進行研究。

表2　3種大孔吸附樹脂對ABM多糖的脫色率與多糖保留率影響Table 2　Influence of three types of macroporous resin on decolorization rate and polysaccharide retention rate

1.2.8.1上樣濃度對大孔吸附樹脂脫色的影響在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上取預(yù)處理好的D3520樹脂30 mL濕法裝柱(2.0 cm×25 cm玻璃層析柱),分別以20、30、40、50、60 mg/mL的濃度進行上樣,固定上樣量為3.5 mL,洗脫流速為3 BV/h,洗脫3 BV(1BV=30 mL)。在450 nm和490 nm波長處分別測定流出液的吸光度,并計算脫色率和測定多糖含量,計算多糖保留率。

1.2.8.2上樣量對大孔樹脂脫色的影響在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上取預(yù)處理好的D3520樹脂30 mL濕法裝柱(2.0 cm×25 cm玻璃層析柱),分別以2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL的上樣量進行上樣,固定上樣濃度為40 mg/mL,洗脫流速為3 BV/h,洗脫3 BV(1 BV=30 mL)。在450 nm和490 nm波長處分別測定流出液的吸光度,并計算脫色率和測定多糖含量,計算多糖保留率。

1.2.8.3洗脫流速對大孔樹脂脫色的影響在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上取預(yù)處理好的D3520樹脂30 mL濕法裝柱(2.0 cm×25 cm玻璃層析柱),分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進行洗脫,固定上樣濃度為40 mg/mL,上樣量為3.5 mL,洗脫3 BV(1 BV=30 mL)。在450 nm和490 nm波長處分別測定流出液的吸光度,并計算脫色率和測定多糖含量,計算多糖保留率。

1.2.9響應(yīng)面實驗設(shè)計方案在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取上樣濃度(X1),上樣量(X2),洗脫流速(X3)為響應(yīng)因素,以ABM多糖脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)綜合得出的歸一值(OD)為響應(yīng)值[26]。采用Box-Behnken實驗[27]和響應(yīng)面分析法,通過Design-expert 8.0.6軟件,設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面實驗,篩選最佳脫色條件。實驗設(shè)計因素水平見表1。

表1　響應(yīng)面分析法的因素水平編碼表Table 1　Factors and levels used in response surface methodology

1.2.10數(shù)據(jù)處理與分析將各指標的最佳測定值定為滿分,然后根據(jù)正比和反比關(guān)系將各值轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的百分比,以ABM多糖脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)為指標,根據(jù)各指標的重要性,確定其權(quán)重系數(shù)[28],按照綜合評判公式:歸一值[28]OD=Mα/Y1+Nβ/Y2,其中,M、N分別為ABM多糖脫色率(Y1)、多糖保留率(Y2)的權(quán)重系數(shù),M、N的值均為0.5,α為17個ABM多糖脫色率中最小值,β為17個多糖保留率中最小值。

2　結(jié)果與分析

2.1大孔吸附樹脂的篩選

2.2D3520大孔吸附樹脂再生后脫色效果的研究

大孔吸附樹脂在反復(fù)使用后,樹脂表面及內(nèi)部會殘留許多非吸附性成分或雜質(zhì),使大孔樹脂的顏色變深,柱效降低,因而對其進行再生[29-30]。表3表明,在相同條件下,再生的D3520大孔吸附樹脂脫色能力能達到新生D3520樹脂的96%以上,在多糖保留率方面有部分升高,這可能是由于大孔吸附樹脂使用過后會產(chǎn)生部分死體積而造成脫色能力下降,對部分多糖的吸附能力降低導(dǎo)致多糖保留率升高[31]。以上結(jié)果表明,D3520大孔吸附樹脂在再生和對物質(zhì)脫色過程中具有良好的實用價值。

表3　D3520大孔吸附樹脂再生對多糖脫色效果Table 3　Effect of the D3520 macroporous resin regeneration for decolorization of polysaccharides

2.3單因素實驗結(jié)果

2.3.1上樣質(zhì)量濃度對脫色效果的影響在一定的洗脫流速和上樣量條件下,以不同上樣質(zhì)量濃度的多糖溶液(10、20、30、40、50 mg/mL)進行脫色實驗,結(jié)果如圖1所示。隨著上樣質(zhì)量濃度的增加,脫色率呈降低趨勢,在上樣質(zhì)量濃度為30～40 mg/mL范圍內(nèi)脫色率急劇下降,這可能與大孔樹脂與ABM多糖色素的接觸面飽和從而使大孔樹脂的吸附能力降低有關(guān),說明樹脂有足夠大的處理量[30];隨著上樣質(zhì)量濃度的增加多糖保留率逐漸增加,在20～30 mg/mL增加較為明顯,這可能是因為在20～30 mg/mL濃度范圍內(nèi)大孔吸附樹脂對部分多糖的吸附能力達到極值,從而導(dǎo)致多糖保留率快速升高[30]。因此綜合考慮脫色率和多糖保留率,選擇30 mg/mL 為ABM多糖脫色的較適宜上樣質(zhì)量濃度。

圖1　上樣質(zhì)量濃度對脫色效果的影響Fig.1　Influence of sample concentration on the decolorization rate

2.3.2上樣量對脫色效果的影響在一定的洗脫流速和上樣質(zhì)量濃度條件下,以不同的多糖溶液上樣量(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL)進行脫色實驗,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)濃度一定時,隨著上樣量的增加,脫色率呈降低趨勢,且在上樣量為3.5～4.5 mL范圍內(nèi)脫色率急劇下降,這可能是由于上樣量達到樹脂的最大的處理量,從而導(dǎo)致脫色效率降低[32];隨著上樣質(zhì)量濃度的增加多糖保留率逐漸增加,在3.0～3.5 mL增加較為明顯。綜合考慮脫色率和多糖保留率,選擇3.5 mg/mL 為ABM多糖脫色的較適宜上樣量。

圖2　上樣量對脫色效果的影響Fig.2　Influence of sample volume on the decolorization effect rate

2.3.3洗脫流速對脫色效果的影響在上樣量和上樣質(zhì)量濃度一定的條件下,以不同的洗脫流速(1、2、3、4、5 BV/h)進行脫色實驗,結(jié)果如圖3所示。隨著洗脫流速的增加,脫色率呈降低趨勢,在洗脫流速為3～4 BV/h范圍內(nèi)脫色率急劇下降,這可能是由于流速的增加使大孔樹脂對ABM多糖色素的接觸時間縮短從而使大孔樹脂的吸附能力降低有關(guān)[22];隨著洗脫流速的增加多糖保留率也逐漸增加,在3～4 BV/h范圍內(nèi)增加較為明顯,這可能是由于多糖流速快能夠縮短上柱液中多糖在樹脂床中的擴散,使其快速流出樹脂柱,從而提高了多糖保留率[33]。綜合考慮脫色率和多糖保留率,選擇3 BV/h 為ABM多糖脫色的較適宜洗脫流速。

圖3　洗脫流速對脫色效果的影響Fig.3　Influence of elution flow rate on the decolorization effect rate

2.4響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

2.4.1Box-Behnken實驗結(jié)果根據(jù)表1中的因素與水平值,按照Box-Behnken響應(yīng)曲面法設(shè)計實驗方案,共17個實驗點,其中12組為析因點,5組為零點,每個實驗組均進行平行實驗用以減少實驗誤差。其實驗結(jié)果見表4。

表4　響應(yīng)面法的實驗設(shè)計與結(jié)果表Table 4　Experimental design for response surface analysis and corresponding experimengtal data

2.4.2擬合模型的建立及顯著性分析通過統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0.6對表4中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析,建立二次響應(yīng)面回歸模型,根據(jù)本研究內(nèi)容確定由ABM多糖脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)綜合得出的歸一值(OD)為優(yōu)化指標,其權(quán)重系數(shù)依次為:0.5、0.5,由此得出ABM多糖脫色工藝的二次多項回歸方程:

表5　回歸模型方差分析Table 5　Analysis of variance for the regression model for adsorption capacity

注:*.差異顯著(p<0.05);**.差異極顯著(p<0.01)。

OD=0.55-0.096X1-0.013X2+0.024X3+0.030X1X2-0.033X1X3-0.030X2X3+0.034X12+0.022X22-7.5×10-4X32

為檢驗ABM多糖脫色工藝的回歸方程有效性,對回歸模型進行方差分析及顯著性檢驗,結(jié)果見表5。由表5可知,該模型的擬合度達極顯著水平(p<0.01),模型相關(guān)系數(shù)(R2=0.9724)較高,失擬項不顯著,表明該回歸模型擬合程度良好,實驗誤差小,可用此模型方程預(yù)測ABM多糖脫色工藝的結(jié)果。

由表5對該回歸模型方程方差分析的結(jié)果表明:上樣質(zhì)量濃度(X1)和洗脫流速(X3)對ABM多糖脫色工藝的研究影響顯著,上樣量(X2)對ABM多糖脫色工藝的研究影響較不顯著。各因素對ABM多糖脫色工藝研究的影響大小順序依次為:上樣質(zhì)量濃度(X1)>洗脫流速(X3)>上樣量(X2)。

2.4.3兩因素間的交互效應(yīng)分析通過Design-Expert 8.0設(shè)計軟件得到響應(yīng)面和等高線圖(圖4)。根據(jù)響應(yīng)面實驗的設(shè)計原理及分析,三維響應(yīng)面圖彎曲度越大,表示兩因素間越顯著,由此能有效的反映出各因素之間的交互作用對響應(yīng)值OD的影響[34]。比較圖4中3組圖可知,上樣質(zhì)量濃度(X1)和上樣量(X2)、上樣質(zhì)量濃度(X1)和洗脫流速(X3)、上樣量(X2)和洗脫流速(X3)兩兩水平之間交互作用對ABM多糖脫色工藝的研究具有顯著影響。

圖4　各因素交互作用對ABM多糖脫色工藝影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface plots for interactive effects of Optimizing formulation of Agaricus Blazei Murill polysaccharide decoloration technology

2.4.4響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件驗證在所選實驗因素范圍內(nèi),對響應(yīng)面法實驗設(shè)計結(jié)果進行優(yōu)化分析,計算得到回歸方程模型在X1=1,X2=-1,X3=-1時取得最小值,即最優(yōu)脫色工藝條件為上樣質(zhì)量濃度40 mg/mL,上樣量3 mL,洗脫流速2 BV/h。在此優(yōu)化條件下進行驗證性實驗,測得多糖脫色率(Y1)為88.5%,多糖保留率(Y2)為69.5%,其OD值為0.48。模型預(yù)測值為0.47,理論預(yù)測值與實際測得值相比,其相對誤差為2.13%,說明本實驗建立的二次多項回歸方程模型能夠很好地預(yù)測各因素與效應(yīng)面之間的變化關(guān)系。

3　結(jié)論

在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計,利用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析,以上樣質(zhì)量濃度,上樣量,洗脫流速為響應(yīng)變量,選取ABM多糖的脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)綜合得出的歸一值(OD)為響應(yīng)值,得到二次線性回歸方程的預(yù)測模型,所得回歸模型能夠較好地反映出各因素水平與響應(yīng)值之間的關(guān)系,對ABM多糖脫色工藝進行了優(yōu)化,得到脫色工藝為上樣質(zhì)量濃度40 mg/mL,上樣量3 mL,洗脫流速2 BV/h,在此條件下進行實驗,測得多糖脫色率(Y1)為88.5%,多糖保留率(Y2)為69.5%,表明經(jīng)響應(yīng)面法實驗優(yōu)化的工藝條件具有實用價值。

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Optimization decoloration process ofAgaricusBlazeiMurill polysaccharide by response surface methodology

ZHAO Xiao-tong1,XIE Jun-bo1,2,*,PAN Bing-cheng1,WEI Wei-lu1,ZENG Jun1,LI Ying-rui1

(1.School of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China;2.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,Tianjin 300134,China)

Response surface methodology was utilized to optimize the decoloration process ofAgaricusBlazeiMurill(ABM)polysaccharide.Based on single factor test,the mass concentration of sample,sample volume and elution flow rate of ABM polysaccharide decoloration process were selected as influential factors.A three-variable,three-level Box-Behnken experiment design was combined with response surface analysis.And the normalized values(OD)of ABM polysaccharide decoloration process of decolorization rate and polysaccharide retention rate was selected as the response value.The results indicated that the optimal decoloration process conditions were determined as 40 mg/mL,3 mL and 2 BV/h for sample mass concentration,sample volume and elution flow rate,respectively.Under these conditions,the decolorization rate was 88.5% and polysaccharide retention rate was 69.5%,the predicted values of the model was 0.47 and the normalized values(OD)of actual value was 0.48,which showed a small error between both.Thus,the newly optimized decoloration process conditions are feasible.

response surface methodology;AgaricusBlazeiMurill polysaccharide;decoloration process

2015-11-05

趙肖通(1990-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：食品加工與貯藏，E-mail：zxtnew@163.com。

解軍波(1975-)，男，博士，教授，研究方向：天然活性物質(zhì)，E-mail：xjbo@tjcu.edu.cn。

國家星火計劃重大項目(2012GA610002)；天津市科技支撐計劃重點項目(12ZCZDNC01400)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)09-0207-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.032