一種深海微生物脂肪酶在非水介質(zhì)中催化合成乙酸肉桂酯的應(yīng)用研究

王召賀,張　云,孫愛君,楊再昌,胡云峰,*

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.中國科學(xué)院南海海洋研究所,熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室,廣東廣州 510301;3.中國科學(xué)院南海海洋研究所,廣東省海洋藥物重點實驗室,廣東廣州 510301)

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一種深海微生物脂肪酶在非水介質(zhì)中催化合成乙酸肉桂酯的應(yīng)用研究

王召賀1,張云2,3,孫愛君2,3,楊再昌1,胡云峰2,3,*

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.中國科學(xué)院南海海洋研究所,熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室,廣東廣州 510301;3.中國科學(xué)院南海海洋研究所,廣東省海洋藥物重點實驗室,廣東廣州 510301)

從一株深海來源微生物Streptomycessp.SCSIO 13580的基因組中克隆了1個序列新穎的脂肪酶編碼基因,含有1005個堿基,編碼334個氨基酸,與最相近的蛋白有51%相似。在大腸桿菌中異源表達(dá)了這個脂肪酶,發(fā)現(xiàn)其具有在非水介質(zhì)中催化合成乙酸肉桂酯的活性。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,考察了?；w、溶劑、肉桂醇/乙酸乙烯酯摩爾濃度之比、溫度等因素對該酶合成乙酸肉桂酯的活性的影響,得到的最佳反應(yīng)條件是:以乙酸乙烯酯為?；w,以正己烷為溶劑,肉桂醇/乙酸乙烯酯的摩爾濃度之比為1∶6,反應(yīng)溫度為40 ℃,優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化率達(dá)到48.3%,酶粉的酶活力為5.59 U/g。

脂肪酶,轉(zhuǎn)酯反應(yīng),乙酸肉桂酯,肉桂醇,乙酸乙烯酯

乙酸肉桂酯是我國規(guī)定可使用的香料之一,可從肉桂精油中提取,是一種重要的食用香料,可用于配制果味香精[1]。目前乙酸肉桂酯可從天然植物中提取,由化學(xué)法通過酯化或轉(zhuǎn)酯反應(yīng)合成[2]以及生物催化法合成[3]。但從天然植物中提取的量極少,不能滿足需要;化學(xué)法的副反應(yīng)復(fù)雜,反應(yīng)條件劇烈,后續(xù)提取工藝繁瑣,對設(shè)備要求高,環(huán)境污染大[4]。生物催化法的反應(yīng)條件溫和、效率高、專一性強、對環(huán)境友好,可以克服化學(xué)法的上述缺點[5]。

表1　PCR擴增體系Table 1　PCR amplification system

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又稱甘油酯水解酶,是一類特殊的酯鍵水解酶,能夠催化酯化、酯水解、醇解、轉(zhuǎn)酯等多種反應(yīng)[6],在油水界面可催化脂肪分解為甘油和脂肪酸,在非水介質(zhì)中則催化甘油和脂肪酸合成脂肪[7]。脂肪酶具有界面活化現(xiàn)象,在油水界面的催化活性會得到顯著提高[8]。1984年,Zaks發(fā)現(xiàn)酶在有機相中也具有催化活性,改變了“酶只能在水相中進(jìn)行催化”的傳統(tǒng)觀念,開啟了非水相酶學(xué)的時代,酶的應(yīng)用范圍也得到了極大擴展[9]。

本研究用基因工程手段克隆出來自深海鏈霉菌Streptomycessp.13580基因組中的脂肪酶L-1基因,并實現(xiàn)了該酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)。利用脂肪酶L-1的酶粉在非水介質(zhì)中合成乙酸肉桂酯,并對非水介質(zhì)中合成乙酸肉桂酯的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。使用深海微生物來源的脂肪酶催化制備香料產(chǎn)品乙酸肉桂酯是綠色的生產(chǎn)過程,具有反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境污染小、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)勢。本研究為采用深海微生物脂肪酶進(jìn)一步催化制備乙酸肉桂酯等重要工業(yè)香料的應(yīng)用奠定了較好的工作基礎(chǔ),為有效利用海洋微生物酶資源提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株Streptomyces sp.SCSIO 13580由中國科學(xué)院南海海洋研究所實驗船從南海采集;基因組測序由上海美吉生物科技有限公司完成。

LB發(fā)酵培養(yǎng)基含有10% NaCl、10%胰蛋白胨、5%酵母提取粉;固體培養(yǎng)基除上述成分外,還有15%的瓊脂,兩種培養(yǎng)基在使用前均在高溫滅菌鍋中121 ℃下滅菌20 min。

胰蛋白胨、酵母提取粉廣州環(huán)凱微生物科技有限公司;正己烷、乙醇、乙酸、乙酸乙酯、乙腈、NaCl廣州化學(xué)試劑廠;DMSO(二甲基亞砜)天津市大茂化學(xué)試劑廠;丙酮、甲苯成都市科龍化工試劑廠;乙酸仲丁酯、肉桂醇北京百靈威科技有限公司;乙酸乙烯酯、環(huán)己烷、十二烷上海阿拉丁生化科技有限公司;PCR所用試劑上海捷瑞生物工程有限公司;鎳柱、脫鹽柱GE醫(yī)療集團(tuán)。

Aeris型PCR儀新加坡ESCO公司;超低溫冰箱SANYO公司;SCIENTZ-IID型超聲破碎儀;SCIENTZ-10N型冷凍干燥機寧波新芝生物公司;GC-MS-QP2010 Ultra型GC-MS(氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀)島津公司;Allegra X-30R Centrifuge型低溫離心機Beckman公司;Microfuge 16型微型離心機Beckman公司;MLS-3781L-PC型高壓滅菌鍋SANYO公司;DJS-2012R型搖床上海世平實驗設(shè)備公司。

1.2實驗方法

1.2.1目的基因的擴增和連接菌株的總DNA測序完成后,用生物信息學(xué)方法對其中一種脂肪酶L-1編碼基因進(jìn)行邊界確定和引物設(shè)計,引物序列為:

F:5′-CACGGATCCATGAGGATCGATCCGCCCG-3′(下劃線為BamH I酶切位點)

R:5′-CATCTCGAGTTAGGCGGGCTGTGGGGTC-3′(下劃線為XhoI酶切位點)

由上海生工生物技術(shù)有限公司來合成所需引物,用合成的引物進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增體系如表1所示:

PCR擴增程序為:①95 ℃變性5 min;②95 ℃變性30 s;③65 ℃退火30 s;④72 ℃延伸2 min,②到④循環(huán)30次;⑤72 ℃延伸10 min;⑥降溫至18 ℃。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中用120 V電壓進(jìn)行電泳20 min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增情況,切膠回收1000 bp左右的片段。

用BamH I和XhoI酶切回收產(chǎn)物和pET-28a(+)載體,按5∶1的比例用T4連接酶催化連接20 min后,轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,冰上放置30 min,42 ℃水浴熱激50 s,冰上放置2 min,加入300 μL液體培養(yǎng)基,37 ℃ 200 r/min條件下培養(yǎng)1 h。4000 r/min離心1 min,棄去大部分上清液,保留100 μL左右,混合均勻,涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上。37 ℃培養(yǎng)16 h后挑取單菌落,經(jīng)酶切和測序驗證無誤則表明連接成功[10]。

1.2.2目的蛋白的表達(dá)和酶粉的制備將1 μL連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)入方法與轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞的方法相同。將平板上的單菌落接種到試管中,37 ℃培養(yǎng),待OD600值達(dá)到0.5左右時,加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)其表達(dá),25 ℃培養(yǎng)16 h,4 ℃ 4000 r/min離心1 min,收集菌體,加入100 μL非變性蛋白裂解液裂解細(xì)胞,用SDS-PAGE凝膠檢驗蛋白表達(dá)情況[11]。

驗證表達(dá)成功后,將菌種接種到300 mL液體培養(yǎng)基中,用同樣的方法培養(yǎng)并誘導(dǎo)其表達(dá),4 ℃ 8000 r/min離心15 min,收集菌體,用20 mLPBS緩沖液(20 mmol/L,pH7.4)懸浮菌體,超聲破碎15 min,4 ℃ 4000 r/min離心15 min,收集上清液,將一部分上清液冷凍于-80 ℃冰箱中,24 h后凍干制成酶粉[12]。

1.2.3目的蛋白的純化用1.2.2的方法將菌體破碎,收集上清液,加入10 mL至鎳柱中,鎳柱上清液與鎳柱結(jié)合后,先用20 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白,再用5 mL 500 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白[13],收集中間的3 mL洗脫液,用脫鹽柱SephadexG25按廠家說明書的方法脫鹽。用SDS-PAGE凝膠電泳檢驗蛋白純化和脫鹽情況。

1.2.4乙酸肉桂酯的合成反應(yīng)在20 mL反應(yīng)瓶中進(jìn)行,將0.1 mol/L的肉桂醇和0.2 mol/L的乙酸乙烯酯溶解到5 mL正己烷中,加入30 mg脂肪酶L-1酶粉,在搖床上以200 r/min轉(zhuǎn)速,37 ℃反應(yīng)24 h后取出部分樣品進(jìn)行檢測[14]。肉桂醇與乙酸乙烯酯的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的反應(yīng)式如下:

圖1　脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯Fig.1　Lipase-catalyzed synthesis of cinnamyl acetate

1.2.5產(chǎn)物的檢測反應(yīng)后的液體取出1 mL左右,12000 r/min離心1 min除去酶粉,加入0.1 mmol/L的十二烷作為內(nèi)標(biāo)物,混合均勻后,加入無水硫酸鈉除去水分,取出600 μL用于GC-MS檢測[15]。色譜柱RXI-5MS,進(jìn)樣口溫度220 ℃,進(jìn)樣方式:分流,柱流量:1.20 mL/min,離子源溫度200 ℃,接口溫度280 ℃。柱箱溫度50 ℃,恒溫保持1 min,以12 ℃/min的速率上升到150 ℃,再以20 ℃/min的速率上升到300 ℃,恒溫保持1 min。底物肉桂醇和產(chǎn)物乙酸肉桂酯的出峰時間分別為8.250 min、9.600 min。

1.2.6轉(zhuǎn)化率的測定采用十二烷為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量計算。反應(yīng)完成后,加入0.1 mol/L的十二烷,轉(zhuǎn)化率(%)=肉桂醇的消耗量/肉桂醇的起始物質(zhì)的量×100[16]。定義每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol的底物所需要的酶量為1個酶活單位。

1.2.7?；w的選擇分別用乙酸、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸仲丁酯作為?；w進(jìn)行反應(yīng),其他條件與1.2.4相同。24 h后,用1.2.5的方法檢測反應(yīng)產(chǎn)物,用肉桂醇轉(zhuǎn)化率最高的酰基供體進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.8溶劑的選擇分別以正己烷、正庚烷、環(huán)己烷、甲苯、丙酮、DMSO、乙酸乙烯酯為溶劑,用1.2.7中選擇的?；w進(jìn)行反應(yīng),其他條件與1.2.7相同。24 h后,用1.2.5的方法檢測反應(yīng)產(chǎn)物,用肉桂醇轉(zhuǎn)化率最高的有機溶劑進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.9底物濃度比例對轉(zhuǎn)化率的影響用1.2.8中選擇的有機溶劑為溶劑,分別以肉桂醇與?；w摩爾濃度比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的比例溶解于溶劑中,其他條件與1.2.8相同。24 h后,用1.2.5的方法檢測反應(yīng)產(chǎn)物,考察底物濃度比例對肉桂醇轉(zhuǎn)化率的影響,選擇適當(dāng)?shù)谋壤?/p>

1.2.10溫度對轉(zhuǎn)化率的影響用1.2.9中選擇的底物濃度比例,分別在25、30、35、40、45、50、55 ℃環(huán)境下反應(yīng),其他條件與1.2.9相同。24 h后,用1.2.5的方法檢測反應(yīng)產(chǎn)物,以肉桂醇轉(zhuǎn)化率最高的溫度為最優(yōu)溫度。

2　結(jié)果與討論

2.1目的蛋白的表達(dá)和純化

脂肪酶來源廣泛,在微生物中就有65個屬可用于脂肪酶的生產(chǎn)。但對于特定催化反應(yīng)而言,可用的脂肪酶就很有限,新型脂肪酶的挖掘就成為許多學(xué)者研究的熱點[17]。海洋面積遼闊,具有高壓、高鹽、低溫等多種生態(tài)環(huán)境,蘊藏著豐富的微生物資源,海洋微生物也成為結(jié)構(gòu)、功能新穎的脂肪酶的重要來源[18]。將脂肪酶L-1的氨基酸序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)其與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)的最大相似度為51%,序列較為新穎。生物信息學(xué)方法預(yù)測,脂肪酶L-1編碼基因由1005個堿基組成,對應(yīng)著蛋白序列含有334個氨基酸殘基,理論分子量為35.24 ku,pI為5.07。SDS-PAGE凝膠檢測結(jié)果如圖2。鎳柱純化、脫鹽柱脫鹽得到的單一條帶與重組蛋白大小一致,條帶清晰,表明脂肪酶L-1具有可溶性,帶有的組氨酸標(biāo)記能夠與鎳柱特異性結(jié)合,可以用親和層析的方法得到純酶[19]。

圖2　脂肪酶L-1純化、 脫鹽的SDS-PAGE凝膠Fig 2　SDS-PAGE gel of purification and desalination of lipase L-1注:1-蛋白分子量標(biāo)記;2-IPTG誘導(dǎo)前的總蛋白對照; 3-IPTG誘導(dǎo)后的總蛋白對照;4-IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞上清液; 5-鎳柱穿透液;6-鎳柱純化蛋白;7-脫鹽蛋白。

2.2脂肪酶L-1催化合成乙酸肉桂酯

圖3為反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS檢測的氣相色譜圖,其初步轉(zhuǎn)化率為23.7%。為獲得更高的轉(zhuǎn)化率,需對該反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化,提高乙酸肉桂酯的產(chǎn)率。姚俠等[20]用Novozyme435催化合成乙酸肉桂酯,轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上;Yadav等[3]用同樣的酶催化,也得到了較高的轉(zhuǎn)化率;劉昱杉等[4]用固定化的熒光假單胞菌脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng),也得到了較高的產(chǎn)率。目前的用生物催化的方法制備乙酸肉桂酯具有較好的可行性。

2.3?；w的選擇

不同的?；w與肉桂醇反應(yīng)的速率不同,因此?；w的選擇對產(chǎn)物乙酸肉桂酯的合成效率有重要影響。耿博[5]以脂肪酶為催化劑,乙酸、乙酸乙酯為?；w,劉昱杉等[4]以固定化的脂肪酶為催化劑,乙酸乙烯酯為?；w,均得到較高的產(chǎn)率。Wang等[21]用化學(xué)法以乙酸仲丁酯為?；w,與甲醇通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備仲丁醇。因此,選擇不同的?；w是酶法和化學(xué)法通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備酯類化工產(chǎn)品的重要因素。本研究中,用乙酸、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸仲丁酯作為?；w分別和肉桂醇反應(yīng),肉桂醇濃度為0.1 mol/L,酰基供體濃度為0.2 mol/L,以正己烷為溶劑,反應(yīng)24 h后,用GC-MS檢測反應(yīng)產(chǎn)物,選用轉(zhuǎn)化率最高的作為?；w。結(jié)果如圖4所示,用乙酸乙烯酯作為?；w時,肉桂醇的轉(zhuǎn)化率為23.9%,明顯高于其他?；w。乙酸仲丁酯可能是由于烷氧基的空間效應(yīng)而不被催化。姚俠等[20]用脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯時同樣發(fā)現(xiàn),以乙酸乙烯酯作為?；w時,肉桂醇的轉(zhuǎn)化率最高,并且推測這可能是由于乙酸乙烯酯的產(chǎn)物乙醛是氣體,能夠及時分離出反應(yīng)體系,促使反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行。

表2　有機溶劑及其LogP值Table 2　Organic solvents and their LogPs

圖3　轉(zhuǎn)酯反應(yīng)產(chǎn)物的氣相色譜圖Fig.3　Gas chromatogram of trans-esterification reaction product 注:十二烷,保留時間:8.385 min;肉桂醇,保留時間: 9.799 min;乙酸肉桂酯,保留時間:11.022 min。

圖4　不同酰基供體對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4　Effects of aclyl donors on the synthesis of cinnamyl acetate

2.4溶劑的選擇

作為酶促反應(yīng)的介質(zhì),有機溶劑對酶的催化活性和穩(wěn)定性有重要影響。在有機相中,酶的催化活性與溶劑的疏水性(LogP)有很大關(guān)系,親水性溶劑易于奪取酶分子表面的水分子,影響酶的活性,而疏水性強的溶劑則相反,對酶活性的影響要小[22]。以乙酸乙烯酯為?；w,分別以正己烷、正庚烷、環(huán)己烷、甲苯、丙酮、DMSO、乙酸乙烯酯為溶劑進(jìn)行比較,它們的疏水性如表2所示,LogP值越高,疏水性越高。從表中可以看出,正己烷、正庚烷等烴類的疏水性要高于丙酮、DMSO和乙酸乙烯酯。每種有機溶劑中的轉(zhuǎn)化率如圖5所示,以正己烷為溶劑時,肉桂醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到31.1%,高于其他溶劑。從結(jié)果上看,疏水性較高的幾個溶劑的轉(zhuǎn)化率均比疏水性較低的丙酮和DMSO要高;推測乙酸乙烯酯對該脂肪酶有底物抑制效應(yīng),所以用乙酸乙烯酯作為溶劑時的轉(zhuǎn)化率偏低[23]。

圖5　溶劑對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5　Effects of solvent on the synthesis of cinnamyl acetate

2.5底物濃度比例對轉(zhuǎn)化率的影響

底物的濃度比例會影響反應(yīng)進(jìn)行的速率和方向,高濃度的乙酸乙烯酯將提高底物與底物之間、底物與酶之間的接觸面積,增加分子碰撞的幾率;但另一方面,肉桂醇濃度減少使反應(yīng)體系的粘度增加,酶的活性中心被覆蓋,阻礙反應(yīng)的進(jìn)行,同時會增加后續(xù)提取產(chǎn)物的難度[24],因此有必要通過比較來確定最佳底物摩爾濃度比例。用不同底物濃度比例反應(yīng)的結(jié)果如圖6所示,隨著比例的增加,轉(zhuǎn)化率提高,當(dāng)肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾濃度比為1∶6時,肉桂醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到26.4%,提高乙酸乙烯酯的濃度,肉桂醇轉(zhuǎn)化率增長較小,為了便于后期分離純化,避免不必要的浪費,選用1∶6的比例進(jìn)行后面的實驗。

圖6　肉桂醇/乙酸乙烯酯摩爾濃度比對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6　Effects of cinnamyl alcohol/vinyl acetate ratio on the synthesis of cinnamyl acetate

2.6溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

溫度是影響反應(yīng)速率和反應(yīng)方向的重要因素,適當(dāng)提高反應(yīng)溫度能夠提高分子的熱運動,增加底物之間相互反應(yīng)的機會,降低體系的粘度,提高反應(yīng)速率,進(jìn)而提高底物轉(zhuǎn)化率;但過高的溫度會破壞酶的三級結(jié)構(gòu),降低酶活性,甚至使酶完全失活,又會降低反應(yīng)速率和底物轉(zhuǎn)化率[25],所以反應(yīng)溫度的選擇就顯得十分必要。用不同溫度進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)果如圖7所示,40 ℃時,肉桂醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到48.3%,高于其他溫度,高于40 ℃時,轉(zhuǎn)化率降低,但趨于穩(wěn)定。

圖7　溫度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7　Effects of temperature on the synthesis of cinnamyl acetate

3　結(jié)論

深海微生物是新穎優(yōu)異脂肪酶的重要來源,對海洋微生物資源的利用已引起了越來越多的重視。本研究從深海微生物的基因組出發(fā),用基因工程手段,克隆并異源表達(dá)了一個新穎的脂肪酶基因L-1,用酶粉在有機相中催化轉(zhuǎn)酯合成乙酸肉桂酯。使用單因素實驗方法對脂肪酶L-1催化合成乙酸肉桂酯的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。從GC-MS檢測的結(jié)果來看,使用脂肪酶L-1催化制備乙酸肉桂酯香料的最優(yōu)反應(yīng)條件為:以正己烷為溶劑,乙酸乙烯酯為?；w,肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾濃度比為1∶6,反應(yīng)溫度為40 ℃,肉桂醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到48.3%。脂肪酶L-1序列新穎,有很大的潛力可對其通過定向進(jìn)化等手段進(jìn)行改造,或通過對其發(fā)酵條件、反應(yīng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化來提高其轉(zhuǎn)化率,使其更適應(yīng)工業(yè)要求。采用深海微生物來源的脂肪酶催化制備乙酸肉桂酯產(chǎn)品是綠色環(huán)保的生產(chǎn)工藝,反應(yīng)條件溫和,制備的乙酸肉桂酯產(chǎn)品質(zhì)量較高,所采用的深海微生物脂肪酶催化高效制造乙酸肉桂酯等香料產(chǎn)品,有希望替代現(xiàn)有的化學(xué)合成工藝,具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景,希望能夠為更好地利用海洋微生物酶資源提供一種方法和思路。

[1]陳海燕,何春茂.肉桂油的深加工產(chǎn)品及其應(yīng)用[J].廣西林業(yè)科學(xué),2009,38(3):179-182.

[2]Tomke P,Rathod V.Ultrasound assisted lipase catalyzed synthesis of cinnamyl acetate via transesterification reaction in a solvent free medium[J].Ultrasonics Sonochemistry,2015(27):241-246.

[3]Yadav G D,Devendran S.Lipase catalyzed synthesis of cinnamyl acetate via transesterification in non-aqueous medium[J].Process Biochemistry,2012,47(3):496-502.

[4]劉昱杉,胡興超,叢方地,等.熒光假單胞菌脂肪酶(PFL)的固定化及催化合成乙酸肉桂酯[J].中國食品添加劑,2015(6):140-144.

[5]耿博.脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯的應(yīng)用研究[D].天津:天津大學(xué),2012:1-64.

[6]Kretza E,Papaneophytou C,Papi R,et al.Lipase Activity in Thermus thermophilus HB8:Purification and Characterization of the Extracellular Enzyme[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2012(17):512-525.

[7]Kim S,Song J,Kin H.Cell surface display of Staphylococcus haemolyticus L62 lipase in Escherichia coli and its application as a whole cell biocatalyst for biodiesel production[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2013(97):54-61.

[8]何文龍. 脂肪酶工程菌優(yōu)化表達(dá)[D].長春:吉林大學(xué),2010:1-50.

[9]Zaks A,Klibanov A M.Enzyme catalyzed processes in organic media at 100 ℃[J].Abstracts of Papers of the American Chemical Society,1984(188):1249-1251.

[10]Mirkalantari S,Amirmozafari N,Kazemi B,et al.Molecular cloning of virB12 gene of Brucella melitensis 16M strain in pET28a vector[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine,2012,5(7):511-513.

[11]季愛加,寧喜斌.原核表達(dá)載體pET28a-EGFP的構(gòu)建與表達(dá)[J].微生物學(xué)雜志,2011,31(04):69-73.

[12]Castillo B,Delgado Y,Barletta G,et al.Enantioselective transesterification catalysis by nanosized serine protease subtilisin Carlsberg particles in tetrahydrofuran[J].Tetrahedron,2010,66:2175-2180.

[13]劉羽,王能飛,黃亦鈞,等.低溫脂肪酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究[J].海洋科學(xué)進(jìn)展,2012,01:155-162.

[14]劉雄民,郭辰,沈芳,等.脂肪酶干燥方法對環(huán)十五內(nèi)酯合成的影響[J].廣西大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2007,02:130-133.

[15]蔡君,譚群,晏家瑛,等.不同提取工藝下蜂膠醇提物的GC-MS分析[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26(5):544-550.

[16]Wu Z J,Qi W,Wang M F,et al.Lipase immobilized on novel ceramic supporter with Ni activation for efficient cinnamyl acetate synthesis[J].Journal of Molecular Catalysis.B,Enzymatic,2014,110:32-38.

[17]劉虹蕾,繆銘,江波,等.微生物脂肪酶的研究與應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技,2012,12:376-381.

[18]史翠娟,閆培生,趙瑞希,等.海洋微生物酶研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2015,5(3):185-190.

[19]黃振蓉,吳海麗,張三軍,等.E.coliRecQ解旋酶克隆表達(dá)純化及生物學(xué)活性檢測[J].中國生物工程雜志,2013,03:21-27.

[20]姚俠,鄭建永,應(yīng)向賢,等.有機相脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯[J].生物加工過程,2012,10(3):12-16.

[21]Wang H X,Wu C M,Bu X W,et al.A benign preparation of sec-butanol via transesterification from sec-butyl acetate using the acidic Imidazolium ionic liquids as catalysts[J].Chemical Engineering Journal,2014,246:366-372.

[22]肖素靜,曹艷,孫磊,等.耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2009,06:816-821.

[23]李超.非水相中酶催化酯化反應(yīng)動力學(xué)的研究[D].保定:河北大學(xué),2014:1-34.

[24]Gharat N,Rathod V K.Ultrasound assisted enzyme catalyzed transesterification of waste cooking oil with dimethyl carbonate[J].Ultrasonics-Sonochemistry,2012,20:900-905.

[25]Romero M D,Calvo L,Alba C,et al.Enzymatic synthesis of isoamyl acetate with immobilized Candida antarctica lipase in n-hexane[J].Enzyme and Microbial Technology,2005,371:42-48.

Synthesis of cinnamyl acetate by lipase-catalyzed trans-esterification

WANG Zhao-he1,ZHANG Yun2,3,SUN Ai-jun2,3,YANG Zai-chang1,HU Yun-feng2,3,*

(1.Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy of Guizhou Province,School of Fermentation and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of tropical marine bio-resources and ecology,South China Sea Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510301,China;3.Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica,South China Sea Institute of Oceanology,Guangzhou 510301,China)

One novel gene encoding a lipase L-1 was cloned from the genome ofStreptomycessp.SCSIO 13580 identified from the deep sea of the South China Sea.L-1 contains 1005 bp and encodes a putative lipase that harbors 334 amino acids and exhibits the highest similarity of 51% with other lipases.The lipase was heterologously expressed inE.coli. The lipase could catalyze the trans-esterification reaction of vinyl acetate and cinnamyl alcohol in non-aqueous medium.The effects including cinnamyl alcohol/vinyl acetate ratio(mol/mol),temperature,solvents and aclyl donors,on the catalytic activities were further investigated.The optimum enzymatic working conditions were obtained as follows:vinyl acetate as the acyl donor,n-hexane as the solvent,ratio of cinnamyl alcohol/vinyl acetate 1∶6,reaction temperature of 40 ℃,the maximum conversion rate could reach 48.3%,the activity of enzyme powder was 5.59 U/g.

lipase;trans-esterification reaction;cinnamyl acetate;cinnamyl alcohol;vinyl acetate

2015-10-16

王召賀(1992-),男,碩士研究生,研究方向:發(fā)酵工程,E-mail:wzhaohe@foxmail.com。

胡云峰(1980-),男，博士，從事生物酶催化方面的研究,E-mail:yunfeng.hu@hotmail.com。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(21302199),中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(XDA11030404),中國科學(xué)院重點部署項目(KGZD-EW-606),廣州市科技計劃項目(201510010012)。

TS264.3

B

1002-0306(2016)09-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.031