豆天蛾多糖CBP3結構初步研究

田　華

(信陽師范學院生命科學學院,河南信陽 464000)

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豆天蛾多糖CBP3結構初步研究

田華

(信陽師范學院生命科學學院,河南信陽 464000)

對豆天蛾多糖CBP3的結構進行表征,研究發(fā)現(xiàn)豆天蛾多糖CBP3的單糖組成是甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩爾比是27.89∶1∶3.16,不含核酸和蛋白質等雜質成分。綜合IR、1H-NMR、β-消去反應、KI-I2反應,X-衍射、掃描電鏡分析,推測豆天蛾多糖CBP3可能為含羧基的酸性多糖,具有較長的側鏈和較多的分枝,可能含O-型糖肽鍵,以β-型吡喃環(huán)的形式存在。有少部分多糖以晶體形式存在,大部分為無定形物質。

豆天蛾,多糖,單糖組成,結構

多糖廣泛存在于動物、植物、微生物和真菌等,許多多糖具有免疫調節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、保護胃腸系統(tǒng)等多種生物學活性[1]。多糖的化學結構異常復雜[2-3],多糖的結構是其生物活性的基礎,深入研究多糖的一級和高級結構對闡述多糖類物質的作用機理有重要的理論意義。通常多采用物理方法和化學分析方法相結合來分析多糖的結構[4]。在測定多糖的一級結構時,首先要知道多糖單糖種類及比例,可用凝膠滲透色譜、紙層析、薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜法、毛細管電泳等方法測定;然后判斷單糖殘基構型、糖苷鍵位置、糖環(huán)結構、組成單糖殘基順序、糖苷α和β異構體類型等[5]。

目前多糖研究主要以真菌、植物為主,動物多糖研究相對較少,昆蟲多糖研究極少。目前國內主要有蠶蛹多糖、蛹蟲草多糖、牛虻抗凝血多糖、白蠟蟲多糖、喙尾琵琶甲多糖和蟑螂多糖、白僵蠶多糖、蠐螬多糖、美洲大蠊硫酸粘多糖、豆天蛾多糖的提取純化及功能研究,其它昆蟲活性多糖及其功能研究未見報道。豆天蛾屬鱗翅目(Lepidoptera)天蛾科(Sphingidae)云紋天蛾亞科(Ambulicinae)豆天蛾屬(ClanisHübner),是大豆生產上的暴發(fā)性害蟲,同時又是一種特佳的高蛋白食物,具有增強人體免疫功能,提高人體的抗病、抗癌能力,有降血脂、降血壓和治療胃寒疾病及營養(yǎng)不良的特殊療效[6]。田華等[7]對豆天蛾多糖CBP3抗氧化活性進行了研究,結果發(fā)現(xiàn)豆天蛾多糖CBP3具有良好的體外抗氧化活性。因此,本論文對前期分離得到的均一多糖豆天蛾CBP3的結構進行初步研究,為深入研究豆天蛾多糖的構效關系提供必要的理論基礎。本研究結果可用以指導豆天蛾多糖功能食品的開發(fā),從而可創(chuàng)造良好的經濟價值和社會效益,同時還可為豆天蛾多糖的生物學和醫(yī)藥學研究奠定相關的理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豆天蛾幼蟲河南周口市郊區(qū),在昆蟲實驗室進行養(yǎng)殖備用;PTA409PC熱分析儀德國NETZSCH公司;DU800紫外可見分光光度計美國貝克曼庫爾特有限公司;TENSOR27傅立葉變換紅外光譜儀德國Bruker公司;Bruke DRX-500超導核磁共振譜儀日本電子株式會社;S-4800掃描電子顯微鏡日本HITACHI公司;Agilent 1200高效液相色譜美國Agilent公司;MILLQBIOCEL超純水組合系統(tǒng)美國MLLIPORE公司;D8/ADVANCE X-衍射儀德國 Bruker公司。

1.2實驗方法

1.2.1豆天蛾多糖CBP3的制備工藝流程豆天蛾5齡幼蟲→饑餓2 d→沸水燙死→洗凈,55 ℃恒溫烘干至恒重→冷卻至室溫→微型植物粉碎機粉碎→過40目篩→55 ℃恒溫烘干至恒重→5倍體積95%乙醇浸泡過夜→過濾,殘渣揮干→熱水浸提(浸提時間1.5 h,浸提溫度90 ℃,料液比1∶20)→4000 r/min離心10 min(濾渣重復1次)→上清液→旋轉薄膜蒸發(fā)濃縮→95%乙醇沉淀→沉淀物用蒸餾水復溶→95%乙醇醇沉→重復3次→無水乙醇洗滌沉淀→真空冷凍干燥→豆天蛾多糖CBP1(ClanisbilineatatsingtauicaPolysaccharides NO.1)→脫蛋白→脫色→透析→豆天蛾多糖CBP2(ClanisbilineatatsingtauicaPolysaccharides NO.2)→分級→豆天蛾多糖CBP3(ClanisbilineatatsingtauicaPolysaccharides NO.3)→經純度鑒定為均一多糖。

1.2.2單糖組成測定分析采用HPLC測定豆天蛾多糖CBP3單糖組成。采用Hypersil BDS C18柱,250 mm×4.6 mm,流動相乙酸鈉0.02 mol/L,流速1 mL/min,檢測波長250 nm,等度洗脫,柱壓30Bar,柱溫25 ℃,進樣量20 μL。測定方法是將不同的單糖溶解于蒸餾水中,分別配制成1%的標準單糖溶液。精密稱取豆天蛾多糖CBP3 10 mg 溶解于2.5 mL蒸餾水中,加入2 mol/L濃H2SO42.5 mL,充氮氣封口,在烘箱中110 ℃水解8 h,用碳酸鋇粉中和水解液至pH7.0,以2000 r/min離心10 min,沉淀用蒸餾水洗滌三次,合并上清液,過濾,濃縮,上高效液相色譜前脫氣并用0.45 μm濾膜過濾。多糖的單糖組成及摩爾比由標準單糖的保留時間和峰面積決定[8-9]。

1.2.3紫外光譜(UV)測定制備0.1 mg/mL 豆天蛾多糖CBP3水溶液,在190～390 nm 范圍內進行紫外全掃描。

1.2.4紅外圖譜測定取豆天蛾多糖CBP3適量,與干燥的KBr混合均勻,瑪瑙研缽研磨,壓片,放入紅外光譜儀在波數(shù)4000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描。

1.2.5β消去實驗稱取5 mg豆天蛾多糖CBP3樣品2份,分別加入5 mL 0.2 mol/L NaOH水溶液和5 mL蒸餾水,于45 ℃反應3 h后進行190～400 nm紫外掃描。

1.2.6碘-碘化鉀反應稱取適量豆天蛾多糖CBP3樣品,溶于蒸餾水中,配制成1 mg/mL的多糖溶液,取2 mL加入1.2 mL碘試劑(含0.02% I2的0.2%KI溶液),充分混合均勻后置于紫外可見分光光度計進行190～700 nm波長掃描。

1.2.7綜合熱分析測試采用德國耐馳PTA409PC熱分析儀研究豆天蛾多糖CBP3多糖的熱特性,加熱速度10 ℃/min,0～850 ℃,得到DAT/TG曲線。

1.2.8核磁共振(NMR)將豆天蛾多糖CBP3溶解于D2O中,配制成濃度為30 mg/mL多糖溶液,用Bruke DRX-500型400 MHz超導核磁共振譜儀,觀察頻率22.5 MHz,溫度50 ℃。

1.2.9X-衍射(XRD)德國Bruker D8 Advance X-射線粉末衍射儀,Cu Kα1.5405 ?,電壓40 kv,電流30 A,掃描范圍2θ為5～90°,掃描步長0.1°,掃描速率4°/min,衍射途中的結晶區(qū)和無定形區(qū)(非結晶區(qū))采用OriginPro8.0軟件分析。

1.2.10掃描電鏡觀察(SEM)將豆天蛾多糖CBP3樣品粘著于樣品臺上,置真空噴鍍儀內鍍導電層鉑(Pt),厚度10 nm,采用HITACHI S-4800掃描電鏡觀察,電子加速槍1000 Volt。

2　結果與分析

2.1單糖組成

將鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖分別進行HPLC分析,各標準單糖的保留時間見圖1。完全酸水解的豆天蛾多糖CBP3進行高效液相色譜分析,結果如圖2所示,將各個峰保留時間及各相應峰面積與標準單糖對照可知單糖的組成和比例,豆天蛾多糖CBP3的單糖組成是甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩爾比是27.89∶1∶3.16。

圖1　標準單糖HPLC 色譜圖Fig.1　The HPLC chromatogram of the standard monosaccharide

圖2　豆天蛾多糖CBP3的HPLC色譜圖Fig.2　The HPLC chromatogram of CBP3

2.2紫外圖譜測定(UV)

豆天蛾多糖CBP3水溶液紫外吸收光譜圖見圖3,紫外吸收光譜顯示260 nm和280 nm處無明顯吸收峰,表明其不含核酸和蛋白質等雜質成分。190～210 nm之間有多糖的吸收峰[10]。

圖3　豆天蛾多糖CBP3溶液紫外掃描光譜Fig.3　UV spectrum of CBP3

2.3紅外圖譜(IR)測定

紅外光譜圖上的每一個吸收峰,都相應于分子中原子或官能團振動的情況,利用紅外光譜可以檢驗分子中的一些官能團和氫鍵的存在,對未知化合物的結構分析提供信息[11]。一張紅外吸收光譜圖可分為特征吸收區(qū)(4000～1333 cm-1)和指紋區(qū)(1333～500 cm-1),一些有機結構的官能團在特征區(qū)可顯示一些特征吸收[8]。采用KBr固體壓片法,在4000～400 cm-1區(qū)間內對豆天蛾多糖CBP3進行紅外光譜掃描,結果見圖4,圖4表現(xiàn)出一般多糖類物質的特征吸收峰:3429 cm-1處為分子間O-H鍵的伸縮振動;2933 cm-1處為飽和氫CH3、CH2、CH等C-H鍵的伸縮振動;1652 cm-1處的吸收峰為C=O伸縮振動峰、C=O的非對稱伸縮振動峰,多糖中可能含有COOH;1340、1434 cm-1為分子中C-O鍵的對稱伸縮振動和C-H的變角振動,885 cm-1為β葡萄糖吡喃環(huán)C-H鍵的變角振動,767 cm-1吡喃環(huán)對稱環(huán)伸縮振動。在N-H變角振動區(qū)1650～1550 cm-1附近有1652 cm-1吸收峰,可能為蛋白質吸收峰,與β-消去反應推測豆天蛾多糖CBP3可能含有O-型糖肽鍵結論一致。因此,豆天蛾多糖CBP3的單糖殘基可能以β型吡喃環(huán)的形式存在。

圖4　豆天蛾多糖CBP3紅外光譜圖(IR)Fig.4　IR spectrum of CBP3

2.4β消去反應

在稀堿溶液的作用下,O-型糖肽鍵能發(fā)生β-消去反應,與糖鏈連接的絲氨酸轉化成α-氨基丙烯酸,蘇氨酸轉化為α-氨基丁烯酸,形成的不飽和氨基酸在240 nm處有明顯的紫外吸收,而與天冬酰胺相連的N-型糖苷鍵則不會發(fā)生此變化[11]。因此,利用β-消去反應來檢測糖蛋白糖肽鍵簡單快速。豆天蛾多糖CBP3經0.2 mol/L NaOH處理前后紫外圖譜見圖5,由圖5可知,經0.2 mol/L NaOH處理后豆天蛾多糖CBP3在240 nm附近紫外吸光值明顯增加,表明豆天蛾多糖CBP3可能含有O-型糖肽鍵。

圖5　0.2 mol/L NaOH處理前后 豆天蛾多糖CBP3的紫外圖譜Fig.5　UV spectrum of CBP3 treated by 0.2 mol/L NaOH

2.5碘-碘化鉀反應

豆天蛾多糖CBP3水溶液與碘試劑混勻后紫外圖譜如圖6所示,由于豆天蛾多糖CBP3與KI-I2的反應物最大吸收峰在224 nm處,而在565 nm處無最大吸收,說明豆天蛾多糖CBP3具有較長的側鏈和較多的分枝[12]。

圖6　豆天蛾多糖CBP3水溶液碘-碘化鉀反應紫外圖譜Fig.6　KI-I2 UV spectrum of CBP3

2.6綜合熱分析

圖7是豆天蛾多糖CBP3熱特性分析DTA/TG曲線,由圖7可以看出,加熱過程中有2次大的物質損失過程,這與多糖的組成、所含水分質量分數(shù)以及凝聚形態(tài)有關。由TG曲線可以看出,豆天蛾多糖CBP3在27～144.04 ℃之間有一個失重峰,其失重率為25.39%;在144.04～540.75 ℃之間有一個很大的失重峰,其失重率為47.14%;在540.75～810.54 ℃之間有一個很小的失重峰，其失重率為1.69%。由DTA曲線可以看出,在115.77 ℃有一個吸熱峰,可能為多糖所含水分的蒸發(fā)引起的;在341.1、508.40、677.12 ℃處有三個放熱峰,其中最大的放熱峰為508.40 ℃,可能是豆天蛾多糖CBP3發(fā)生了氧化反應所致。

圖7　豆天蛾多糖CBP3熱特性分析Fig.7　Thermal analysis of CBP3

2.7核磁共振

圖8是豆天蛾多糖CBP3的1H-NMR圖譜,圖中C-1 質子的化學位移小于5 ppm,這表示CBP3的組成單糖中,主要以β-型異構體環(huán)形結構存在[13-14]。

圖8　豆天蛾多糖CBP3的1H-NMR圖譜Fig.8　1H-NMR spectrum of CBP3

2.8X-衍射

圖9是豆天蛾多糖CBP3 X-衍射圖譜,由圖9可以看出,豆天蛾多糖CBP3在14.9°、16.1°、21.3°、31.6°、34°、44.5°處有很小的彌散峰外,幾乎為無定形物區(qū)。說明豆天蛾多糖CBP3結晶性很差,幾乎為無定形物質。

圖9　豆天蛾多糖CBP3 X-衍射圖譜Fig.9　X-Ray diffraction spectrum of CBP3

2.9掃描電鏡觀察

掃描電鏡是研究多糖形貌的一種有效手段,豆天蛾多糖CBP3不同放大倍數(shù)的SEM照片如圖10所示,豆天蛾多糖CBP3分子以菊花狀纖維束緊密的排列成片狀,可能有少部分多糖以晶體形式存在,大部分為無定形物質,還有待于進一步研究。

圖10　豆天蛾多糖CBP3 SEM照片F(xiàn)ig.10　SEM image of CBP3

3　討論

3.1豆天蛾多糖CBP3單糖組成

研究發(fā)現(xiàn)豆天蛾多糖CBP3由3種單糖組成,其中甘露糖和半乳糖所占的比例較大,特別是甘露糖含量特別高,其摩爾比基本是葡萄糖的28倍,半乳糖的9倍。多糖的分子鏈以五元呋喃環(huán)或六元吡喃環(huán)鏈接而成。不同連接方式的糖苷鍵形成的多糖溶液具有不同的構象。關于豆天蛾多糖CBP3各單糖的結構及連接方式,紅外光譜推測CBP3各單糖以β型吡喃環(huán)形式存在,1H-NMR推測各單糖以β-型異構體環(huán)形結構存在,碘-碘化鉀反應推測豆天蛾多糖CBP3具有較長的側鏈和較多的分枝,不存在三股螺旋結構,但豆天蛾多糖CBP3主鏈和支鏈是何種組成和連接方式有待進一步研究。

3.2豆天蛾多糖CBP3多糖與蛋白的連接方式

3500～3200 cm-1的兩個寬峰時O-H和N-H的伸縮振動,存在著分子間和分子內的氫鍵。3200～2800 cm-1的一組峰是糖類C-H伸縮振動,1400～1200 cm-1是C-H的變角振動,如果沒有這兩組峰,則可初步判斷該化合物不是糖類化合物[15]。α-型常出現(xiàn)(844±8)cm-1峰,而β-型出現(xiàn)(891±7)cm-1峰。豆天蛾多糖CBP3水溶液紫外吸收光譜結果顯示280 nm處無明顯吸收峰,紅外光譜顯示N-H變角振動區(qū)1650～1550 cm-1附近有1652 cm-1吸收峰,β-消去反應表明經0.2 mol/L NaOH處理后豆天蛾多糖CBP3在240 nm附近紫外吸光值明顯增加,說明豆天蛾多糖CBP3可能含有O-型糖肽鍵,推測豆天蛾多糖CBP3與蛋白質是以結合蛋白的形式存在,并且豆天蛾多糖CBP3組成上以多糖為主,蛋白的含量較少,還需要進一步的實驗驗證。

4　結論

本論文對豆天蛾多糖CBP3的結構進行表征。豆天蛾多糖CBP3的單糖組成是甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩爾比是27.89∶1∶3.16,不含核酸和蛋白質等雜質成分。綜合IR、1H-NMR、β-消去反應、KI-I2反應,X-衍射、掃描電鏡分析,推測豆天蛾多糖CBP3可能為含羧基的酸性多糖,具有較長的側鏈和較多的分枝,可能含O-型糖肽鍵,以β-型吡喃環(huán)的形式存在,有少部分多糖以晶體形式存在,大部分為無定形物質。

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Structure characterizations of polysaccharide CBP3 fromClanisbilineatatsingtauicaMell

TIAN Hua

(College of Life Sciences,Xinyang Normal University,Xinyang 464000,China)

The structure characterizations ofClanisbilineatatsingtauicaMell polysaccharide were investigated.The studies showed that CBP3 was composed of seminose,glucose and galactose in a molar ratio of 27.89∶1∶3.16.The results showed that CBP3 may be a kind acidic polysaccharide containing carboxyl with -o-glycosidic linkages andβ-glucopyranose between sugers and amino acids by means of several analysis methods,such as infrared scanning,H-NMR,β-elimination reaction,KI-I2reaction,x-ray powder diffraction and scanning electron microscopy analysis,which had long side chains and more branches.CBP3 were amorphous materials with crystals partly.

ClanisbilineatatsingtauicaMell;polysaccharide;monosaccharide composition;structure

2015-10-14

田華(1979-)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：生物技術,E-mail：xynu0818@163.com。

信陽師范學院青年骨干教師資助計劃項目。

TS201.1

A

1002-0306(2016)09-0097-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.011