不同分子量黑籽瓜種子多肽抗氧化能力的研究

齊希光,陸曉婷,張　暉,王　立,錢海峰

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

?

不同分子量黑籽瓜種子多肽抗氧化能力的研究

齊希光,陸曉婷,張暉*,王立,錢海峰

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

目的:研究不同分子量黑籽瓜種子多肽的抗氧化能力的差異。方法:利用超濾技術(shù)對(duì)黑籽瓜種子蛋白酶解產(chǎn)物(SWSPs)進(jìn)行多級(jí)分離,得到不同分子量分布的五種組分(SWSPs-L、SWSPs-1、SWSPs-3、SWSPs-5、SWSPs-10),然后以七種抗氧化能力評(píng)價(jià)體系分別對(duì)五種組分進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果:不同分子量黑籽瓜種子多肽的抗氧化能力不盡相同,分子量在1～3 ku的組分SWSPs-1對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最強(qiáng),而分子量<1 ku的組分SWSPs-L則表現(xiàn)出了多重抗氧化機(jī)制,該組分與等濃度的EDTA具有相近的螯合效果。結(jié)論:黑籽瓜種子多肽的抗氧化能力與其分子量分布和氨基酸組成密切相關(guān),是各方面綜合作用的結(jié)果。

黑籽瓜種子,超濾,多肽,抗氧化

本文以堿性蛋白酶對(duì)黑籽瓜種子蛋白酶解,利用超濾技術(shù)對(duì)酶解液進(jìn)行分級(jí),用多種體外抗氧化評(píng)價(jià)體系對(duì)不同分子量的黑籽瓜種子蛋白多肽的抗氧化能力進(jìn)行分析,以期為籽瓜源抗氧化肽系列產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑籽瓜種子(民籽1號(hào))甘肅省民勤縣金谷源農(nóng)業(yè)科技有限公司;堿性蛋白酶諾維信公司;DA201-C型大孔樹脂天津浩聚樹脂科技有限公司;其余試劑均為化學(xué)分析純。

紫外可見光分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;BSA224型電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;PeLLicon-2超濾裝置美國(guó)默克密理博公司;L-8900氨基酸全自動(dòng)分析儀日本日立公司;Waters600 HPLC系統(tǒng)(配備2487紫外檢測(cè)器和M32工作站)美國(guó)Waters公司;TSK 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm):日本TOSOH公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1不同分子量黑籽瓜籽抗氧化肽的制備參考陸曉婷等[14]的方法,將通過堿提酸沉得到的黑籽瓜籽蛋白用堿性蛋白酶酶解,調(diào)節(jié)體系pH7.0沉淀未反應(yīng)的蛋白,經(jīng)4000r/min離心。在室溫條件下,使用PeLLicon-2超濾裝置對(duì)上清液進(jìn)行超濾多步分級(jí),依照截流分子量的大小,得到SWSPs-L(Mw<1 ku)、SWSPs-1(Mw=1～3 ku)、SWSPs-3(Mw=3～5 ku)、SWSPs-5(Mw=5～10 ku)、SWSPs-10(Mw>10 ku)五種組分,各級(jí)超濾實(shí)驗(yàn)的基本條件為壓力0.2 MPa,當(dāng)酶解液濃縮至上級(jí)超濾所得濾過液的1/10時(shí),超濾操作停止[15]。

1.2.2分級(jí)產(chǎn)物脫鹽用無水乙醇浸泡DA201-C型大孔樹脂24 h,無水乙醇反復(fù)洗滌至220 nm無明顯吸光值,再用去離子水洗至無醇味[16]。稱取100 g濕樹脂于500 mL錐形瓶中,加100 mL籽瓜多肽,25 ℃恒溫?fù)u床150 r/min,使其充分吸附后棄去未吸附的鹽溶液,用75%乙醇依次洗脫,分別收集洗脫液并濃縮。

1.2.3分子量分布測(cè)定使用Waters 600 HPLC系統(tǒng)(配備2487紫外檢測(cè)器和M32工作站)測(cè)定,色譜條件為:TSKgel G2000SWXL型色譜柱;柱溫為30 ℃;流動(dòng)相為乙腈/水/三氟乙酸(10∶90∶0.1);流速為0.5 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為UV 220 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1SWSPs分級(jí)產(chǎn)物分子量分布

利用凝膠液相色譜對(duì)SWSPs各分級(jí)產(chǎn)物分子量分布進(jìn)行測(cè)定,分子量分布結(jié)果如圖1所示。經(jīng)多級(jí)超濾操作,各組分間的分子量分布差異明顯。隨著超濾膜孔徑的減小,各組分中分子量小于500 u的多肽逐漸增加,且差異明顯,其順序SWSPs-10

圖1　各組分分子量分布Fig.1　Molecular weight distribution of each fragment注:(a)～(e)分別代表SWSPs-L、 SWSPs-1、SWSPs-3、SWSPs-5、SWSPs-10五個(gè)組分。

2.2SWSPs分級(jí)產(chǎn)物氨基酸組成

經(jīng)全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定,不同組分的氨基酸分析結(jié)果如表1所示,氨基酸的種類與組成在一定程度上決定抗氧化肽活性的大小,如具有親核性的含硫氨基酸Cys和Met[19],以及含咪唑基的氨基酸His[20]等可作為氫受體;芳香族氨基酸參與供氫,可減慢或終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng);Glu等酸性氨基酸作為氫供體可提高肽類物質(zhì)還原能力[21];含巰基的半胱氨酸可與自由基反應(yīng)[22],此外較多抗氧化肽序列中含有疏水氨基酸,如Ala、Val、Leu等。由表1可知,低分子量組分SWSPs-L和SWSPs-1的疏水性氨基酸含量達(dá)到40%以上,堿性氨基酸(Lys、His、Arg)含量之和分別為18.61%、18.52%,His的含量均高于其他組分,由此推斷,這兩個(gè)組分可能具有較強(qiáng)抗氧化活性。此外,SWSPs-10的Cys-s含量明顯高于其他組份,可能具有較好的還原能力。

表1　各組分氨基酸分析Table 1　Amino acid analysis of each fragment

圖2　各組分對(duì)·清除能力Fig.2　Scavenging capacity against · of each fragment

圖3　VC對(duì)清除能力Fig.3　Scavenging capacity against · of VC

2.4不同組分SWSPs清除·OH的能力

Fe2+可與鄰菲羅啉(phen)生成橙紅色配合物[Fe(phen)3]2+,H2O2在Fe2+催化下產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性的·OH,使得Fe2+氧化成Fe3+,繼而生成無色或藍(lán)色的配合物[Fe(phen)3]3+,原本的溶液褪色[24]。在多肽、氨基酸的存在下,氨基酸等物質(zhì)易與·OH發(fā)生氧化修飾,捕捉·OH,從而延緩溶液的褪色變化[23],因而可以表征多肽體系的抗氧化性。由圖4可知,僅SWSPs-L顯示出較好的·OH清除效果,說明酶解產(chǎn)物中具有·OH清除能力的活性結(jié)構(gòu)只存在低分子量SWSPs-L中,其中當(dāng)SWSPs-L濃度為8 mg/mL時(shí)與18.72 μg/mL的VC具有同等清除效果(圖5),清除率為22.28%。

圖4　SWSPs-L對(duì)·OH清除能力Fig.4　Scavenging capacity against ·OH of SWSPs-L

圖5　VC對(duì)·OH清除能力Fig.5　Scavenging capacity against·OH of VC

2.5不同組分SWSPs清除DPPH·的能力

DPPH·清除率是快速定量分析多肽作為電子受體、轉(zhuǎn)移電子的能力的通用方法[25]。由圖6可知,各分級(jí)產(chǎn)物均呈現(xiàn)一定的清除效果且均對(duì)濃度有一定的依賴性。在低濃度時(shí),組分間對(duì)DPPH·清除效果差異不明顯;但在濃度高于6.4 mg/mL時(shí),各組分差異明顯,其中SWSPs-10、SWSPs-5和SWSPs-L的清除活性明顯高于其他組份,當(dāng)濃度為8 mg/mL時(shí),SWSPs-L組分對(duì)DPPH·清除效果最佳,與4.38 μg/mL Trolox等效(圖7),清除率為33.39%。Bamdad等[26]報(bào)道,DPPH·清除率取決于良好的疏水性和在反應(yīng)介質(zhì)中良好的擴(kuò)散性,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,DPPH·清除活性與分子量分布沒有明顯的線性關(guān)系,較高DPPH·清除活性分散于低分子量與高分子量組分中。這可能是有由于高分子量多肽具有較多電子致密的側(cè)鏈基團(tuán),同時(shí)因較高的疏水性使高分子量多肽更易于與DPPH·結(jié)合。但隨著水解程度不斷加深,逐漸暴露的親水性基團(tuán)提高了低分子量多肽的分散性,同時(shí)低分子量多肽具有較小的空間位阻,從而具有較好的轉(zhuǎn)移電子的能力。

圖6　各組分對(duì)DPPH·清除能力Fig.6　Scavenging capacity against DPPH· of each fragment

圖7　Trolox對(duì)DPPH·清除能力Fig.7　Scavenging capacity against DPPH· of Trolox

2.6不同組分SWSPs清除ABTS+·的能力

ABTS+·在抗氧化肽提供的電子作用下生成ABTS,這時(shí)墨綠色溶液會(huì)發(fā)生褪色,在734 nm處的吸光度下降,褪色程度可反映其抗氧化能力的大小[27]。由圖8可知,隨著樣品濃度增加,各組分的抗氧化效果不斷提高,此外,同濃度下各組分使ABTS+·轉(zhuǎn)變成ABTS能力差異明顯,低分子量組分的抗氧化效果明顯優(yōu)于高分子量組分,SWSPs-L組分表現(xiàn)最佳,其1.2 mg/mL濃度清除ABTS+·的能力與0.33 mg/mL Trolox等效(圖9),但分子量較高的組分SWSPs-10、SWSPs-5差異不大。這可能是因?yàn)榈头肿恿拷M分的酪氨酸和苯丙氨酸含量較高,其苯環(huán)可以作為極佳的氫供體[28],從而使得ABTS+·褪色。

圖8　各組分對(duì)ABTS+·清除能力Fig.8　Scavenging capacity against ABTS+· of each fragment

圖9　Trolox對(duì)ABTS+·清除能力Fig.9　Scavenging capacity against ABTS+· of Trolox

2.7不同組分SWSPs抑制亞油酸自氧化的能力

油脂與脂類食品的腐敗變質(zhì)多是由于其不飽和脂肪酸的氧化、酸敗,從而縮短了食品的貨架期;在生命有機(jī)體中,細(xì)胞膜中也含有大量的不飽和脂肪酸,過量自由基會(huì)損傷膜結(jié)構(gòu)并生成一些脂質(zhì)過氧化物,繼而可能引發(fā)炎癥、代謝紊亂和細(xì)胞老化等癥狀[29]。尤其是亞油酸含有兩個(gè)不飽和雙鍵,極易受自由基攻擊,產(chǎn)生大量過氧化物,因此考察抗氧化劑對(duì)亞油酸自氧化的抑制是評(píng)價(jià)抗氧化劑在食品中抗氧化能力強(qiáng)弱的最常用方法。由圖10可知,在亞油酸氧化前5 d內(nèi),隨著分子量的降低,各組分抑制亞油酸自氧化能力不斷提高,反應(yīng)1 d時(shí),1.2 mg/mL SWSPs-L對(duì)亞油酸自氧化的抑制率為62.35%,與119 μg/mL的BHT的抑制率相當(dāng)。因?yàn)榈头肿恿慷嚯闹锌赡芎休^多還原性末端的肽類物質(zhì),可以通過電子轉(zhuǎn)移方式或直接參與供氫過程,有效中止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從而阻滯亞油酸氧化。此外,SWSPs各組分可以在一定程度上通過疏水性氨基酸殘基與亞油酸中的不飽和雙鍵發(fā)生疏水性結(jié)合,中止了脂質(zhì)過氧化過程中自由基引發(fā)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),使脂質(zhì)得到了有效地保護(hù)。從實(shí)驗(yàn)中還可以發(fā)現(xiàn),隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),抑制效果明顯下降,到亞油酸氧化反應(yīng)至第7 d,在高濃度8.0 mg/mL,低分子量組分SWSPs-L的抑制率為19.05%,在各組分中抑制率表現(xiàn)最差。

圖10　SWSPs抑制亞油酸氧化能力 Fig.10　Inhibition of linoleic acid oxidation of SWSPs

圖11　BHT抑制亞油酸氧化能力Fig.11　Inhibition of linoleic acid oxidation of BHT

2.8不同組分SWSPs還原Fe3+的能力

圖12　各組分對(duì)Fe3+的還原能力Fig.12　Reduction capacity against Fe3+ of each fragment

圖13　Trolox對(duì)Fe3+的還原能力Fig.13　Reduction capacity against Fe3+ of Trolox

2.9不同組分SWSP螯合Fe2+的能力

Fe2+因高效的催化活性,加速自由基的生成,從而引發(fā)氧化性的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。Fe2+一方面直接通過 Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生·OH,另一方面可能通過催化Haber-Weiss 反應(yīng)[32]引起機(jī)體細(xì)胞損傷,因此Fe2+螯合能力也是評(píng)價(jià)籽瓜源抗氧化肽的重要指標(biāo)之一。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示,各組分對(duì)Fe2+螯合能力隨著樣品濃度的增加不斷提高,但是組分間的差異明顯,對(duì)Fe2+的螯合能力的順序?yàn)镾WSPs-L>SWSPs-3>SWSPs-1>SWSPs-10>SWSPs-5。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,大分子肽在水解初期,易形成類聚脯氨酸的螺旋結(jié)構(gòu),其中還包括蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等,具有很好的金屬螯合能力[33]。但是隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)生了更多的帶電活性小肽,小分子帶電活性肽由于空間位阻小,更易與金屬離子直接發(fā)生化學(xué)螯合[26],從而表現(xiàn)出更高的螯合能力。從表1中氨基酸的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),SWSPs-10組分中的蘇氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的總量達(dá)32.71%,由此可以推斷,與其有相同來源的SWSPs-L應(yīng)該具有更高的螯合能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也正好驗(yàn)證了這一點(diǎn),組分SWSPs-L表現(xiàn)出優(yōu)異的螯合能力,與等濃度的EDTA具有相近的螯合效果。

圖14　各組分對(duì)Fe2+螯合能力Fig.14　Chelating capacity against Fe2+ of each fragment

3　結(jié)論

[1]張暉,唐文婷,王立,等.抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2013,32(7):673-679.

[2]Krinsky N I.Mechanism of action of biological antioxidants[J].Experimental Biology and Medicine,1992,200(2):248-254.

[3]Levine R L,Mosoni L,Berlett B S,et al. Methionine residues as endogenous antioxidants in proteins[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1996,93(26):15036-15040.

[4]Neuzil J,Gebicki J M,Stocker R.Radical-induced chain oxidation of proteins and its inhibition by chain-breaking antioxidants[J]. Biochem,1993,293:601-606.

[5]Traber M G.Regulation of human plasma vitamin E[J]. Advances in Pharmacology,1996,38:49-63.

[6]Ren J,Zhao M,Shi J,et al.Purification and identification of antioxidant peptides from grass carp muscle hydrolysates by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J].Food Chemistry,2008,108(2):727-736.

[7]劉長(zhǎng)江,賈莎莎,許金光.響應(yīng)面法優(yōu)化軟棗獼猴桃蛋白水解及多肽的抗氧化研究[J].食品科學(xué),2012,33(10):33-38.

[8]Sakanaka S,Tachibana Y.Active oxygen scavenging activity of egg-yolk protein hydrolysates and their effects on lipid oxidation in beef and tuna homogenates[J].Food Chemistry,2006,95(2):243-249.

[9]徐亞元,周裔彬,萬苗,等.脫脂米抗氧化肽的分離純化與研究[J].食品工業(yè)科技,2014,34(24):135-139.

[10]李誠(chéng),肖嵐,付剛,等.豬皮膠原蛋白抗氧化肽的分離純化及體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(15):95-100.

[11]郭靜,姚丹丹,陳銀岳,等.蛋清酶解物對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響[J].食品工業(yè)科技,2015,36(19):366-369.

[12]Lin S,Guo Y,Liu J,et al.Optimized enzymatic hydrolysis and pulsed electric field treatment for production of antioxidant peptides from egg white protein[J].Afr J Biotechnol,2011,10(55):11648-11657.

[13]潘竟海,陳友強(qiáng),林明,等.黑籽瓜產(chǎn)量性狀的相關(guān)與通徑分析[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,(8):40-44.

[14]陸曉婷,張超,張暉,等.黑籽瓜種子蛋白酶解工藝及抗氧化性研究[J].食品科技,2015,40(5):73-78.

[15]張友維.枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生粕制備抗氧化肽的研究[D].無錫:江南大學(xué),2012.

[16]張敏,周梅.不同分子量米糠多肽的抗氧化活性[J].食品科學(xué),2013,34(3):1-6.

[17]李春生.紅籽瓜種仁分離蛋白特性研究與抗氧化肽制備[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[18]Li X.Improved Pyrogallol Autoxidation Method:A Reliable and Cheap Superoxide-Scavenging Assay Suitable for All Antioxidants[J].Agric Food Chem,2012,60(25):6418-6424.

[19]Udenigwe C C,Aluko R E.Chemometric analysis of the amino acid requirements of antioxidant food protein hydrolysates[J].International Journal of Molecular Sciences,2011,12(5):3148-3161.

[20]Elias R J,Kellerby S S,Decker E A.Antioxidant activity of proteins and peptides[J].Food Science and Nutrition,2008,48(5):430-441.

[21]Ahn C B,Lee K H,Je J Y. Enzymatic production of bioactive protein hydrolysates from tuna liver:effects of enzymes and molecular weight on bioactivity[J].International Journal of Food Science & Technology,2010,45(3):562-568.

[22]Qian Z J,Jung W K,Kim S K. Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin,Rana catesbeiana Shaw[J].Bioresource Technology,2008,99(6):1690-1698.

[23]凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004.

[24]Dai Y,Li F,Ge F,et al. Mechanism of the enhanced degradation of pentachlorophenol by ultrasound in the presence of elemental iron[J]. Journal of Hazardous Materials,2006,137(3):1424-1429.

[25]Bondet V,Brand-Williams W,Berset C.Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH free radical method[J].LWT-Food Science and Technology,1997,30(6):609-615.

[26]Kaur R,Arora S,Singh B.Antioxidant activity of the phenol rich fractions of leaves of Chukrasia tabularis A. Juss[J]. Bioresource Technology,2008,99(16):7692-7698.

[27]Miller N J,Rice-Evans C A.Factors influencing the antioxidant activity determined by the ABTS+· radical cation assay[J].Free Radical Research,1997,26(3):195-199.

[28]Qian Z J,Jung W K,Kim S K.Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin Rana catesbeiana Shaw[J].Bioresource Technology,2008,99(6):1690-1698.

[29]Wiseman H,Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species:role in inflammatory disease and progression to cancer[J].The Biochemical Journal,1996,313:17-29.

[30]Bamdad F,Wu J,Chen L.Effects of enzymatic hydrolysis on molecular structure and antioxidant activity of barley hordein[J]. Journal of Cereal Science,2011,54(1):20-28.

[31]Xia Y,Bamdad F,G?nzle M,et al.Fractionation and characterization of antioxidant peptides derived from barley glutelin by enzymatic hydrolysis[J].Food Chemistry,2012,134(3):1509-1518.

[32]Haber F,Weiss J.The catalytic decomposition of hydrogen peroxide by iron salts proceedings of the Royal Society of London A:Mathematical,Physical and Engineering Sciences[J].The Royal Society,1934,147(861):332-351.

[33]孫珍.生物質(zhì)譜技術(shù)和方法在蛋白類藥物序列鑒定中的應(yīng)用研究[D].上海:復(fù)旦大學(xué),2011.

因本刊已被《中國(guó)知網(wǎng)》(包括“中國(guó)知網(wǎng)”優(yōu)先數(shù)字出版庫)獨(dú)家全文收錄，

所以所付稿酬中已包含該網(wǎng)站及光盤應(yīng)付的稿酬。

Study on theinvitroantioxidant capacity of different molecular weight polypeptides of black seed-watermelon seeds

QI Xi-guang,LU Xiao-ting,ZHANG Hui*,WANG Li,QIAN Hai-feng

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Objective:To study the differences between antioxidant abilities of polypeptides with different molecular weights extracted from black seed-watermelon seeds.Methods:Multi-stage separation and ultrafiltration techniques were used to treat the enzymatic hydrolysates(SWSPs)of black seed-watermelon seeds protein,and five constituents(SWSPs-L,SWSPs-1,SWSPs-3,SWSPs-5,SWSPs-10)were separated and collected.Then the antioxidant abilities of these constituents were investigated through seven evaluation systems.Results:The antioxidant abilities were obviously different in these five constituents separated from black seed-watermelon seeds.SWSPs-1 with 1～3 ku molecular weights showed the highest superoxide anion radical-scavenging activity while SWSPs-L with molecular weights lower than 1 ku showed multiple antioxidant capacities and it had the similar metal ion chelating activity with EDTA under the same concentration.Conclusions:The antioxidant abilities of polypeptides extracted from black seed-watermelon seeds were closely related to their molecular weight distributions and amino acid compositions,and it was the result of comprehensive effect of all aspects.

black seed-watermelon seeds;ultrafiltration;peptide;antioxidation

2015-09-21

齊希光(1968-)，男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事谷物功能成分的研究，E-mail：qxguang97@hotmail.com。

張暉(1966-)，女，博士，教授，研究方向:谷物功能成分，E-mail：zhanghui@jiangnan.edu.cn。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”項(xiàng)目(2013AA102207)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(PAPD)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)09-0074-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.006