轉(zhuǎn)化生長因子-β1與表皮生長因子在成人增生性瘢痕中的表達(dá)及意義

黃克華，周國富,陳朗

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院燒傷整形科，重慶　401120；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，四川 南充　637000)

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轉(zhuǎn)化生長因子-β1與表皮生長因子在成人增生性瘢痕中的表達(dá)及意義

黃克華1，周國富2,陳朗2

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院燒傷整形科，重慶401120；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，四川 南充637000)

目的：初步探討轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)在成人增生性瘢痕發(fā)生中可能的作用，為臨床防治提供一定的依據(jù)。方法：通過SP法定性和ELISA法定量檢測(cè)TGF-β1和EGF在成人增生性瘢痕和成人正常皮膚中的表達(dá)情況。結(jié)果：TGF-β1、EGF在成人增生性瘢痕中呈高表達(dá)，二者在成人增生性瘢痕中表達(dá)水平呈正相關(guān)。結(jié)論：TGF-β1、EGF在成人增生性瘢痕中均呈高表達(dá)，TGF-β1和EGF在成人增生性瘢痕中的表達(dá)水平呈正相關(guān)，這為研究臨床預(yù)防、治療皮膚增生性瘢痕提供新思路。

成人增生性瘢痕；表皮生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

【Abstract】Objective：To investigate transforming growth factor-β1(TGF-β1)and epidermal growth facto (EGF)in adults hypertrophic scars occurred in possible role,to provide basis for clinical prevention.Methods：The expression of TGF-β1 and EGF in adult hypertrophic scar and adult normal skin was quantitatively detected by SP and ELISA methods.Results：TGF-β1,EGF in adults hypertrophic scars showed high expression,both expressed in adult hyperplastic scar levels were positively correlated.Conclusion：TGF-β1,EGF in adults hypertrophic scars showed high expression,TGF-β1 and EGF expression levels in adult hypertrophic scars were positively correlated,which provide new ideas for clinical prevention and treatment of skin hypertrophic scars.

人皮膚增生性瘢痕(hypertrophical scar,HS)是當(dāng)其受到創(chuàng)傷后在其修復(fù)過程中以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分產(chǎn)生與沉積過多為特征的纖維代謝性疾病[1]，HS發(fā)病率4%～16%[2]。HS形成有眾多細(xì)胞生長因子參與，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等，其中TGF-β1是參與瘢痕形成的最具有代表性的細(xì)胞因子(cytokine,CK)之一[3]。EGF與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)結(jié)合后加強(qiáng)TGF-β在膠原形成中的作用。目前，有關(guān)TGF-β1和EGF在成人HS中的表達(dá)是否有相關(guān)性的研究較少，本實(shí)驗(yàn)用定性、定量分析成人正常皮膚組織和成人HS組織中二者的表達(dá)情況，初步探討二者在成人HS發(fā)生機(jī)制中有無相關(guān)性，為臨床防治HS提供一定幫助。

1　材料與方法

1.1組織標(biāo)本

標(biāo)本源于醫(yī)院手術(shù)患者，為2014年3月至2014年8月手術(shù)切口HS和燒傷后HS，瘢痕病程12～30個(gè)月，瘢痕無感染、藥物注射及放療史，無免疫相關(guān)疾病及全身免疫治療，身體其他部位無腫瘤；對(duì)照標(biāo)本為成人正常包皮(表1)。

表1　臨床組織標(biāo)本資料

*P<0.05，正常皮膚與HS患者年齡比較；#P>0.05，HS中男性與女性患者年齡比較；△P>0.05，男性與女性患者中HS年齡比較。

1.2主要試劑和儀器

Abcam公司的Anti-TGFbeta1、Anti-EGF；福建邁新公司的濃縮型DAB試劑盒等；上海恒生科技生物有限公司的ELISA檢測(cè)試劑盒(EGF、TGF-β1)。OLYMPUS熒光顯微鏡、電子照相機(jī)裝置(日本)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)-0110105025 ZH(上海力申儀器有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1石蠟切片免疫組織化學(xué)法(SP法)標(biāo)本用4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋制成厚度2.5 μm連續(xù)切片，依次常規(guī)脫蠟水化，酒精梯度脫水，3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS液洗切片，微波爐中修復(fù)，PBS液沖洗，滴加第一抗體，孵育，PBS液中蕩洗，滴加二抗中的A液、B液，再孵育，再置入PBS液中輕蕩洗，顯色，沖洗，終止顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，脫水，透明，封片，晾干。

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA法)新鮮標(biāo)本組織液氮碾磨成粉末，稱重，勻漿，離心并分裝凍存于-80 ℃冰箱，按照ELISA試劑盒操作程序依次稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、加樣、溫浴、洗滌、加酶(空白孔除外)、溫浴、洗滌、顯色、終止顯色、測(cè)定計(jì)算終濃度。

1.4結(jié)果判定用IHS法

由兩名病理科醫(yī)生評(píng)分，在400倍顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值，根據(jù)陽性百分比分：0%～10%，計(jì)1分；11%～50%，計(jì)2分；51%～80%，計(jì)3分；81%～100%，計(jì)4分。根據(jù)陽性標(biāo)記顯色程度分：無染色，計(jì)0分；淡黃色，計(jì)1分；棕黃色，計(jì)2分；棕黑色，計(jì)3分。根據(jù)所得著色細(xì)胞數(shù)得分與染色強(qiáng)度得分的乘積作為最后結(jié)果(0～12分)：0～1分，為陰性(-)；2～4分，為弱陽性(+)；5～8分，為陽性(++)；9～12分，為強(qiáng)陽性(+++)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：(1)EGF的表達(dá)情況。正常皮膚中染色集于表皮基底層，位于細(xì)胞核及部分皮膚附件，真皮結(jié)締組織內(nèi)細(xì)胞染色少；HS內(nèi)陽性染色主要分布于表皮基底層、棘層、表皮等，陽性染色細(xì)胞數(shù)目較多，染色強(qiáng)度明顯，內(nèi)皮血管細(xì)胞、真皮結(jié)締組織中細(xì)胞、皮膚附件部分染色，如圖1。EGF在正常皮膚與成人HS中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.404,P=0.024)(表2)。(2)TGF-β1的表達(dá)情況。正常皮膚中主要位于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿和表皮基底層，真皮層內(nèi)極少有陽性表達(dá)；HS中陽性表達(dá)于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、表皮基底層和真皮Fb、血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及皮膚附屬器等，染色密度及強(qiáng)度較正常皮膚高，如圖2。TGF-β1在正常皮膚與成人HS中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.942，P=0.047)(表3)，TGF-β1和EGF在HS中表達(dá)陽性率的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，結(jié)果提示二者在HS中表達(dá)具有正相關(guān)性(r=0.362,P=0.012)(表4)。(3)ELISA檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，EGF在正常皮膚和HS中的平均濃度分別是(196.29±7.29)、(237.57±14.43)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.44，P=0.001)；TGF-β1在正常皮膚與HS中的平均濃度分別是(246.92±14.93)ng/L、(446.71±59.24)ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.11，P=0.000)；TGF-β1和EGF在HS中濃度表達(dá)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，提示二者在HS中表達(dá)水平具有正相關(guān)性(r=0.330，P=0.017)。

表2 EGF在正常皮膚和HS中的表達(dá)比較

組別EGF表達(dá)分級(jí)n-++++++陽性率(%)正常皮膚211641023.81HS48191610360.42

表3　TGF-β1在正常皮膚和HS中的表達(dá)比較

表4TGF-β1與EGF在HS中免疫組化染色表達(dá)陽性率的相關(guān)性比較

TGF-β1EGF陽性陰性合計(jì)R值P值陽性26026陰性319220.3620.012合計(jì)291948

3　討論

3.1TGF-β1與HS

HS是人皮膚遭受創(chuàng)傷(如手術(shù)、燒傷等)后以Fb過度增殖、ECM過度沉積為主要病理特征并過度愈合所致，TGF-β1參與創(chuàng)傷愈合中炎癥反應(yīng)、血管和Fb增生、膠原合成與分解以及新的ECM的重建[4]。皮膚表皮和真皮淺層受創(chuàng)缺失后，其深層真皮Fb增殖率較淺層真皮Fb增值率低，由此推測(cè)真皮深層的Fb可能是形成HS的主要細(xì)胞來源之一[5]。正常皮膚組織淺層的真皮Fb具有抗纖維化特性，而深層的真皮Fb的遷移率較低，合成蛋白能力強(qiáng)，細(xì)胞過度增殖，引起ECM過度沉積形成HS[6-7]。

TGF-β1是已被公認(rèn)的具有最強(qiáng)促纖維化作用的細(xì)胞因子(cytokine,CK)，在創(chuàng)面修復(fù)愈合過程中持續(xù)高濃度、過度表達(dá)可能是瘢痕形成的主要原因之一[8]。當(dāng)皮膚受創(chuàng)后，炎性因子及組織修復(fù)因子經(jīng)TGF-β1趨化下向創(chuàng)面聚集，促Fb分裂和增殖，TGF-β1誘導(dǎo)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitors of MMP-1，TIMP-1)合成下調(diào)MMP-9的表達(dá)，TGF-β1還抑制MMP2降解膠原，促進(jìn)ECM過度沉積形成HS[9]。TGF-β1促進(jìn)TIMPs合成而抑制MMPs表達(dá)，致膠原蛋白代謝失衡而異常增生[10-11]。TGF-β1在HS形成中刺激Fb增殖，并促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞向Fb轉(zhuǎn)化[12]。TGF-β1刺激I、III型膠原蛋白、整合素等多種ECM合成、沉積，且刺激產(chǎn)生I型膠原致ECM沉積增加促進(jìn)瘢痕形成[13]。

本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色顯示TGF-β1在HS中主要表達(dá)于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、表皮基底層和真皮Fb、血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及皮膚附屬器等，染色密度及強(qiáng)度較正常皮膚高，在正常皮膚和HS中的陽性表達(dá)率分別為19.04%和54.17%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)ELISA定量檢測(cè)表明HS組織中TGF-β1的濃度較正常皮膚組織中高，在正常皮膚和HS中分別為(246.93±14.93)ng/L和(446.71±59.24)ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與眾多研究相似，表達(dá)強(qiáng)度與以往文獻(xiàn)報(bào)道有差距，考慮與瘢痕年齡等因素有關(guān)。

3.2EGF與HS

EGF主由血小板、巨噬細(xì)胞等分泌，它和表皮細(xì)胞、Fb等胞膜上的EGFR結(jié)合，參與細(xì)胞的增殖、分化和遷移功能的調(diào)節(jié)，與創(chuàng)傷修復(fù)過程密切相關(guān)[14]，EGF家族中涉及創(chuàng)面修復(fù)的主要是EGF、TGFα、HB-EGF。體外試驗(yàn)中，EGFR活化后促進(jìn)急性創(chuàng)面中表皮細(xì)胞增殖和遷移，表皮再生增強(qiáng)，EGF且能夠以近分泌的方式作用于角質(zhì)細(xì)胞，促角質(zhì)細(xì)胞有絲分裂、增殖，進(jìn)而促使表皮再生和創(chuàng)面抗拉強(qiáng)度[15]。但缺少TGF-β1時(shí)并不妨礙創(chuàng)面的愈合，這可能是EGF家族中的其他生長因子具有一定程度的補(bǔ)償作用[16]。EGF對(duì)Fb的生長、增殖活性有明顯的促進(jìn)作用，抑制Fb的凋亡，且刺激膠原的合成、增殖和沉積，當(dāng)EGF產(chǎn)生過量時(shí)促HS形成[17]。當(dāng)皮膚受創(chuàng)后，創(chuàng)周ESCs增殖分化加快，同時(shí)經(jīng)自身分泌或者促進(jìn)周邊細(xì)胞分泌多種CK(如EGF、FGF、TGF-β1等)，表皮細(xì)胞和Fb的生長、增殖加強(qiáng)以及I、Ⅲ型膠原的分泌增多，創(chuàng)面愈合增強(qiáng)[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕增生后期EGF含量稍降低，而Fb生長仍表現(xiàn)優(yōu)勢(shì)，故多數(shù)瘢痕不能自行消失[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在某些HS標(biāo)本中EGF表達(dá)并不明顯，而HS外觀顯著，推測(cè)EGF的產(chǎn)生及生物學(xué)效應(yīng)可能存在時(shí)向性、濃度依賴性等影響因素。

本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色，EGF在HS中陽性染色細(xì)胞數(shù)目、強(qiáng)度較正常皮膚明顯，在正常皮膚和HS中陽性表達(dá)率分別為23.81%和60.42%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA定量檢測(cè)，EGF在HS與正常皮膚中的濃度分別為(237.57±14.43)pg/mL和(196.29±7.29)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與系列研究結(jié)果相似，表明EGF在促進(jìn)HS形成過程中起著重要作用。

3.3TGF-β1和EGF在HS中陽性表達(dá)的相關(guān)性

TGF-α和EGF是EGFR的兩種天然配基，它們與EGFR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合后調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。通過TGF-β1 mRNA原位雜交和VEGF蛋白免疫組織學(xué)化染色觀察，發(fā)現(xiàn)瘢痕組織中TGF-β1和EGF均明顯增加促進(jìn)創(chuàng)面上皮化及瘢痕形成[21]。本實(shí)驗(yàn)中免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二者在HS中均呈明顯高表達(dá)，且與正常皮膚中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，部分HS中TGF-β1和EGF的表達(dá)強(qiáng)度具有一致性。據(jù)此推測(cè)二者在瘢痕增生過程中可能相互正向調(diào)節(jié)促進(jìn)其產(chǎn)生、協(xié)同發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)促HS形成。TGF-β1作用于角質(zhì)細(xì)胞，反過來角質(zhì)細(xì)胞分泌EGF加強(qiáng)創(chuàng)面愈合，創(chuàng)面上皮化作用更明顯。但缺少TGF-β1并不妨礙創(chuàng)面的愈合，這可能是EGF家族中的其他生長因子有一定程度的補(bǔ)償作用[14]。EGF可促表皮細(xì)胞、Fb和其他細(xì)胞的增殖，促膠原合成與ECM過度沉積。TGF-β1對(duì)Fb生長具有雙向調(diào)節(jié)性，即高濃度時(shí)呈現(xiàn)抑制，低濃度時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)。創(chuàng)傷發(fā)生后，EGF和TGF-β1均增多，致創(chuàng)面組織Fb濃度增高，當(dāng)增加到一定程度時(shí)TGF-β1增加速度放緩，但創(chuàng)面修復(fù)繼續(xù)且過度修復(fù)而形成瘢痕，這可能是二者之間存在相關(guān)性并協(xié)同作用致部分瘢痕持續(xù)增生的原因之一。

本研究經(jīng)免疫組織化學(xué)染色和ELISA分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和EGF在成人HS中均呈高表達(dá)，且二者表達(dá)存正相關(guān)，兩種檢測(cè)表達(dá)的相關(guān)程度不完全一致(免疫組化時(shí)R=0.362,P=0.012；ELISA時(shí)R=0.330,P=0.017)，推測(cè)與檢測(cè)方式、瘢痕標(biāo)本個(gè)體差異等有關(guān)。由此推測(cè)EGF和TGF-β1在成人HS的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中存在正相關(guān)，二者生物學(xué)效應(yīng)的疊加可能是促進(jìn)HS形成、發(fā)展的機(jī)制之一。

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(學(xué)術(shù)編輯：肖文明)

Expression and significance of TGF-β1 and EGF in adult hypertrophic scar

HUANG Ke-hua1,ZHOU Guo-fu2，CHEN-Lang2

(1.Department of Burns and Plastic Surgery,The People’s Hospital of Chongqing Yubei District，Chongqing 401120;2.Department of Burns and Plastic Surgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,Sichuan,China)

Adult hypertrophic scar;Epidermal growth factor;Transforming growth factor-β1

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.027論著

四川省衛(wèi)生發(fā)展研究中心項(xiàng)目(SJWF1311)

2015-06-19

黃克華(1975-)，男，碩士。E-mail：cq023hkh@163.com

周國富，E-mail：2508122390@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-217∶48網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.054.html

1005-3697(2016)04-0548-05

R619.6

A