復合多肽溶菌酶在智牙冠周炎治療中的應用

蕭雅一 ，楊莉，牟雁東

(1.南充市中心醫(yī)院口腔科，四川 南充　637000；2.四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都　610041；3.四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都　610000)

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復合多肽溶菌酶在智牙冠周炎治療中的應用

蕭雅一1，楊莉2，牟雁東3

(1.南充市中心醫(yī)院口腔科，四川 南充637000；2.四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都610041；3.四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都610000)

目的：觀察復合多肽溶菌酶在智牙冠周炎治療中的協(xié)同抑菌效果和臨床療效分析。方法：研究分為兩部分，第一部分為體外抑菌實驗，選擇智牙冠周炎內(nèi)常見的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、變形鏈球菌，以等二倍梯度稀釋法稀釋的人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)液和抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)DP7液，加入96孔細胞培養(yǎng)平板，經(jīng)37.0 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，測試hLYZ、AMPs DP7有無協(xié)同抑菌作用。第二部分為臨床實驗，隨機將智牙冠周炎患者分為實驗組和對照組，每組各69例，實驗組使用復合多肽溶菌酶漱口水，對照組使用口泰含漱液。連續(xù)3 d復診，分別在治療前、治療后第 1天和治療后第2天對患者冠周分泌物進行菌落計數(shù)和臨床指標評價。結果：AMPs DP7和hLYZ聯(lián)合使用后，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的標準株和部分耐藥株，變形鏈球菌的標準株產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用。協(xié)同系數(shù)FIC=0.5。臨床結果表明，使用復合多肽溶菌酶漱口水后，冠周菌落計數(shù)明顯低于對照組(Z=-2.109，P=0.035)，差異具有統(tǒng)計學意義；對兩組間局部疼痛明顯好轉和張口度明顯增大的比較(χ2=5.412，P=0.032)，差異具有統(tǒng)計學意義。結論：AMPs DP7和hLYZ聯(lián)合應用對引起智牙冠周炎的部分細菌具有良好的協(xié)同抑菌效果，復配后加入漱口水局部使用能有效減少盲袋和冠周內(nèi)細菌繁殖、緩解智牙冠周炎的癥狀。

復合多肽溶菌酶；智牙冠周炎；協(xié)同抑菌；臨床療效

【Abstract】Objective：To observe the synergistic antibacterial effect of composite polypeptide lysozyme in treating opsigenes pericoronitis and evaluate its clinical effect.Methods：This experiment was composed of two parts;the first part is in vitro bacteriostasis experiment,selecting the sensitive bacterium in opsigenes pericoronitis,including staphylococcus aureus,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa,streptococcus mutan.Added the dilution of antibacterial peptides and human lysozyme by two times the gradient dilution method into 96 cell culture plate;after 24 hours culture in 37.0 ℃ constant temperature incubator,observed whether antibacterial peptides compound human lysozyme have synergistic antimicrobial effect or not.The second part is clinical experiment.Randomly divided patients into experimental group and control group,69 cases in each,the experimental group used compound lysozyme polypeptide mouthwash;the control group used compound chlorhexidine gargle.After three consecutive days of follow-up,which is before treatment,the first and second day after treatment,counted the colony of periodontal secretions and evaluated clinical indicators.Results：The combined use of antibacterial peptides and human lysozyme have synergistic antimicrobial effects to standard strains of staphylococcus aureus,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa,streptococcus mutans,and parts of resistant strains of staphylococcus aureus,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa.Conclusion：Antimicrobial peptides complex human lysozyme has good synergistic effect on some bacteria caused opsigenes pericoronitis,compounded as gargle water can effectively reduce the blind pouch bacterial reproduction,alleviate the symptoms of opsigenes pericoronitis.

智牙冠周炎是臨床上常見的口腔頜面部感染性疾病之一，常發(fā)生于18～30歲的青壯年[1]。智牙冠周炎早期局部治療，能有效阻止其向全身感染發(fā)展。目前臨床上常見的局部治療藥物主要以廣譜抗菌素為主，隨著耐藥菌株的出現(xiàn)和增多，新型的抗菌制劑逐漸受到青睞。本研究通過對人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)和DP7型抗微生物肽簡稱抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)的聯(lián)合應用，觀察其對智牙冠周炎敏感細菌的協(xié)同抑制作用和臨床療效。

1　材料與方法

1.1體外抑菌實驗

選擇對智牙冠周炎敏感的金黃色葡萄球菌6株,其中標準株1株(編號25923)，耐藥株5株(編號S2、S4、S5、S7、S8)；大腸桿菌9株,其中標準株1株(編號25922)，耐藥株8株(編號E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8)；綠膿桿菌3株，其中標準株1株(編號27853)，耐藥株2株(編號Pear1、Pear2)；變形鏈球菌標準株1株(編號25175)。分別配制菌液后經(jīng)酶標儀在595 nm處測得OD值，根據(jù)OD值稀釋菌液，使其濃度為5×108CFU/L，此濃度即為實驗需要的菌液濃度。

配制母液濃度為5 000 mg/L的hLYZ液和256 mg/L的AMPs液，并以等二倍法分別稀釋hLYZ液和AMPs液，見表1。

表1　hLYZ液和DP7液濃度(mg/L)

細菌培養(yǎng)：使用96孔平板，第一排分別加入濃度為128 mg/L 、64 mg/L、32 mg/L、16 mg/L、8 mg/L、4 mg/L的DP7液 100 μL作為DP7液對照組，第八排分別加入濃度為2 500 mg/L、1 250 mg/L、625 mg/L、312.5 mg/L、156.25 mg/L 、78.125 mg/L的hLYZ液100 μL作為hLYZ液對照組，再分別加入培養(yǎng)好的實驗菌液100 μL；中間的棋盤格(6×6)分別在橫排加入50 μL的DP7液，濃度依次為64 mg/L、32 mg/L、16 mg/L、8 mg/L、4 mg/L、2 mg/L；豎排加入50 μL的hLYZ液，濃度依次為1 250 mg/L、625 mg/L、312.5 mg/L、156.25 mg/L、78.125 mg/L、39.062 5mg/L；再分別加入培養(yǎng)好的實驗菌液100 μL作為聯(lián)合用藥實驗組。在37.0 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，經(jīng)酶標儀檢測，測試hLYZ、DP7有無協(xié)同抑菌作用。

1.2臨床實驗

1.2.1研究對象選擇在南充市中心醫(yī)院口腔科診斷為智牙冠周炎的患者138例做為研究對象，其中男性63例，女性75例，年齡19～45歲，平均年齡25.32歲。采用隨機、雙盲、平行對照設計方案，隨機分為實驗組和對照組，每組各69例。納入標準：(1)下頜第三磨牙阻生，智牙冠周炎急性發(fā)作，冠周牙齦紅腫，冠周、盲袋內(nèi)有食物殘渣及分泌物；(2)臨床癥狀有局部疼痛、張口度減小、進食不方便者，個別患者有頜下淋巴結腫大；(3)無發(fā)熱，無全身感染癥狀者；(4)近期未使用抗菌素者。排除標準：(1)口腔衛(wèi)生習慣較差，自身維護不力者；(2)妊娠期及哺乳期婦女；(3)患有內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、代謝疾病、血液疾病、營養(yǎng)不良等。

1.2.2冠周、盲袋內(nèi)取樣冠周沖洗前，用微量移液器取冠周、盲袋內(nèi)分泌物1 μL，經(jīng)生理鹽水稀釋1 000倍，震蕩器震蕩30 s，均勻分散細菌團塊后取1 μL樣本。

1.2.3細菌培養(yǎng)在生物安全柜內(nèi)，取1 μL樣本接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，在隔水培養(yǎng)箱內(nèi)，35.7 ℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)，采用細菌菌落形成單位計數(shù)，單位CFU/mL。

1.2.4椅旁沖洗治療在椅旁對患者行漱口水15～20 mL沖洗冠周、盲袋，沖出食物殘渣、分泌物，直到?jīng)_出液清亮。囑患者回家后用該漱口水自行含漱，每次10 mL，在口內(nèi)含漱3～5 min，每天4次。漱口后30 min內(nèi)不進食、不飲水。同時指導患者維護口腔衛(wèi)生，宣教防護常識。

1.2.5臨床癥狀評判(1)患者疼痛分級：根據(jù)患者主訴，采用疼痛分級法記錄其疼痛程度，并用數(shù)字0～3記錄：0級：無疼痛，記為“0”。I級：疼痛，可以忍受。生活正常，睡眠無干擾，記為“1”。II級：疼痛明顯，不可忍受，要求口服鎮(zhèn)痛藥物，睡眠受干擾，記為“2”。III級：疼痛劇烈，不可忍受，需服用鎮(zhèn)痛藥物，睡眠嚴重受干擾，可伴有自主神經(jīng)紊亂或被動體位，記為“3”。(2)患者開口度：根據(jù)患者開口度，記錄初診和復診情況，以數(shù)字表示，0：開口度>3 cm。1：開口度2～3 cm。2：開口度1～2 cm。3：開口度<1 cm。4：完全不能開口。

1.2.6復診治療后第 1天和治療后第2天復診，重復前次操作。

1.3統(tǒng)計學分析

菌落計數(shù)采用秩和檢驗，比較治療后第2天抑菌有效率。臨床癥狀改善情況采用卡方檢驗，比較緩解程度。P<0.05，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1體外抑菌實驗結果分析

分別測試DP7液對照組、hLYZ液對照組、聯(lián)合用藥實驗組的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，實驗數(shù)據(jù)表明，DP7型抗菌肽與人溶菌酶聯(lián)合時，當DP7濃度為64 mg/L ，hLYZ濃度為312.5 mg/L 時，對25 923的抑菌率為98.34%，對25 922的抑菌率為97.98%，對E1的抑菌率為99.51%；當DP7濃度為32 mg/L ，hLYZ濃度為156.25 mg/L 時，對S5的抑菌率為88.82%，對S8的抑菌率為100.00%；當DP7濃度為16 mg/L ，hLYZ濃度為39.062 5 mg/L 時，對E2的抑菌率為98.67%；當DP7濃度為32 mg/L ，hLYZ濃度為1 250 mg/L 時，對E7的抑菌率為90.30%；當DP7濃度為32 mg/L ，hLYZ濃度為625 mg/L 時，對27 853的抑菌率為80.92%；當DP7濃度為16 mg/L，hLYZ濃度為625 mg/L 時，對P1的抑菌率為96.64%；當DP7濃度為64 mg/L ，hLYZ濃度為1 250 mg/L 時，對P2的抑菌率為93.89%；當DP7濃度為32 mg/L ，hLYZ濃度為39.062 5 mg/L 時，對25 175的抑菌率為100.00%，具有協(xié)同抑菌意義，F(xiàn)IC指數(shù)=0.5；DP7液對照組中相應的MIC濃度均是聯(lián)合用藥組中DP7液濃度的 2倍；本組實驗中hLYZ對照組的結果均為陰性，未表現(xiàn)出抑菌效果，見表2。對S2、S4、S7、E3、E4、E5、E6、E8沒有協(xié)同抑菌作用。

表2DP7液對照組、hLYZ液對照組、聯(lián)合用藥實驗組的MIC(mg/L)

菌種DP7對照組hLYZ對照組聯(lián)合用藥實驗組DP7hLYZ25923128陰性結果64312.5S564陰性結果32156.25S864陰性結果32156.2525922128陰性結果64312.5E1128陰性結果64312.5E232陰性結果1639.0625E764陰性結果3212502785364陰性結果32625P132陰性結果16625P2128陰性結果6412502517564陰性結果3239.0625

2.2臨床實驗結果分析

2.2.1菌落計數(shù)在35.7 ℃下隔水培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，治療前總菌落計數(shù)實驗組為15 464 CFU/mL，對照組為17 580 CFU/mL，數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布，兩個獨立樣本做秩和檢驗，n=69，Z=-0.556，P=0.578，差異無統(tǒng)計學意義。治療后第 2天總菌落計數(shù)實驗組為3 337 CFU/mL，對照組為4 016 CFU/mL，秩和檢驗抑菌有效率：n=69，Z=-2.109，P=0.035，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2.2臨床癥狀評判(1)疼痛程度：將治療后第 2天與治療前疼痛記分數(shù)值相差1者，記為“疼痛緩解”；將記分數(shù)值相差2及以上者，記為“疼痛明顯好轉”。經(jīng)卡方檢驗，疼痛明顯好轉率實驗組與對照組比較，χ2=5.412，P=0.032，差異具有統(tǒng)計學意義(表3)。(2)張口度改善情況：治療后第 2天患者的張口度增大<2 cm者，記為“緩解”；增大2 cm及以上者，記為”明顯增大”。經(jīng)卡方檢驗，實驗組與對照組比較，χ2=5.412，P=0.032，差異具有統(tǒng)計學意義。

表3　實驗藥物對疼痛治療的療效比較(n=69)

3　討論

智牙冠周炎發(fā)作時，細菌大量繁殖，需氧菌和厭氧菌并存，本實驗選擇對智牙冠周炎敏感的部分細菌，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的標準株和部分耐藥株以及變形鏈球菌標準株，通過不同濃度AMPs和hLYZ復配，對上述細菌產(chǎn)生的抑制作用進行分析，發(fā)現(xiàn)兩種藥物聯(lián)合使用后對部分菌株有協(xié)同抑菌作用，并且復配的比例因菌種不同而不同，在最大濃度組合即當DP7濃度為64 mg/L，hLYZ濃度為1 250 mg/L 時，對于敏感菌株都有協(xié)同抑菌作用；當DP7濃度為64 mg/L，hLYZ濃度為312.5mg/L時，對絕大部分菌株有協(xié)同抑菌作用。本組實驗中hLYZ對照組的結果均為陰性，后續(xù)實驗中考慮加大樣本量、加大實驗濃度觀察。臨床實驗選擇的復合多肽溶菌酶漱口水，主要由重組hLYZ100 U/L及DP7型AMPs 0.1 g/L復配而成，已開展對于口腔黏膜病的研究，其濃度配比與本組體外抑菌實驗數(shù)據(jù)存在差異，在后續(xù)實驗中將考慮此因素，對于不同口腔疾病選擇更合適的濃度配比。

hLYZ是一種堿性球蛋白，廣泛存在于人體的細胞、組織器官和體液中。它通過水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄胺中的β-1,4-糖苷鍵，在滲透壓作用下導致革蘭氏陽性菌細胞壁破裂，直接溶解G+細菌[2]。在分泌性免疫球蛋白A和補體協(xié)同作用下，也能間接溶解革蘭氏陰性細菌。溶菌酶已在醫(yī)療、食品、生物學領域廣泛應用，用于口腔潰瘍、急慢性咽炎、燒傷創(chuàng)面、食品防腐與保存等[3-5]。hLYZ不易產(chǎn)生耐藥性，是新一代抗菌劑的理想選擇，它還能和抗生素、乳鐵蛋白、溶菌酶等發(fā)生協(xié)同作用從而提高活性[6]。通過DNA重組技術獲得了重組hLYZ，其純度高，制備相對容易[7-8]。AMPs廣泛存在于生物體內(nèi)，在宿主天然免疫和獲得性免疫中有很重要的作用[9]。其水脂雙親性、陽離子性、疏水性、a-螺旋結構、β-折疊、肽鏈長度、端基結構等都可影響其功能的發(fā)揮[10-12]，其主要抗菌機理是通過細胞膜滲透作用和直接作用于胞內(nèi)不同靶點發(fā)揮抗菌作用,既能在細胞內(nèi)部起作用，也能激活致死途徑，誘導水解作用使細胞壁降解[13]。

綜上所述，AMPs -DP7和hLYZ聯(lián)合應用對引起智牙冠周炎的部分細菌具有良好的協(xié)同抑菌效果，對智牙冠周炎臨床癥狀的改善有積極影響。由于本研究選擇菌種有限，在后續(xù)研究中會繼續(xù)增加其他常見冠周炎致病菌群，充實樣本量，同時也發(fā)現(xiàn)更適宜的濃度比。在沖洗和含漱過程中，患者反映復合多肽溶菌酶漱口水口味過于濃烈，需待改進配方，減少刺激性。

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(學術編輯：劉英)

The application of composite polypeptide lysozyme on treatment of opsigenes pericoronitis

XIAO Ya-yi1,YANG Li2,MOU Yan-dong3

(1.Department of Stomatology,Nanchong Central Hospital,Nanchong 637100;2.State Key Laboratory of Biological Treatment,Sichuan University,Chengdu 610041;3.Department of Stomatology,Sichuan Provincial People’s Hospital,Chengdu 610000,Sichuan,China)

Composite polypeptide lysozyme；Opsigenes pericoronitis；Synergistic antibacterial；Clinical curative effect

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.010論著

四川省科技支撐計劃項目(2015SZ0013)

2016-01-19

蕭雅一(1981-)，女，主治醫(yī)師。E-mail：3138991746@qq.com

牟雁東，E-mail：995448060@qq.com

網(wǎng)絡出版時間：2016-8-217∶48網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.018.html

1005-3697(2016)04-0486-04

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