調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在慢性髓系白血病中的變化

陳曦希，楊明珍，夏瑞祥

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調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在慢性髓系白血病中的變化

陳曦希，楊明珍，夏瑞祥

目的 探討未治和經(jīng)治慢性髓系白血病（CML）患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）及其相關(guān)細(xì)胞因子的變化。方法 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25highCD127low/-Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，ELISA法檢測白介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和白介素-35（IL-35）的血漿濃度。結(jié)果 初診組、復(fù)查組和對照組間Treg細(xì)胞比例和血漿IL-10濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。初診組的血漿TGF-β1和IL-35濃度顯著高于復(fù)查組和對照組（P＜0.001）；復(fù)查組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 初診CML患者的TGF-β1和IL-35水平升高，表明其在疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并可能有判斷療效的價值。

慢性髓系白血??；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子-β；白介素-35；腫瘤免疫

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.042.html

慢性髓系白血病（chronicmyelocyticleukemia，CML）是一種發(fā)生在造血干細(xì)胞上的克隆性骨髓增殖性疾病，以9號染色體和22號染色體易位形成BCR-ABL融合基因為特征，該基因編碼的蛋白（p210，分子量為210 ku）有異常的酪氨酸激酶活性，在CML的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［1］。臨床上CML分為慢性期、加速期和急變期。靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）是目前治療CML的首選用藥。盡管研究［2］表明CML是一種有免疫原性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，但是大多數(shù)CML患者并不能建立有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。這可能是由抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的因素所致。近年來，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在腫瘤免疫中的作用獲得廣泛關(guān)注。Treg細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在正常小鼠和人類，Treg細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞的5%～10%［2-5］。而在腫瘤患者，異常增高的Treg細(xì)胞可能抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，加速腫瘤進(jìn)展。分泌免疫抑制性細(xì)胞因子是Treg細(xì)胞發(fā)揮作用的主要途徑［4］，如白介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和白介素-35（interleukin-35，IL-35）。由于CML是最容易受免疫治療影響的惡性腫瘤之一［1］，調(diào)控Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)可能成為CML治療的新手段。但是對Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在CML中的作用了解甚少。該研究通過檢測CML患者外周血中Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的水平，探究其在CML中的表達(dá)和臨床意義。

1　材料與方法

1.1病例資料 收集2015年1月～2015年9月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科的50例成年CML患者。30例為初診未治患者（初診組，其中慢性期25例、加速期4例、急變期1例），男19例，女11例，年齡21～75歲，中位年齡47歲。另20例為TKI治療過程中的復(fù)查患者（復(fù)查組，BCR-ABL 210轉(zhuǎn)錄本水平均已降至10%以下），男13例，女7例；年齡21～75歲，中位年齡45歲。診斷和分期符合《中國慢性髓系白血病診斷與治療指南（2011年版）》［6］。以我院20例健康體檢者為對照組，男10例，女10例；年齡23～72歲，中位年齡47歲。對照組無腫瘤、自身免疫性疾病及炎癥性疾病。初診組、復(fù)查組與對照組之間年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2試劑和儀器 鼠抗人CD25-FITC、CD127-PE、CD4-PC5及同型對照抗體、紅細(xì)胞裂解劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）及NAVIOS流式細(xì)胞儀均購自美國Beckman Coulter公司；ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3標(biāo)本采集 采集CML患者和健康體檢者的晨起空腹外周血6 ml，置于肝素鈉抗凝真空采集管，輕輕混勻。標(biāo)本分兩部分處理：一部分立即送至實驗室，進(jìn)行CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞檢測；另一部分以2 000 r/min離心5 min分離血漿，置于EP管并凍存于-80℃冰箱，備用于細(xì)胞因子檢測。

1.4流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞比例 取流式上樣管，加入10μl CD25-PC5、20 μl CD4-FITC、20 μl CD127-PE，再加入肝素鈉抗凝全血100 μl（同時設(shè)同型對照），混勻，4℃避光孵育20 min。加入1 ml紅細(xì)胞裂解劑，混勻，避光放置10 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清液。用PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測。每管收集30 000個細(xì)胞。在前向角散射（FSC）—側(cè)向角散射（SSC）散點圖上圈定淋巴細(xì)胞群，再以CD4和SSC設(shè)門選擇CD4+細(xì)胞，分析CD25和CD127表達(dá)，計算CD4+CD25highCD127low/-Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。應(yīng)用Navios tetra軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5ELISA法檢測血漿細(xì)胞因子濃度 采用ELISA法測定血漿IL-10、IL-35和TGF-β1濃度。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。每份樣本測定3孔，用酶標(biāo)儀檢測每個測試孔的吸光度（optical density，OD）值，計算平均濃度。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以±s表示；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；不符合正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)和四分位間距［M（Q25，Q75）］表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，進(jìn)一步兩兩比較采用擴展的t檢驗法。

2　結(jié)果

2.1CD4+CD25highCD127low/-Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例初診組、復(fù)查組和對照組CD4+CD25highCD127low/-Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.983，P＞0.05），但初診組CD4+CD25highCD127low/-Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例［（6.34±1.97）%］略低于復(fù)查組［（6.41± 2.07）%］和對照組［（7.58±1.48）%］趨勢，見圖1。

2.2血漿IL-10濃度 血漿IL-10濃度在初診組、復(fù)查組和對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（H= 4.273，P＞0.05），見表1。初診組的血漿IL-10濃度略低于復(fù)查組和對照組。

2.3血漿TGF-β1濃度 初診組、復(fù)查組和對照組的血漿TGF-β1濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H= 31.642，P＜0.001）。其中，初診組的血漿TGF-β1濃度顯著高于復(fù)查組（t=6.725，P＜0.001）和對照組（t=5.801，P＜0.001）。復(fù)查組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.843，P＞0.05），見表1。

2.4血漿IL-35濃度 血漿IL-35濃度在初診組、復(fù)查組和對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=24.644，P＜0.001）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，初診組的血漿IL-35濃度顯著高于復(fù)查組（t=5.227，P＜0.001）和對照組（t=4.975，P＜0.001）。復(fù)查組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.229，P＞0.05），見表1。

圖1　CD4+CD25highCD127low/-Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例流式圖

3　討論

Treg細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。異常增高的Treg細(xì)胞可能抑制腫瘤特異性免疫應(yīng)答，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視，從而加速腫瘤進(jìn)展［2］。一般認(rèn)為，分泌免疫抑制性細(xì)胞因子是Treg細(xì)胞發(fā)揮作用的主要途徑［4］。其中，IL-10、TGF-β1和IL-35是最重要的細(xì)胞因子。

表1　Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的血漿濃度［M（Q25，Q75）］

研究［3］顯示，CD4+CD25hig hFOXP3+Treg細(xì)胞在多種實體腫瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的腫瘤組織或外周血中比例升高，與疾病預(yù)后不良及進(jìn)展有關(guān)。Rojas et al［5］發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)BCR-ABL的CML患者的CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞比例升高。Zahran et al［2］的研究也表明，初診CML患者的CD4+CD25highFOXP3+Treg細(xì)胞比例顯著高于健康對照組；加速期和急變期患者高于慢性期患者；治療后獲得完全分子學(xué)緩解的患者顯著低于治療前。但是，當(dāng)采用不同的分子標(biāo)記Treg細(xì)胞時，結(jié)果可能截然不同。CML慢性期未治療患者和加速急變期患者的CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞占外周血單個核細(xì)胞比例顯著低于慢性期治療患者和健康對照者［7］。本研究同樣以CD4+、CD25high和CD127low/-為標(biāo)志物，檢測了CML患者外周血中Treg細(xì)胞水平。結(jié)果顯示初診組與復(fù)查組的外周血CD4+CD25highCD127low/-Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在 70份樣本中，CD4+CD25highCD127low/-Treg細(xì)胞比例的最低值來自于唯一的急變期患者，僅1.2%。截然不同的研究結(jié)果可能是由對Treg細(xì)胞的標(biāo)記不同或者樣本量偏小導(dǎo)致。目前對于CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞和CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞究竟是不是同一細(xì)胞尚無定論，對于如何定義和標(biāo)志Treg細(xì)胞也沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，需要在擴大樣本量的基礎(chǔ)上明確標(biāo)志物不同對檢測CML患者外周血Treg細(xì)胞比例的影響。

IL-10和TGF-β在體內(nèi)的免疫抑制作用已經(jīng)在多種實驗?zāi)Ｐ蜕系玫阶C實［4］。但是，在本研究中，血漿IL-10濃度在3組間未見差異有統(tǒng)計學(xué)意義。IL-10是一種多細(xì)胞源的細(xì)胞因子。因此，血漿IL-10水平可能難以反映CML患者體內(nèi)Treg細(xì)胞功能的變化。TGF-β也是一種多細(xì)胞源的多功能細(xì)胞因子。研究［7］表明，CML腫瘤干細(xì)胞中的BCR-ABL腫瘤蛋白誘導(dǎo)TGF-β1產(chǎn)生，后者激活PI3K-Akt-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該通路的活化增加了基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的產(chǎn)生，從而促進(jìn)可溶性Kit配體（s-KitL）和細(xì)胞間黏附分子1（s-ICAM-1）的合成。異常增高的MMP-9會降解細(xì)胞外基質(zhì)；s-ICAM-1合成增加能夠保護白血病細(xì)胞免受T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞識別，s-KitL合成增加能夠動員CML細(xì)胞釋放至外周循環(huán)［8］。因此，TGF-β1可能促進(jìn)CML進(jìn)展。此外，TGF-β1還通過 PI3K-Akt-FoxO信號通路維持CML腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性和致瘤活性［9］。本研究的結(jié)果顯示，初診組的血漿TGF-β1濃度顯著高于復(fù)查組和對照組，而復(fù)查組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明檢測血漿TGF-β1濃度可能有評價療效的價值。

IL-35是新近發(fā)現(xiàn)的抑制性細(xì)胞因子，主要由活化的Treg細(xì)胞分泌［10］。IL-35不僅強效抑制T細(xì)胞增殖［11］，還能夠誘導(dǎo)初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（iTr35），形成“傳染性耐受”，將抑制活性最大化［10，12-13］。本研究初診組的血漿IL-35濃度顯著高于復(fù)查組和對照組，而復(fù)查組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]到初診組的Treg細(xì)胞比例與復(fù)查組和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而主要由Treg細(xì)胞分泌的IL-35水平顯著升高，可以推測CML患者體內(nèi)存在Treg細(xì)胞功能異常。確切的結(jié)果需要進(jìn)一步的體外細(xì)胞功能測定研究。但是，研究［14］顯示IL-35過度表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤活性。因此，IL-35對于不同腫瘤可能作用不同。IL-35在CML中的作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過檢測外周血中Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的水平，表明初診CML患者的TGF-β1和IL-35水平顯著升高，與機體細(xì)胞免疫功能紊亂可能互為因果。尚需進(jìn)一步研究明確Treg細(xì)胞的功能狀態(tài)以及TGF-β1和IL-35在疾病發(fā)生、發(fā)展中的具體作用，聯(lián)合TKI類藥物，對其進(jìn)行調(diào)控可能是治療CML的新方法。

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Changes of regulatory T cells and their associated cytokines in patients with chronic myeloid leukemia

Chen Xixi，Yang Mingzhen，Xia Ruixiang
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the changes in the proportion of regulatory T（Treg）cells and in the levels of cytokines secreted by these cells in the peripheral blood in the patients with chronic myeloid leukemia（CML）. Methods The enrolled subjects consisted of 30 CML patients who were newly diagnosed，20 CML patients who were under the effective treatment of tyrosine kinase inhibitors（BCR-ABL 210 transcript ratio is below 10%）and 20 healthy donors whose age and sex were matched.Flow cytometry was used to detect CD4+CD25highCD127low/-Treg cells and CD4+T cells.The enzyme linked immunosorbent assay was used to determine the plasma concentrations of interleukin-10（IL-10），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and IL-35.Results The proportions of Treg cells in CD4+T cells were similar among the three groups.As concerns the three kinds of Treg-associated cytokines，there were no significant differences in the plasma concentrations of IL-10 among the three groups.However，compared with the treatment group and the control group，the plasma concentrations of TGF-β1 and IL-35 in the newly diagnosed patients significantly increased（P＜0.001），with no significant difference between the treatment group and the control group.Conclusion Though the proportion of Treg cells did not significantly change in the newly diagnosed patients，the plasma concentrations of TGF-β1 and IL-35 indeed significantly enhanced，suggesting the dysfunction of Treg cells in the newly diagnosed patients might be associated with the progression of disease.Effective treatment of tyrosine kinase inhibitors could down-regulate the plasma levels of these cytokines to baseline，suggesting that monitoring these cytokines might evaluate the efficacy of therapy.

chronic myeloid leukemia；regulatory T cells；transforming growth factor-β；interleukin-35；tumor immunity

R 557+.3

A

1000-1492（2016）07-1015-04

2016-04-22接收

安徽省科技攻關(guān)項目（編號：11010402168）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，合肥 230022

陳曦希，女，碩士研究生；楊明珍，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：yangmz89@163.com.cn；夏瑞祥，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xrx2041@163.com