地塞米松治療前后免疫性血小板減少癥患者樹突狀細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子變化的研究

謝研研，楊明珍

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地塞米松治療前后免疫性血小板減少癥患者樹突狀細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子變化的研究

謝研研，楊明珍

目的 探討免疫性血小板減少癥（ITP）患者外周血樹突狀細(xì)胞（DC）亞群的變化及CD80、CD86表達(dá)量的改變，進(jìn)一步檢測白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-4、IL-10及干擾素-γ（IFN-γ）細(xì)胞因子含量的變化，并回顧性分析其與地塞米松治療療效間的關(guān)系。方法 留取肝素抗凝的60例ITP患者及10例正常對照者外周血標(biāo)本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血DC亞群的分布情況，采用ELISA法檢測相關(guān)細(xì)胞因子的含量。結(jié)果 ITP患者治療前較正常對照組DC亞群DC2比例升高（P＜0.05），治療后與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療前DC1、DC2上CD80的表達(dá)水平較正常對照組升高（P ＜0.05），DC2細(xì)胞上CD86的表達(dá)水平較正常對照組升高（P＜0.05），地塞米松治療后表達(dá)水平均下降；ITP患者治療前較正常對照組IL-2、IFN-γ水平升高（P＜0.05），地塞米松治療后表達(dá)水平下降；IL-4、IL-10治療前水平下降（P＜0.05），地塞米松治療后表達(dá)水平上升。結(jié)論 DC數(shù)量與功能的紊亂及IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的水平變化均參與了ITP的發(fā)病，其與地塞米松的療效可能有重要的聯(lián)系。

免疫性血小板減少癥；樹突狀細(xì)胞亞群；細(xì)胞因子；地塞米松

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.034.html

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是由體液免疫和細(xì)胞免疫共同異常導(dǎo)致血小板破壞的一類自身免疫性疾病［1］，其發(fā)病率（5 ～10）/105人口［2］。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是體內(nèi)專職的最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），在活化的T、B淋巴細(xì)胞中起重要作用。根據(jù)DC的功能及其分子學(xué)標(biāo)志，可以分為髓樣樹突細(xì)胞（DC1，分子學(xué)標(biāo)志為HLA-DR+Lin-CD11c+）和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（DC2，分子學(xué)標(biāo)志為HLA-DR+Lin-CD123+）。DC1促進(jìn)輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）中Th0向Th1分化，DC2促進(jìn)Th0向Th2分化；Th1主要分泌白介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等相關(guān)細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫遲發(fā)型超敏性炎癥的發(fā)生［3］，Th2主要分泌IL-4、IL-10等相關(guān)細(xì)胞因子，主要刺激B細(xì)胞增殖產(chǎn)生免疫球蛋白（IgG），與體液免疫有關(guān)［4］。該實(shí)驗(yàn)收集60例ITP患者外周血標(biāo)本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC1、DC2的分布情況及其表面CD80、CD86水平，采用ELISA法檢測細(xì)胞因子的表達(dá)水平，與正常對照組比較；并回顧性分析其表達(dá)量的變化與地塞米松療效間有無相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1病例資料 選取2014年12月～2015年10月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科住院的ITP患者60例，其中男18例，女42例；年齡18～63歲，中位年齡36歲；其中新診斷ITP 18例、持續(xù)性ITP 19例、慢性ITP 23例，均符合ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。后續(xù)對其中40例患者檢測IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ細(xì)胞因子表達(dá)水平。正常對照組均為同期健康體檢人群，其中男6例，女4例；年齡22～61歲，中位年齡36歲。

1.2療效判定 予以大劑量地塞米松沖擊治療（40 mg/d，連續(xù)4 d靜脈輸注）。病情嚴(yán)重者予以地塞米松非胃腸道給藥?；颊叩厝姿莎熜гu估參考文獻(xiàn)［1］，有效：地塞米松治療4周后患者血小板（PLT）≥30×109/L，并且至少比基礎(chǔ)血小板計(jì)數(shù)增加2倍，無出血癥狀；無效：標(biāo)準(zhǔn)治療4周后PLT＜30×109/L，或血小板計(jì)數(shù)增加少于基礎(chǔ)值2倍，或有出血癥狀。

1.3實(shí)驗(yàn)器材和試劑 Lin混合抗體（CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD56、CD235a）-FITC、HLA-DRPerCP-Cyanine5.5、CD11c-PE、CD123-PE、CD80-ECD、CD86-PC7、同型對照抗體鼠抗體IgG1和IgG2a（PE標(biāo)記）購自美國BD公司；IL-2、IL-4、IL-10及INF-γ的ELISA試劑盒購自上海晶美生物公司；流式細(xì)胞儀購自美國COULTER公司；RT-2100c酶標(biāo)自動分析儀購自貝克曼公司；紅細(xì)胞裂解劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）、淋巴細(xì)胞分離液、1%甲醛購自合肥欣宜生物公司。

1.4標(biāo)本采集 分別采集ITP患者及健康對照者的晨起空腹新鮮外周靜脈血3 ml，置于肝素抗凝真空采血管，輕輕混勻，于2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。留取患者和正常對照者血清，置于-80℃冰箱保存，待行細(xì)胞因子檢測。

1.5實(shí)驗(yàn)步驟

1.5.1檢測DC1、DC2及其表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)水平 參照文獻(xiàn)［5］方法。①取400 μl肝素抗凝的ITP患者外周血分裝4管，每管中加入FITC標(biāo)記的Lin混合抗體和PerCP-Cyanine5.5標(biāo)記的HLA-DR單抗各10 μl標(biāo)記細(xì)胞，同時各管內(nèi)分別加入PE標(biāo)記CD11c、CD123、IgG1、IgG2a單抗各5 μl，其中3、4管作為陰性對照，震蕩混勻，避光孵育20 min；加入紅細(xì)胞裂解液1 ml，震蕩混勻，避光15 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；加入3 ml PBS洗滌液，震蕩混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；再加入300 μl PBS懸浮細(xì)胞，另加入1%甲醛200 μl固定液，樣本24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測；②ITP患者外周血采用兩倍體積PBS稀釋，采用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量級為1×107/ml，各取100 μl懸浮液至于6只管中，每管中加入FITC標(biāo)記的Lin混合抗體和Per-CP-Cyanine5.5標(biāo)記的HLA-DR單抗各10μl標(biāo)記細(xì)胞，同時管中加入PE-IgG1+CD80-ECD、PE-IgG1 +CD86-PC7、CD11c-PE+CD80-ECD、CD11c-PE+ CD86-PC7、CD123-PE+CD80-ECD、CD123+CD86-PC7單抗各5 μl，冰上孵育30 min，加入冷PBS洗滌1次，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.5.2檢測細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ表達(dá)水平 ITP患者凍存待檢血清，凍解后，應(yīng)用ELISA法定量測定，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行檢測，以吸光度（absorbance，A）值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做的相應(yīng)的曲線，計(jì)算A值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)予以正態(tài)性檢驗(yàn)，以±s表示，統(tǒng)計(jì)資料多組間均值進(jìn)行單因素方差分析，各組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1DC亞群的比例水平 ITP患者治療前、治療后DC2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.698，P＜0.05）。ITP治療前DC2表達(dá)比例與正常對照組、治療后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　外周血DC亞群比例的比較（%，±s）

表1　外周血DC亞群比例的比較（%，±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與ITP患者治療后比較：#P＜0.05

組別　n DC1　DC2正常對照10　0.280±0.083　0.129±0.073 ITP患者治療前　60　0.242±0.115　0.297±0.151*#ITP患者治療后51　0.278±0.157　0.164±0.096

2.2DC1和DC2上CD80、CD86表達(dá)量的檢測ITP患者DC1表面CD80的表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.624，P＜0.05），DC2表面CD80、CD86的表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.214、9.067，P＜0.05）。治療前DC2表面共刺激分子CD80、CD86和DC1表面CD80升高，與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后表達(dá)量下降（P＜0.05）。見表2。

2.3IL-2、IL-4、IL-10及INF-γ表達(dá)水平的檢測ITP患者IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.321、14.256、11.658、9.899，P＜0.05）。與正常對照組比較，治療前IL-2、IL-4升高，IL-10、IFN-γ下降（P＜0.05）。與治療前比較，治療后IL-2、IL-4下降，IL-10、IFN-γ上升（P ＜0.05）。地塞米松治療有效組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。地塞米松治療無效組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表2　兩組外周血DC亞群DC1與DC2上CD80、CD86比例的比較（%，±s）

表2　兩組外周血DC亞群DC1與DC2上CD80、CD86比例的比較（%，±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與　ITP患者治療后比較：#P＜0.05

組別　n　DC1 CD80　CD86 DC2 CD80　CD86正常對照　10　3.18±0.79　90.37±6.51　3.02±1.06　46.63±6.07 ITP患者治療前　60　8.69±0.91*#　92.11±4.82　11.30±3.77*#　71.30±6.80*#ITP患者治療后　51　4.64±0.78　90.80±3.38　5.55±1.55　55.75±6.44

表3　IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ表達(dá)水平比較（±s）

表3　IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ表達(dá)水平比較（±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與　ITP患者治療后比較：#P＜0.05；與ITP患者治療前比較：△P＜0.05

組別　n　IL-2（pg/ml）　INF-γ（pmo/ml）　IL-4（pg/ml）　IL-10（pg/ml）正常對照　10　22.13±10.12　65.73±24.48　10.87±17.63　28.14±11.36 ITP患者治療前　40　42.43±11.79*#　106.46±28.26*#　26.39±11.47*#　13.28±9.89*#ITP患者治療后　40　20.63±12.51　71.62±25.84　38.93±14.18　26.78±12.01地塞米松治療有效　28　24.03±9.87△　65.57±22.41△　41.35±15.38△　27.48±11.82△地塞米松治療無效　12　31.19±12.34　83.98±27.73　30.72±12.18　18.34±10.03

3　討論

ITP是一種自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)，急性ITP是由于患者體內(nèi)產(chǎn)生了抗血小板的特異性抗體，形成抗原-抗體復(fù)合物，被單核-巨噬系統(tǒng)過度吞噬，從而引起疾病發(fā)病，但此并非ITP的唯一發(fā)病機(jī)制。研究［6］表明，ITP存在多種細(xì)胞因子異常。急性ITP多為體液免疫介導(dǎo)，而慢性ITP細(xì)胞免疫異常占主導(dǎo)作用，多種致病因素所引導(dǎo)的ITP患者體內(nèi)體液及細(xì)胞免疫紊亂，其中活化的Th起重要的作用。

DC是體內(nèi)專職的APC，可以誘發(fā)T細(xì)胞免疫，也可以通過對T細(xì)胞的殺傷或者對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的誘導(dǎo)作用，介導(dǎo)發(fā)生免疫耐受的現(xiàn)象［7］。血小板特異性抗體的產(chǎn)生需要T淋巴細(xì)胞的參與［8］，而 T淋巴細(xì)胞的活化、分化及增殖又與DC有著密切的關(guān)聯(lián)，APC與T細(xì)胞活化存在兩個主要的信號通路，第一信號為T細(xì)胞表面受體與APC表面的抗原肽-MHC復(fù)合物相結(jié)合；第二信號為T細(xì)胞與APC之間的協(xié)同刺激，途徑為APC的表面B7家族成員CD80、CD86與T細(xì)胞表面CD28、CTLA-4相結(jié)合［9］，DC、T淋巴細(xì)胞及B細(xì)胞產(chǎn)生抗體之間存在著復(fù)雜的關(guān)系，凌云等［5］發(fā)現(xiàn)成人ITP患者的外周血DC亞群數(shù)量和功能均存在異常，DC在ITP發(fā)病中占了重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)顯示ITP患者外周血DC亞群比例失衡，DC1在患者治療前后與正常對照者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但DC2比例較正常對照者明顯升高，大劑量地塞米松治療后DC2比例下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢性ITP患者DC趨于成熟，CD80、CD86表達(dá)量升高，T淋巴細(xì)胞活化的第二信號加強(qiáng)，激活免疫應(yīng)答［10］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究顯示，不同DC亞群CD80、CD86的表達(dá)量不同，DC2表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86與DC1表面協(xié)同刺激分子CD80表達(dá)量升高，地塞米松治療后下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但DC1表面CD86治療前后與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DC在機(jī)體免疫過程中，分泌大量的IL-12，促進(jìn) T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生分化［10］，在ITP患者中，Th1生成增多，Th2生產(chǎn)減少，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、TFN-γ等，可以介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2主要分泌IL4、IL-10等，刺激B細(xì)胞分化成抗體產(chǎn)生細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)顯示ITP患者治療前IL-2、IFN-γ表達(dá)水平升高，治療后表達(dá)水平下降，與正常對照者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而IL-4、IL-10表達(dá)水平下降，治療后上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

大劑量地塞米松沖擊療法作為ITP患者治療的一線方案，但并非100%的ITP患者有效，Zeng et al［11］發(fā)現(xiàn)當(dāng)ITP患者的血小板特異性抗體為GPIba時，激素治療效果差，提示患者為GPIba抗體介導(dǎo)的ITP時，可能存在著不同于GPIIb/IIIa介導(dǎo)的途徑。同時大劑量地塞米松可以抑制DC的數(shù)量，減少DC分泌的IL-12，進(jìn)而抑制了Th0向Th1分化，減輕了Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，Th1/Th2維持平衡［12］。但是否所有的細(xì)胞免疫介導(dǎo)的ITP對地塞米松治療都是有效的仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，比較地塞米松治療有效組與無效組間的差異性。本實(shí)驗(yàn)顯示在地塞米松治療有效組和無效組間，DC1、DC2治療前后的變化不一致，IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ變化也是不一致的，提示地塞米松的療效與多種因素有關(guān)。

ITP患者的發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，DC亞群失調(diào)，共刺激信號增強(qiáng)，細(xì)胞因子同時分泌紊亂，進(jìn)一步研究其與地塞米松治療療效間的關(guān)系，可能為ITP的個體化治療帶來福音，避免地塞米松治療無效給患者帶來的副作用。

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Changes of dendritic cell subsets and cytokine before and after dexamethasone treatment in ITP patients

Xie Yanyan，Yang Mingzhen
（Dept of Hemopathology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the changes of dendritic cell subsets and CD80，CD86 expression in peripheral blood in patients with immune thrombocytopenia（ITP），and to evaluate the changes of serum interleukin-2（IL-2），serum interleukin-4（IL-4），serum interleukin-10（IL-10）and interferon-γ（IFN-γ）before and after dexamethasone treatment，overall，further analyzing the relationship between them and dexamethasone.Methods Collecting blood samples of 60 ITP patients and 10 normal controls with heparin anticoagulation，and distribution of dendritic cell subsets of ITP and normal controls was detected by flow cytometry，and the changes of serum IL-2，IL-4，IL-10 and IFN-γ were detected by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results The percentage of DC2 was increased in ITP patients compared with the control group（P＜0.05）and there was no statistically significont difference after dexamethasone treatment；the expressions of CD80 on DC1 and DC2 were increased compared with the control group（P＜0.05），as well as the expression of CD86 on DC2 and the percentage of them decreased after treatment.The serum IL-2，IFN-γ levels before the dexamethasone treatment were higher than the normal control group（P＜0.05），then decreased after treatment.However，the serum IL-4，IL-10 levels were lower than the normal control group before the treatment（P＜0.05），increased after treatment.Conclusion The disorder of the number and function of DCs and the changes of the serum IL-2，IL-4，IL-10 and IFN-γ levels may play important roles in the pathogenesis of ITP.Moreover，there is a probable key relationship between them and the effects of dexamethasone treatment.

immune thrombocytopenic；dendritic cell subsets；cytokines；dexamethasone

R 558.2

A

1000-1492（2016）07-0998-04

2016-03-23接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1208085MH154）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 230022

謝研研，女，碩士研究生；楊明珍，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yangmz89@163.com