通用轉(zhuǎn)錄因子GTFⅡF2對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移的影響

陳丹丹，耿慧武，潘林鑫，劉曉穎，范禮斌

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通用轉(zhuǎn)錄因子GTFⅡF2對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移的影響

陳丹丹，耿慧武，潘林鑫，劉曉穎，范禮斌

目的 研究通用轉(zhuǎn)錄因子ⅡF多肽2（GTFⅡF2）的表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖及遷移的影響。方法 人工合成靶向GTFⅡF2基因的siRNA序列和陰性對(duì)照siRNA序列及質(zhì)粒pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG，分別轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞中，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果 RNA干擾技術(shù)靶向沉默GTFⅡF2基因表達(dá)后，食管癌細(xì)胞增殖和遷移均明顯受到了抑制，而過(guò)表達(dá)GTFⅡF2對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖和遷移無(wú)明顯影響。結(jié)論GTFⅡF2基因在食管癌細(xì)胞TE-1、ECA-109的增殖和遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步了解GTFⅡF2基因抑制TE-1、ECA-109細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

GTFⅡF2；基因表達(dá)；RNA干擾；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.028.html

通用轉(zhuǎn)錄因子ⅡF多肽2（general transcription factorⅡF subunit 2，GTFⅡF2）由Sopta et al［1］從HeLa細(xì)胞提取，在早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞HL60 cDNA文庫(kù)中篩選表達(dá)生成的相關(guān)蛋白。人的GTF ⅡF2基因位于染色體13q14上，全長(zhǎng)750 bp，包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，編碼249個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約為28 ku。GTFⅡF參與基因轉(zhuǎn)錄的起始、啟動(dòng)子清除、延伸過(guò)程，是由GTFⅡF2的N-末端和GTFⅡF1兩種亞基組成的四聚體分子。GTFⅡF2中間部分通過(guò)RPB5結(jié)合到RNA聚合酶Ⅱ，對(duì)轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程起到重要作用。GTFⅡF2的C-末端包含一個(gè)非特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該蛋白有特有的依賴 ATP的DNA解旋酶活性［1］，很多重要的轉(zhuǎn)錄因子以GTFⅡF2為靶分子，通過(guò)與其相互作用影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，影響并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，因此GTFⅡF2被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中重要的基本轉(zhuǎn)錄因子。研究［2-3］證實(shí)GTFⅡF2功能發(fā)生變化將導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。該研究主要借助RNA干擾技術(shù)對(duì)GTFⅡF2基因表達(dá)進(jìn)行沉默以及過(guò)表達(dá)GTFⅡF2，研究其表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞TE-1、ECA-109的增殖和遷移的影響。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG質(zhì)粒、TG1感受態(tài)細(xì)胞、食管癌細(xì)胞株 TE-1和ECA-109均由安徽醫(yī)科大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑與儀器 結(jié)晶紫、臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自上海生工生物有限公司；siRNA的序列由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成；Gibco胎牛血清、LipofectamineTM2000 Reagent、Opti-MEM Reduced serum Medium購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；EcoRⅠ、EcoRⅤ限制性內(nèi)切酶及Lambda DNA EcoRⅠ+HindⅢMarker均購(gòu)自加拿大Fermentas公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和分光光度計(jì)NanoDrop 2000購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液和一抗、二抗稀釋液以及Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司；GTFⅡF2（H-148）抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；β-actin購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自上海睿鈺生物科技有限公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 已設(shè)計(jì)并且合成兩對(duì)GTFⅡF2 siRNA序列，即GTFⅡF2 siRNA1：正義鏈為5′-GUCACAGCAAUGGGCUAAAdTdT-3′，反義鏈為 5′-UUUAGCCCAUUGCUGUGACdTdT-3′；GTFⅡF2 siRNA2：正義鏈為5′-GUGUUGGAGGACAGACAUUdTdT-3′，反義鏈為5′-AAUGUCUGUCCUCCAACACdTdT-3′。

轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于600～800 μl無(wú)抗生素培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染siRNA和pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG每孔分別為4×104和2×105個(gè)細(xì)胞。鋪板次日，轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯合至30%～40%，過(guò)表達(dá)細(xì)胞匯合度80%～90%，進(jìn)行siRNA和過(guò)表達(dá)GTFⅡF2-FLAG轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。其中siRNA的終濃度擬設(shè)定為50 nmol/L，pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG轉(zhuǎn)染1 μg，每組2個(gè)復(fù)孔。按LipofectamineTM2000說(shuō)明書轉(zhuǎn)染siRNA和pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG質(zhì)粒。將轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，換新鮮不含抗生素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)液。37℃、5%CO2培養(yǎng)孵育48 h，收集并且裂解細(xì)胞進(jìn)行GTFⅡF2基因表達(dá)后的檢測(cè)。

1.3.2Western blot檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后約48 h，用含蛋白酶抑制劑PMSF的Western細(xì)胞裂解液將TE-1、ECA-109細(xì)胞冰上裂解約0.5 h，收集細(xì)胞；4℃、14 000 r/min離心20 min，使用 Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量；取30 μg與等體積2×SDS上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，冰浴3 min后，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳約2 h；轉(zhuǎn)移至PVDF膜，100 V恒壓電轉(zhuǎn)1 h，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，0.05%Tween-20的TBST洗滌PVDF膜3次；GTFⅡF2一抗（1∶500，用一抗稀釋液稀釋）4℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液稀釋）室溫孵育約2 h；TBST洗膜后用ECL試劑盒顯色，在暗室中用X光片曝光并顯影和定影，X光片晾干后掃描。

1.3.3克隆形成實(shí)驗(yàn) 通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GTFⅡF2 siRNA和過(guò)表達(dá)GTFⅡF2對(duì)食管癌細(xì)胞抗惡性細(xì)胞增生的影響。GTFⅡ F2 siRNA和pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG在轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，2 000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，輕輕晃動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 d，期間經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿置于冰上，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS小心浸洗2次。加約500 μl的-20℃預(yù)冷甲醇，固定細(xì)胞10 min。棄固定液，加適量0.5%結(jié)晶紫（25%甲醇配制）染色液在室溫下孵育15～20 min，然后用蒸餾水洗去染液，空氣干燥，之后拍照分析。

1.3.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 先用Marker筆在24孔板背后，均勻劃?rùn)M線，約每隔0.5～1.0 cm一條，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)3條線。在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而異，以過(guò)夜能鋪滿為標(biāo)準(zhǔn)。第二天用100 μl槍頭，垂直于背面的橫線于匯合完全的單細(xì)胞層中劃線。用PBS洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，每組2個(gè)復(fù)孔，常規(guī)放入 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按 0、24、48 h取樣拍照。

2　結(jié)果

2.1Western blot分析GTFⅡF2蛋白表達(dá)水平

siRNA1、siRNA2和pcDNA3.1-GTFⅡ F2-FLAG分別轉(zhuǎn)染于TE-1、ECA-109細(xì)胞48 h后提取總蛋白，Western blot法檢測(cè)GTFⅡF2蛋白表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA和GTFⅡF2 siRNA1細(xì)胞GTFⅡF2蛋白表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染的基本一致，而轉(zhuǎn)染GTFⅡF2 siRNA2細(xì)胞GTFⅡF2蛋白表達(dá)水平顯著低于未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA和GTFⅡF2 siRNA1細(xì)胞。GTFⅡF2 siRNA2基因表達(dá)抑制率達(dá)到90%，表明該GTFⅡF2靶向siRNA2能夠有效沉默食管癌細(xì)胞中GTFⅡF2基因的表達(dá)（P ＜0.01）。見(jiàn)圖1。而過(guò)表達(dá)GTFⅡF2無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖2。

2.2GTFⅡF2表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響用于克隆形成實(shí)驗(yàn)剩余的細(xì)胞再經(jīng)Western blot法分析GTFⅡF2蛋白表達(dá)情況，再次證實(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA與未轉(zhuǎn)染的基本一致，而轉(zhuǎn)染GTFⅡF2 siRNA2細(xì)胞GTFⅡF2蛋白表達(dá)水平顯著低于未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

經(jīng)結(jié)晶紫染色后，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA與未轉(zhuǎn)染平均細(xì)胞量的基本一致，而轉(zhuǎn)染GTFⅡF2 siR NA2平均細(xì)胞量顯著低于未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA。表明該GTFⅡF2靶向siRNA2能夠有效抑制食管癌細(xì)胞TE-1、ECA-109的增殖（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。對(duì)GTFⅡF2的過(guò)表達(dá)進(jìn)行同樣的研究，結(jié)果顯示對(duì)食管癌的增殖并無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖5。

圖1　Western blot法分析knockdown GTFⅡF2蛋白表達(dá)水平

圖2　Western blot法分析過(guò)表達(dá)GTFⅡF2蛋白表達(dá)水平

圖3　Western blot法分析knockdownGTFⅡF2蛋白表達(dá)水平

圖4　GTFIIF2 siRNA2對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響

圖5　GTFⅡF2過(guò)表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響

2.3GTFⅡF2表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞遷移的影響在細(xì)胞層上用槍頭劃痕，轉(zhuǎn)染GTFⅡF2 siRNA2的細(xì)胞遷移受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖6、表1。而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞保持了原有的遷移能力，48 h后通過(guò)遷移將劃痕部分掩蓋，對(duì)GTFⅡF2的過(guò)表達(dá)進(jìn)行同樣的研究，結(jié)果顯示對(duì)食管癌的遷移并無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖7、表2。

圖6　GTFⅡF2 siRNA2對(duì)ECA-109細(xì)胞遷移的影響 ×100

圖7　GTFⅡF2 siRNA2對(duì)　TE-1細(xì)胞遷移的影響×100

表1　GTFⅡF2 siRNA對(duì)食管癌細(xì)胞遷移的影響（±s）

表1　GTFⅡF2 siRNA對(duì)食管癌細(xì)胞遷移的影響（±s）

項(xiàng)目　未轉(zhuǎn)染　陰性對(duì)照siRNA GTFⅡF2 siRNA2　F值　P值ECA-109 24 h　59.30±13.15 51.44±11.29　19.92±5.14　15.949　0.001 48 h　56.46±12.73 50.83±10.71　17.32±4.47　18.107　0.001 TE-1 24 h　64.11±16.77 60.06±14.91　26.89±7.87　8.849　0.007 48 h　61.03±15.75 59.11±14.07　23.23±6.05　11.271　0.003

表2　過(guò)表達(dá)　GTFⅡF2對(duì)食管癌細(xì)胞遷移的影響（±s）

表2　過(guò)表達(dá)　GTFⅡF2對(duì)食管癌細(xì)胞遷移的影響（±s）

項(xiàng)目　未轉(zhuǎn)染　陰性對(duì)照pcDNA3.1 FLAGGTFⅡF2　F值　P值ECA-109 24 h　59.30±13.15 58.64±13.02 59.55±14.12　0.005　0.995 48 h　56.46±12.73 55.25±12.44 54.87±12.13　0.018　0.982 TE-1 24 h　64.11±16.77 63.42±17.74 62.98±16.48　0.004　0.995 48 h　61.03±15.75 60.23±14.93 61.47±15.82　0.006　0.993

3　討論

GTFⅡF2通過(guò)在mRNA合成的起始和延長(zhǎng)過(guò)程中控制著RNA聚合酶Ⅱ的活性，影響轉(zhuǎn)錄的過(guò)程。從哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)純化的GTFⅡF2被廣泛磷酸化［4］，磷酸化酪氨酸可激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［5］，影響疾病的發(fā)生與發(fā)展。已有研究［6］表明GTFⅡF2突變體對(duì)亨廷頓疾病的發(fā)生也存在一定的影響。因此探討GTFⅡF2在致病中的作用機(jī)制有非常重要的意義。

為了研究GTFⅡF2基因在食管癌 TE-1、ECA-109細(xì)胞中的生物學(xué)作用，本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾和轉(zhuǎn)染技術(shù)分別使細(xì)胞中GTFⅡF2基因進(jìn)行靶向沉默和過(guò)表達(dá)，對(duì)細(xì)胞增殖和遷移進(jìn)行一系列的研究。本研究將設(shè)計(jì)合成的兩對(duì)siRNA序列以及構(gòu)建成功的pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG分別轉(zhuǎn)染至食管細(xì)胞TE-1和ECA-109后，經(jīng) Western blot檢測(cè)GTFⅡF2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明GTFⅡF2 siRNA2序列明顯抑制GTFⅡF2的表達(dá)，并且干擾效果優(yōu)于GTFⅡF2 siRNA1，所以后續(xù)一系列實(shí)驗(yàn)選用GTFⅡF2 siRNA2進(jìn)行。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示GTFⅡF2 siRNA2在食管癌細(xì)胞ECA-109中的knockdown效率達(dá)到90%，蛋白表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的共同參與，包括TFⅡA、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF和TFⅡH［7］。其中GTFⅡF2與RNA聚合酶Ⅱ聯(lián)系密切［8］，功能上與大腸桿菌的RNA聚合酶的sigma70亞基類似，都有識(shí)別轉(zhuǎn)錄的起始位置，并使RNA聚合酶結(jié)合在啟動(dòng)子部位的功能。Knockdown GTFⅡF2無(wú)法使轉(zhuǎn)錄正常進(jìn)行。GTFⅡF2 siRNA2在食管癌細(xì)胞ECA-109中的knockdown效率明顯高于TE-1，說(shuō)明同一序列在不同細(xì)胞中所起的作用也有差異；GTFⅡF2抑制了非特異性轉(zhuǎn)錄的起始［9］，并且募集聚合酶形成，連同起始復(fù)合物到啟動(dòng)子DNA上影響了啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的起始過(guò)程。過(guò)表達(dá)FLAG-GTFⅡF2 Western blot結(jié)果條帶偏高，其中除了有GTFⅡF2內(nèi)源性表達(dá)，F(xiàn)LAG標(biāo)簽對(duì)GTFⅡF2的表達(dá)可能也有影響。

Western blot檢測(cè)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)GTFⅡF2 siRNA2序列明顯抑制了GTFⅡF2的表達(dá)，鑒于GTFⅡF2對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)揮很重要的作用，設(shè)想knockdown GTFⅡF2之后對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖也有影響，所以本實(shí)驗(yàn)采用克隆形成實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明GTFⅡF2靶向siRNA2能夠有效抑制食管癌細(xì)胞TE-1、ECA-109的增殖，對(duì)ECA-109的抑制率約達(dá)70%，而對(duì)TE-1抑制率達(dá)到50%，其對(duì)ECA-109的效果較明顯于TE-1。但對(duì)GTFⅡF2的過(guò)表達(dá)進(jìn)行同樣的研究，結(jié)果顯示對(duì)食管癌的增殖并無(wú)明顯影響，轉(zhuǎn)染空載體與質(zhì)粒的克隆形成數(shù)量比未轉(zhuǎn)染的少，可能是由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染本身對(duì)細(xì)胞有影響，但是轉(zhuǎn)染空載體和重組質(zhì)粒的克隆形成數(shù)量相差不大。結(jié)果表明雖然GTFⅡF2作為通用轉(zhuǎn)錄因子，是轉(zhuǎn)錄過(guò)程所必需，但并非其能單一影響和調(diào)控增殖過(guò)程。RNA聚合酶Ⅱ由約10～12個(gè)亞基組成［10-11］，GTFⅡF2可能結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ的亞基RPB5來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程，影響了細(xì)胞克隆的增殖。

為了解RNA干擾GTFⅡF2及過(guò)表達(dá)GTFⅡF2之后對(duì)食管癌遷移是否有影響，進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染GTFⅡF2 siRNA2后，與陰性對(duì)照siRNA組相比，細(xì)胞遷移受到明顯的抑制；而未轉(zhuǎn)染、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞保持了原有的遷移能力，在一段時(shí)間后通過(guò)遷移將劃痕部分掩蓋，GTFⅡF2 siRNA2對(duì)ECA-109、TE-1的遷移活性較對(duì)照組分別降低了70%和55%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空載體和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG并未對(duì)細(xì)胞遷移產(chǎn)生明顯影響。Knockdown GTFⅡF2實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在食管癌細(xì)胞ECA-109和 TE-1中，細(xì)胞增殖以及遷移活性與GTFⅡF2在食管癌細(xì)胞中是否表達(dá)及表達(dá)量高低有關(guān)。

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The effect of general transcription factor GTFⅡF2 expression on the proliferation and migration of esophageal cancer cells

Chen Dandan，Geng Huiwu，Pan Linxin，et al
（Dept of Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the effect of general transcription factor GTFⅡF2 expression on the proliferation and migration of esophageal cancer cells.Methods Synthesized siRNA targeted to GTFⅡF2 gene or negative control siRNA and plasmid pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG were transfected to esophageal cancer cells respectively by using LipofectamineTM2000.Colony formation assay and wound-healing assay were performed to study the effect of knockdown and overexpression of GTFⅡF2 expression on the proliferation and migration of esophageal cancer cells respectively.Results Knockdown of GTFⅡF2 inhibited the proliferation and migration in TE-1，ECA-109 cells，but overexpression of GTFⅡF2 had no significant effect on cell proliferation and migration.Conclusion GTFⅡF2 gene plays an important role in the proliferation and migration of TE-1，ECA-109 cells.It is useful for further understanding of the mechanism that GTFⅡF2 inhibits the proliferation and migration of TE-1，ECA-109 cells.

GTFⅡF2；gene expression；RNA interference；cell proliferation；cell migration

R 735.1

A

1000-1492（2016）07-0984-06

2016-03-23接收

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（編號(hào)：81201368）

安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物教研室，合肥 230032

陳丹丹，女，碩士研究生；劉曉穎，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：liuxiaoying@ahmu.edu.cn范禮斌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lfan@ahmu.edu.cn