丹參酮Ⅰ對HepG2細胞胰島素抵抗作用及機制的研究

蔡雙朋，李 俊，黃 成，孟曉明，陳培杰

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丹參酮Ⅰ對HepG2細胞胰島素抵抗作用及機制的研究

蔡雙朋，李 俊，黃 成，孟曉明，陳培杰

目的 探討丹參酮Ⅰ對HepG2細胞胰島素抵抗的作用及分子機制。方法 高濃度胰島素誘導(dǎo)建立胰島素抵抗HepG2細胞模型；MTT法確定丹參酮Ⅰ的給藥濃度；葡萄糖氧化酶法檢測丹參酮Ⅰ對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響；Western blot法測定蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶1B （PTP1B）、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（P-AKT）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（AKT）蛋白表達情況。結(jié)果 以10-7mol/L胰島素誘導(dǎo)24 h成功建立了胰島素抵抗HepG2細胞模型；MTT篩選出了78、156、312 ng/ml丹參酮Ⅰ給藥濃度；丹參酮Ⅰ呈濃度依賴地增加胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量；Western blot法結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組PTP1B表達升高、P-AKT表達降低。與模型組比較，丹參酮Ⅰ給藥組PTP1B的表達濃度依賴性地降低、P-AKT的表達濃度依賴性地升高。結(jié)論 丹參酮Ⅰ能改善胰島素抵抗HepG2細胞，其機制可能是通過抑制PTP1B的表達，進而促進了P-AKT/AKT信號通路的活化。

2型糖尿病；蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶1B；丹參酮Ⅰ；胰島素抵抗；HepG2

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.024.html

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種代謝性疾病，占糖尿病總數(shù)的90%以上，是嚴重威脅人類健康的重要疾病之一，而且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1］。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是T2DM發(fā)病的重要因素和顯著特征，主要表現(xiàn)為外周靶器官或組織（主要是肝臟、肌肉和脂肪［2］）對胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低，從而導(dǎo)致胰島素難以產(chǎn)生正常的生理效應(yīng)［3］。肝臟是維持血糖穩(wěn)態(tài)的主要器官，當餐后血糖濃度升高時，肝臟會在胰島素的作用下通過合成糖原來降低血糖。相反，當血糖濃度降低時，肝糖原及糖異生作用加強，生成葡萄糖送入血中，維持血糖的穩(wěn)定。當肝臟發(fā)生IR，會導(dǎo)致肝臟的血糖調(diào)節(jié)功能紊亂，最終導(dǎo)致血糖升高［4］。蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞質(zhì)面的絡(luò)氨酸磷酸酶，可以使磷酸化的絡(luò)氨酸殘基去磷酸化，在肥胖以及IR等疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在肝臟發(fā)生IR時，PTP1B的表達升高，使得磷酸化的胰島素受體和胰島素受體底物-1去磷酸化，阻礙胰島素信號的向下傳導(dǎo)，降低細胞對葡萄糖的吸收利用［5］。丹參酮Ⅰ是從傳統(tǒng)中藥丹參其同屬植物中分離到的一種脂溶性單體化合物，在中醫(yī)中被廣泛用于治療心血管疾?。?］。研究［7］顯示丹參酮單體（如丹參酮ⅡA、隱丹參酮）能夠有效地增加IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量，改善IR，但是丹參酮Ⅰ改善HepG2細胞IR的作用和分子機制并不清楚。該實驗探究丹參酮Ⅰ改善HepG2細胞IR的作用和機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料與試劑 人肝癌細胞（HepG2）株（中國科學院上海細胞庫）；丹參酮Ⅰ（南京春秋生物工程有限公司）；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；青-鏈霉素溶液、MTT、DMSO（美國Sigma公司）；葡萄糖測定試劑盒（長春匯力生物技術(shù)有限公司）；兔抗PTP1B（北京博奧森公司）；兔抗 β-actin（美國Abcam公司）；兔抗絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）（美國CST公司）；兔抗磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（phosphorylatedprotein kinase B，P-AKT）（美國CST公司）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（武漢博士德生物）；化學發(fā)光（ECL）試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.1.2儀器 MK3型酶標儀（荷蘭雷勃公司）；NAPCO-6100型細胞培養(yǎng)箱（美國SHELLAB公司）；SW-CJ-IF型超凈工作臺（江蘇蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Sigam3-16K高速離心機（美國Sigma公司）；冷凍離心機TGL-18R（珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司）；Western blot設(shè)備（美國Biorad公司）。

1.2方法

1.2.1HepG2細胞培養(yǎng)和傳代 HepG2細胞使用含有10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 mg/ ml鏈霉素的高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長融合達到約80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代或按所需濃度接種培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板。

1.2.2胰島素抵抗模型的建立 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細胞貼壁，然后添加終濃度為10-7mol/ L的胰島素，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h建立IR模型。

1.2.3葡萄糖消耗量的檢測 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，以20 000個/孔接種于24孔板。實驗分為空白組、正常組、模型組、丹參酮Ⅰ給藥組（78、156、312 ng/ml），每組設(shè)4個復(fù)孔。空白組和正常組加入不含胰島素的培養(yǎng)基，模型組和丹參酮Ⅰ給藥組加入含10-7mol/L的胰島素的培養(yǎng)基。24h后吸去培養(yǎng)基并用PBS清洗2遍，空白組、正常組和模型組加入無酚紅無血清的培養(yǎng)基，丹參酮Ⅰ給藥組分別加入含質(zhì)量濃度為78、156、312 ng/ml丹參酮Ⅰ的無酚紅無血清的培養(yǎng)基。24 h后以葡萄糖氧化酶檢測試劑盒檢測各培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液上清的葡萄糖濃度，并以空白組的葡萄糖含量均值減去測得的培養(yǎng)液中葡萄糖含量計算得到各孔細胞的葡萄糖消耗量。

1.2.4Western blot檢測蛋白水平 收集處理后的細胞，經(jīng)PBS清洗，加入含1%PMSF的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min后轉(zhuǎn)移至1.5 ml的EP管中。4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液進行蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液；100℃加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，按蛋白分子量大小切膠轉(zhuǎn)膜，以5%的脫脂奶粉室溫封閉3 h，Tris-HCl-Tween（TBST）洗膜后在一抗中孵育4℃過夜，一抗稀釋液的濃度為：PTP1B（1∶300）、P-AKT（1∶500）、AKT（1∶500）、β-actin（1∶3 000）。孵育后的膜用TBST清洗后，用與一抗種屬相匹配的的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件掃描并分析蛋白質(zhì)表達相對含量。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示；One-Way ANOVA檢驗各組間差異的顯著性。

2　結(jié)果

2.1丹參酮Ⅰ對HepG2細胞活力的影響 以不同濃度的丹參酮處理HepG2細胞24 h，MTT結(jié)果顯示，當?shù)⑼竦臐舛鹊陀?25 ng/ml時，HepG2的細胞活力與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義（F= 2.333，P＞0.05），而當濃度為625 ng/ml時丹參酮Ⅰ則會抑制正常細胞的生長（t=5.666，P＜0.05），當濃度高于625 ng/ml時（1 250、2 500、5 000 ng/ ml）丹參酮Ⅰ則會明顯抑制正常細胞的生長（F= 385.5，P＜0.01），因此本實驗選定78、156、312 ng/ ml作為丹參酮Ⅰ后續(xù)實驗的給藥濃度。見圖1。

圖1　不同濃度的丹參酮Ⅰ對HepG2細胞增殖的影響

2.2丹參酮Ⅰ對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響 與正常組比較，經(jīng)過高濃度胰島素作用后，模型組細胞的葡萄糖消耗明顯降低，說明該模型組細胞產(chǎn)生了IR（t=29.81，P＜0.01）；與模型組比較，丹參酮Ⅰ（78、156、312 ng/ml）處理組可以劑量依賴地增加細胞的葡萄糖消耗（F=201.1，P＜0.01），改善了細胞的IR狀態(tài)。見圖2。

2.3丹參酮Ⅰ對IR-HepG2細胞中PTP1B表達的影響 與正常組比較，經(jīng)過高濃度胰島素作用后，模型組細胞中的PTP1B表達明顯升高（t=10.21，P＜0.01）；而經(jīng)不同濃度丹參酮Ⅰ（78、156、312 ng/ml）處理24 h后，PTP1B蛋白表達在明顯降低（F= 150.2，P＜0.01），且隨著給藥濃度的增加蛋白表達水平逐漸降低。見圖3。

圖2　不同濃度丹參酮Ⅰ對　IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

圖3　不同濃度丹參酮Ⅰ處理對HepG2細胞中PTP1B表達的影響

2.4丹參酮Ⅰ對IR-HepG2細胞中AKT通路的影響 與正常組比較，經(jīng)過高濃度胰島素作用后，模型組細胞中的P-AKT蛋白表達明顯降低（t=6.153，P ＜0.05）；而經(jīng)不同濃度丹參酮Ⅰ（78、156、312 ng/ ml）處理24 h后，P-AKT蛋白的表達在HepG2細胞中明顯升高（F=32.65，P＜0.01），且隨著給藥濃度的增加蛋白表達水平逐漸升高。見圖4。

圖4　不同濃度丹參酮Ⅰ處理對　HepG2細胞中　P-AKT表達的影響

3　討論

IR是T2DM發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，也是多種代謝相關(guān)疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。因此針對IR的治療是尋找優(yōu)良抗糖新藥的關(guān)鍵。近年來PTP1B在T2DM中的治療價值日益受到重視。發(fā)生IR時，PTP1B可以通過增加表達或提高活性使胰島素受體及受體底物去磷酸化，而對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起負性調(diào)節(jié)作用，最終導(dǎo)致IR［8］。因此，以PTP1B為抗糖藥物的作用靶點為臨床治療糖尿病提供新的方向。

本研究首先通過MTT確定了丹參酮Ⅰ的給藥濃度并成功建立了HepG2細胞的IR模型。隨后給予不同濃度的丹參酮Ⅰ治療24 h，顯示其各個濃度均能有效地增加IR-HepG2的葡萄糖消耗量，而且隨著給藥劑量的增加，葡萄糖消耗量逐漸增加。在確定丹參酮Ⅰ改善HepG2細胞IR的藥效后，課題組進一步檢測PTP1B蛋白水平的表達，結(jié)果顯示高濃度的胰島素誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生IR后，PTP1B較正常組明顯升高，在給予不同濃度的丹參酮Ⅰ治療24 h后，其各個濃度均能有效地降低IR-HepG2細胞的PTP1B蛋白表達，這說明丹參酮Ⅰ可能通過降低PTP1B的表達來改善HepG2細胞的 IR。為進一步明確其在改善HepG2細胞IR中的分子機制，課題組進一步檢測PTP1B下游所調(diào)節(jié)的P-AKT的表達，觀察丹參酮Ⅰ對IR-HepG2細胞 AKT磷酸化水平的影響，Western blot結(jié)果顯示丹參酮Ⅰ能夠有效增加 IR-HepG2細胞AKT磷酸化水平。綜上所述，丹參酮Ⅰ可以增加IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量，有效改善HepG2細胞的IR，并且推測其可能是通過降低PTP1B的表達，進而抑制AKT的磷酸化而發(fā)揮作用，但具體作用機制還有待于進一步研究。

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Effect and mechanism of tanshinoneⅠ in insulin resistance-HepG2 cells

Cai Shuangpeng，Li Jun，Huang Cheng，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University；Institute for Liver Diseases of Anhui Medical University；Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032）

Objective To explore effect and molecular mechanism of improved insulin resistance（IR）in HepG2 cells by tanshinoneⅠ.Methods IR-HepG2 was induced by high concentrations of insulin.The appropriate concentrations of tanshinoneⅠwere determined by MTT assay.The glucose consumption was detected by glucose assay kit.The expressions of protein tyrosine phosphatase 1B（PTP1B），P-AKT，AKT were determined by Western blot.Results The IR-HepG2 cells were established successfully by incubating with 10-7mol/L insulin for 24 hours.The ultimate concentrations of tanshinoneⅠ were determined as 78，156，312 ng/ml and tanshinoneⅠconcentration-dependently increased glucose consumption of IR-HepG2 cells.Western blot showed increased expression of PTP1B and decreased expression of P-AKT in model group compared with the normal group.Moreover，tanshinoneⅠconcentration-dependently decreased expression of PTP1B and increased expression of P-AKT compared with the model group.Conclusion TanshinoneⅠimproved IR in HepG2 cells.The putative mechanism is that tanshinoneⅠdecrease expression of PTP1B and promotes activation of P-AKT/AKT signaling pathway.

type 2 diabetes mellitus；protein tyrosine phosphatase 1B；tanshinoneⅠ；insulin resistance；HepG2

R 965；R 966

A

1000-1492（2016）07-0974-04

2016-03-23接收

國家自然科學基金（編號：81273526、81473268）；安徽省重點科技攻關(guān)項目（編號：1301042212）；安徽省自然科學基金（編號：1308085MH145）

安徽醫(yī)科大學藥學院、安徽醫(yī)科大學肝病研究所、安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性研究院，合肥 230032

蔡雙朋，男，碩士研究生；李 俊，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：lijun@ahmu.edu.cn11