重樓總苷Ⅰ對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19增殖、遷移的影響

蘇菲菲，盧木娣，曾惠紅，江文良，賴文娟，梁堂鈺，賴雪燕，龍劍文

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重樓總苷Ⅰ對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19增殖、遷移的影響

蘇菲菲1，盧木娣1，曾惠紅1，江文良1，賴文娟1，梁堂鈺1，賴雪燕1，龍劍文2

目的 探討重樓總苷Ⅰ對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系（ARPE-19）增生、遷移的影響。方法 MMT法檢測(cè)重樓總苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的影響，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞侵襲能力的變化，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞遷移能力的變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ERK1/2 mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 重樓總苷Ⅰ可抑制ARPE-19細(xì)胞的增生、侵襲、遷移，下調(diào)p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但對(duì)總ERK1/2表達(dá)、ERKl mRNA和ERK2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。結(jié)論 重樓總苷Ⅰ能有效抑制ARPE-19細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，可能與重樓總苷Ⅰ抑制了ARPE-19細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化有關(guān)，為中藥重樓治療增生性玻璃體視網(wǎng)膜疾病提供了依據(jù)。

重樓總苷Ⅰ；增殖；遷移；視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.016.html

人視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細(xì)胞增生、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)成分（extracellular matrix，ECM）異常沉積，形成有收縮能力的增生膜，是增生性玻璃體視網(wǎng)膜疾?。≒VR）發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［1］。研究［2］表明，RPE細(xì)胞在PVR的發(fā)展中起著最重要的作用。重樓是中醫(yī)治療PVR的常用藥物之一［3］，研究［4-6］表明，其有效成分重樓總苷Ⅰ對(duì)一些腫瘤細(xì)胞有抑制作用，但對(duì)人RPE細(xì)胞作用如何，目前暫無(wú)報(bào)道。該研究觀察了重樓總苷Ⅰ對(duì)人RPE細(xì)胞增生、遷移的影響，以及對(duì)其ERK1/2 mRNA表達(dá)、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響，探討重樓總苷Ⅰ治療PVR的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器 重樓皂苷Ⅰ粉劑購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系（ARPE-19）細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素、MTT試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；分光光度儀購(gòu)自芬蘭Labsystems公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱（熱電3111型）購(gòu)自美國(guó)熱電公司；TRIzol總RNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Quantonestep RTPCR Kit購(gòu)自北京天根生化公司；ERK1/2、p-ERK1/ 2、辣根酶標(biāo)記抗鼠lgG抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根酶標(biāo)記的β-actin抗體購(gòu)自上海興悠生物科技有限公司；ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosciences公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2MTT法檢測(cè)不同濃度藥物對(duì)ARPE-19細(xì)胞增生的影響 將ARPE-19細(xì)胞以5×104/孔接種于96孔板，每孔接種100 μl，培養(yǎng)液為含有10%小牛血清的DMEM，待細(xì)胞長(zhǎng)至 60%～70%融合狀態(tài)時(shí)，加入處理因素，每組重樓皂苷Ⅰ終濃度分別為0、0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml，每組均設(shè)6個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后加入20 μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入 DMSO振蕩，調(diào)零，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（optical density，OD）值，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）=1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞侵襲能力的影響 在上室膜表面均勻鋪培養(yǎng)基稀釋的Matrigel（1∶3），37℃培養(yǎng)箱中放置30 min，Matrigel凝固。再加入200 μl無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基，輕洗水化基底膜后備用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞常規(guī)消化后，加入終濃度為0、1.5、3.0、6.0 μg/ ml重樓皂苷Ⅰ，孵育1 h后，調(diào)整濃度為5×105個(gè)/ ml，取200 μl細(xì)胞懸液加入上室，另取200 μl含20%FBS的培養(yǎng)基放置于 Transwell下室內(nèi)，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，取出小室，先棄去培養(yǎng)基，棉簽擦去位于上室的細(xì)胞，PBS漂洗2次，每孔加入10%甲醇溶液固定，再棄甲醇溶液，加入結(jié)晶紫染色，棄染色液，蒸餾水洗滌、干燥，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氧對(duì)ARPE-19細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞培養(yǎng)，分組同1.3，取單層融合的ARPE-19細(xì)胞，用20 μl槍頭在細(xì)胞層上垂直劃線，PBS沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移情況，軟件分析并計(jì)算平均劃痕愈合率。

1.5測(cè)定ERK1/2 mRNA表達(dá)水平 ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)，分組同1.3。設(shè)計(jì)上、下游引物，ERK1上游引物：5-GAACTCCAAGGGCTATACCAAGT-3，下游引物：5-GGAGGGCAGAGACTGTAGGTAGT-3，產(chǎn)物164 bp；ERK2上游引物：5′-TCCCCATCACAAGAAGACCT-3′，下游引物：5′-AGTCAGCATTTGGGAACAGC-3′，產(chǎn)物 106 bp；GAPDH上游引物：5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物：5′-TGGAGGGATCTCGCTCCTGGAAGAT-3′，GAPDH擴(kuò)增長(zhǎng)度為214 bp。提取ARPE-19細(xì)胞總RNA；cDNA合成；取cDNA 1 μl，2.5×RealMasterMix/20×SYBR溶液11.25 μl，上下游引物各1 μl，加無(wú)Rnase水，總反應(yīng)體積25 μl；PCR反應(yīng)條件為：95℃變性2 min，循環(huán)95℃變性15 s，50℃退火30 s，68℃延伸50 s。結(jié)果采用ΔCt值法，ΔCt=樣品的Ct均值-內(nèi)參的Ct均值，2-ΔΔCt即某樣品初始cDNA的相對(duì)量。

1.6Western blot檢測(cè) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入不同濃度的重樓皂苷Ⅰ（終濃度依次為 0、1.5、3.0、6.0 μg/ml），每個(gè)濃度均設(shè)6孔。培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)后的 ARPE-19細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法蛋白定量，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，PBS洗膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜后加入一抗，4℃過(guò)夜；PBS洗膜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育0.5 h；洗膜；用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)。結(jié)果掃描后，用Quantity one圖像分析軟件光密度分析，以β-actin為內(nèi)參校正。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞的生長(zhǎng)活性的影響 培養(yǎng)24 h后，6.0 μg/ml組（t= 23.317，P=0.000）、3.0 μg/ml組（t=16.266，P= 0.000）、1.5 μg/ml組（t=8.012，P=0.000）與0.75 μg/ml組抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3.0 μg/ ml組（t=8.442，P=0.000）、1.5 μg/ml組（t= 15.224，P=0.000）與6.0 μg/ml組抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，其作用有濃度依賴性（F= 187.601，P=0.000）。見(jiàn)圖1。

圖1　MTT法檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)　ARPE-19細(xì)胞增殖的影響

2.2重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞侵襲能力的影響

培養(yǎng)48 h后，與空白對(duì)照組比較，6.0 μg/ml組（t =14.221，P=0.000）、3.0 μg/ml組（t=8.754，P= 0.000）、1.5 μg/ml組（t=5.176，P=0.000）侵襲細(xì)胞數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3.0 μg/ml組（t=7.537，P=0.000）、1.5 μg/ml組（t=11.507，P=0.000）與6.0 μg/ml組抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞的侵襲能力有抑制作用，其作用呈濃度依賴性（F=75.733，P= 0.000）。見(jiàn)圖2。

圖2　重樓皂苷Ⅰ對(duì)　ARPE-19細(xì)胞侵襲能力的影響×40

2.3重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞遷移能力的影響培養(yǎng)48 h后，與空白對(duì)照組比較，6.0 μg/ml組（t =28.853，P=0.000）、3.0 μg/ml組（t=18.804，P =0.000）、1.5 μg/ml組（t=10.860，P=0.000）劃痕愈合率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3.0 μg/ml組（t= 8.089，P=0.000）、1.5 μg/ml組（t=18.269，P= 0.000）與6.0 μg/ml組抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞的遷移能力有抑制作用，其作用呈濃度依賴性（F=281.005，P=0.000）。見(jiàn)圖3。

2.4重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞ERK1/2 mRNA表達(dá)的影響 重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞ERK1/2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。與空白對(duì)照組比較，6.0 μg/ml組（t=2.127，P=0.059）、3.0 μg/ml組（t= 2.041，P=0.069）、1.5 μg/ml組（t=2.095，P= 0.063）重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞ERK1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。與空白對(duì)照組比較，6.0 μg/ml組（t=1.236，P=0.245）、3.0 μg/ml組（t=0.246，P=0.811）、1.5 μg/ml組（t=0.320，P=0.755）重樓皂苷Ⅰ對(duì) ARPE-19細(xì)胞 ERK2 mRNA表達(dá)均無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖4。

圖3　重樓皂苷Ⅰ對(duì)　ARPE-19細(xì)胞遷移能力的影響×40

2.5重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響 重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞ERK1/2蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，但對(duì)p-ERK1/2蛋白表達(dá)有明顯抑制作用。與空白對(duì)照組比較，6.0 μg/ml組（t=20.549，P=0.000）、3.0 μg/ml組（t= 15.386，P=0.000）和1.5 μg/ml組（t=8.647，P= 0.000）重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)有明顯抑制作用。與空白對(duì)照組比較，6.0 μg/ ml組（t=2.170，P=0.055）、3.0 μg/ml組（t= 0.447，P=0.664）和1.5 μg/ml組（t=0.935，P= 0.372）重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞ERK1/2蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖5。

圖4　重樓皂苷Ⅰ對(duì)　ARPE-19細(xì)胞　ERK1/2 mRNA表達(dá)的影響

3　討論

PVR是多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的對(duì)眼內(nèi)損傷的過(guò)度修復(fù)反應(yīng)［7］。人RPE細(xì)胞的增生、遷移是PVR發(fā)病的早期組織病理學(xué)機(jī)制。RPE細(xì)胞在PVR的發(fā)展中起著決定性的作用。抑制RPE細(xì)胞遷移、增生是治療 PVR的方向之一。體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞（ARPE-19）有活體內(nèi)RPE細(xì)胞所特有的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，可用于各種體外實(shí)驗(yàn)［8］，因此本研究選擇ARPE-19細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

隨著重樓皂苷Ⅰ增高，對(duì)ARPE-19細(xì)胞IR逐漸提高，提示重樓皂苷Ⅰ有抑制ARPE-19細(xì)胞增殖的活性。此外，通過(guò)劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)分別檢測(cè)了重樓皂苷Ⅰ對(duì)RPE細(xì)胞橫向和縱向遷移的影響。因?yàn)镻VR的本質(zhì)是機(jī)體對(duì)損傷的過(guò)度修復(fù)。在PVR中，由于受到各種細(xì)胞因子的影響，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞除了水平方向運(yùn)動(dòng)外，縱向侵襲也是視網(wǎng)膜前、下增生膜形成的重要原因。結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅰ明顯抑制了ARPE-19細(xì)胞的侵襲和遷移。

圖5　重樓皂苷Ⅰ對(duì)　ARPE-19細(xì)胞　ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

目前就重樓皂苷Ⅰ抑制ARPE-19細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的機(jī)制還不清楚。重樓活性單體能通過(guò)抑制ERK的磷酸化抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖［9］。ERK也被稱為絲裂原激活的MAPK通路，研究［10］顯示，只有磷酸化的ERK才可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)c-Fos與c-Jun等轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，參與ERK通路下游的一系列的激活反應(yīng)。ERK主要參與細(xì)胞分化或增殖，促進(jìn)細(xì)胞生存［11］，ERK1/2 MAPK通路阻斷可抑制胃癌、乳腺癌等細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞侵襲，并且抑制miR-21及其靶基因表達(dá)［12-14］。本研究檢測(cè)了不同濃度重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞ERK1/2 mRNA表達(dá)以及對(duì)ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅰ對(duì)ARPE-19細(xì)胞ERK1/2 mRNA表達(dá)以及對(duì)ERK1/2蛋白表達(dá)并無(wú)明顯影響。重樓皂苷Ⅰ可能主要通過(guò)下調(diào)ERK1/2磷酸化的程度，從而抑制了ARPE-19細(xì)胞增殖，侵襲和遷移。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示重樓皂苷Ⅰ能夠抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19增殖、遷移，這可能與其抑制ERK1/2的磷酸化有關(guān)。這為中藥重樓治療PVR提供了一定的依據(jù)。

［1］Ryan S J.視網(wǎng)膜［M］.天津：天津科技翻譯出版公司，2011：2209-11.

［2］李 彬，闞紅衛(wèi)，張大傳，等.衰老對(duì)大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ROS生成和NADPH氧化酶表達(dá)的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（8）：936-9.

［3］朱翠萍.云南紅藥膠囊與銀杏葉片在治療眼底出血性疾病中的應(yīng)用［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2011，9（7）：28-9.

［4］Kong M，F(xiàn)an J，Dong A.Effects of polyphyllin I on growth inhibition of human non-small lung cancer cells and in xenograft［J］. Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2010，42（11）：827-33.

［5］Ma D D，Lu H X，Xu L S，et al.Polyphyllin D exerts potent antitumour effects on lewis cancer cells under hypoxic conditions［J］. J Int Med Res，2009，37（3）：631-40.

［6］程 卉，蘇婧婧，候會(huì)潔，等.重樓皂苷Ⅰ抗宮頸癌HeLa細(xì)胞作用及機(jī)制研究［J］.中藥材，2013，36（11）：1815-9.

［7］Khan M A，Brady C J，Kaiser R S.Clinical management of proliferative vitreoretinopathy：an update［J］.Retina，2015，35（2）：165-75.

［8］Dunn K C，Aotaki-Keen A E，Putkey F R，et al.ARPE-19，a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties［J］.Exp Eye Res，1996，62（2）：155-69.

［9］陳家勁，王娟娟，張 鵬，等.重樓活性單體抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版），2015，36（2）：124-30.

［10］Marshall C J.Specificity of receptor tyrosine kinase signaling：transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation［J］.Cell，1995，80（2）：179-85.

［11］Yokawa E，Takai S，Tanaka M，et al.Overexpression of ERK，an EPH family receptor protein tyrosine kinase，in various human tumors［J］.Cancer Res，1994，54（14）：3645-50.

［12］Lim S C，Duong H Q，Parajuli K R，et al.Pro-apoptotic role of the MEK/ERK pathway in urso-deoxycholic acid-induced apoptosis in SNU601 gastric cancer cells［J］.Oncol Rep，2012，28（4）：1429-34.

［13］Ling M，Li Y，Xu Y，et al.Regulation of miRNA-21 by reactive oxygen species-activated ERK/NF-κB in arsenite-induced cell transformation［J］.Free Radic Biol Med，2012，52（9）：1508-18.

［14］Huang T H，Wu F，Loeb G B，et al.Up-regulation of miR-21 by HER2/neu signaling promotes cell invasion［J］.J Biol Chem，2009，284（27）：18515-24.

Effects of PolyphyllinⅠ on proliferation and migration of human retinal epithelial cells line ARPE-19

Su Feifei，Lu Mudi，Zeng Huihong，et al
（Dept of Ophthalmology，Hezhou Renmin Hospital，Hezhou 542899）

Objective To study the effects of PolyphyllinⅠ on the proliferation and migration of human retinal pigment epithelial cell ARPE-19.Methods MTT assay was performed to investigate the effect of Polyphyllin I on the proliferation of ARPE-19 cells.Invasion ability of ARPE-19 cells was determined by a Matrigel invasion assay. Migration ability of ARPE-19 cells was determined by a wound healing assay.Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction was used to detect ERK1/2 mRNA expression.Western blot was used to detect the expression of ERK1/2，p-ERK1/2.Results PolyphyllinⅠinhibited proliferation of ARPE-19 cells in a dose dependent manner（P＜0.01）.PolyphyllinⅠtreatment reduced migration and invasion capacity of ARPE-19 cells （P＜0.01）.PolyphyllinⅠ treatment has no effect on the ERK1/2 mRNA and ERK1/2 protein expression in ARPE-19 cells，but p-ERK1/2 protein expression was markedly decreased by treatment with PolyphyllinⅠ（P＜0.01）.Conclusion PolyphyllinⅠcan effectively inhibit the ARPE-19 cells proliferation and migration，it may be related to inhibition of the phosphorylation of ERK1/2 in ARPE-19 cells.This study provides some evidences for the efficacy of paradis in the treatment of proliferative vitreoretinopathy.

PolyphyllinⅠ；proliferation；migration；retinal pigment epithelial cells

R 774.1

A

1000-1492（2016）07-0956-05

2015-04-13接收

湖北省衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研指導(dǎo)性項(xiàng)目（編號(hào)：2013Z-B05）

1賀州市人民醫(yī)院眼科，賀州 5428992湖北省中醫(yī)院、湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，武漢430061

蘇菲菲，女，碩士，責(zé)任作者，E-mail：984625812@qq.com