RTCA實(shí)時(shí)定量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HCMV在MRC-5細(xì)胞上的增殖的研究

張業(yè)婷，鐘 峰，姚 瑤，趙 俊，俞海洋，張文昌，陳敬賢，王明麗

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RTCA實(shí)時(shí)定量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HCMV在MRC-5細(xì)胞上的增殖的研究

張業(yè)婷，鐘 峰，姚 瑤，趙 俊，俞海洋，張文昌，陳敬賢，王明麗

目的 采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析（RTCA）系統(tǒng)監(jiān)測(cè)人巨細(xì)胞病毒（HCMV）在MRC-5細(xì)胞株上的復(fù)制增殖過(guò)程，評(píng)價(jià)此方法在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病毒增殖中的應(yīng)用價(jià)值。方法 應(yīng)用RTCA動(dòng)態(tài)觀察MRC-5細(xì)胞在不同階段的生長(zhǎng)指數(shù)（CI），選擇合適的細(xì)胞濃度進(jìn)行HCMV增殖的研究，同時(shí)采用傳統(tǒng)的空斑形成試驗(yàn)和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)作為該方法學(xué)的比較和結(jié)果驗(yàn)證。結(jié)果 選擇MRC-5最適細(xì)胞濃度為0.5× 105個(gè)/孔；與空斑試驗(yàn)及免疫熒光結(jié)果比較，半數(shù)細(xì)胞指數(shù)CI值對(duì)應(yīng)時(shí)間（CIT50）與病毒初始滴度有良好的線性關(guān)系；同時(shí)CI值與病毒滴度隨著時(shí)間的持續(xù)，顯示出明顯的負(fù)相關(guān)性（r=-0.977，P＜0.05）。結(jié)論 RTCA技術(shù)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，反應(yīng)細(xì)胞貼壁、伸展，同時(shí)能實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)HCMV增殖復(fù)制狀況，數(shù)據(jù)客觀可靠，為今后基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供了新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法。

實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)；人巨細(xì)胞病毒；增殖

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-6 13：52：31 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.008.html

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬于皰疹病毒β亞科，是皰疹病毒科中最大的一種病毒，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因組全長(zhǎng)超過(guò)240 000 bp，病毒顆粒的直徑約為200 nm。據(jù)報(bào)道，發(fā)達(dá)國(guó)家HCMV的成人平均感染率為40%～60%，而發(fā)展中國(guó)家高達(dá)到90%以上［1］。目前該病毒還被認(rèn)為與惡性腫瘤、糖尿病、心血管疾?。▌?dòng)脈粥樣硬化）有關(guān)［2］。HCMV通常呈潛伏感染，對(duì)免疫功能低下的個(gè)體，如艾滋病、器官移植、腫瘤及使用免疫抑制劑的患者體內(nèi)HCMV病毒會(huì)被再激活，造成巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎、食管炎、胃炎、結(jié)腸炎、肝炎等終末器官綜合征。HCMV又是先天性感染最常見(jiàn)的病原體之一，對(duì)孕婦和胎兒危害極大，可引起死胎、流產(chǎn)、胎兒畸形和發(fā)育遲緩等病理性損害。HCMV活動(dòng)性感染的孕婦可通過(guò)產(chǎn)道感染新生兒，導(dǎo)致新生兒小頭畸形、智力低下、黃疸、肝脾腫大、聽(tīng)力或視力喪失等多臟器、多系統(tǒng)不可逆性損害［3］。美國(guó)國(guó)家科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)研究所曾于1999年把研制預(yù)防先天性HCMV感染疫苗列為優(yōu)先級(jí)研究對(duì)象，但至今仍無(wú)疫苗獲準(zhǔn)上市［4］。HCMV在細(xì)胞上的增殖復(fù)制的研究，能夠?yàn)榭笻CMV病毒藥物的作用機(jī)制研究等方面提供一定的指導(dǎo)作用，目前仍缺少監(jiān)測(cè) HCMV增殖復(fù)制的可靠、新型、客觀、準(zhǔn)確和穩(wěn)定的方法。該研究運(yùn)用RTCA技術(shù)建立了實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HCMV病毒滴度的方法，建立了運(yùn)用該儀器動(dòng)態(tài)測(cè)算病毒滴度的方法，并與空斑形成實(shí)驗(yàn)和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)比得出了一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞、病毒株 細(xì)胞株為人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5），購(gòu)自ATCC。HCMV AD169株為實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)毒株，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供，安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室保存，實(shí)驗(yàn)用毒株的滴度為1.0×105PFU/ml。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基、小牛血清（美國(guó)Gibco公司）；HCMV pp65抗體（英國(guó)Abcam公司）；FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖（美國(guó)Promega公司）。

1.1.3儀器 RTCA iCelligence實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析儀（IXL8，美國(guó)ACEA公司）；CO2培養(yǎng)箱（HF90，上海力申科學(xué)儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（IX53，日本Olypus公司）；Countess自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（C10281，美國(guó)Invitrogen公司）。

1.2方法

1.2.1RTCA監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期 使用RTCA實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀監(jiān)測(cè)MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)周期。首先加入100 μl/孔含有10%小牛血清的營(yíng)養(yǎng)液于8孔電子板內(nèi)獲得背景讀數(shù)。隨后按照300 μl/孔加入MRC-5細(xì)胞懸液，細(xì)胞終濃度分別為1.0 ×105、0.5×105、0.25×105個(gè)/孔。每個(gè)稀釋度細(xì)胞平行設(shè)置復(fù)孔。室溫放置 30 min后放入RTCA分析儀內(nèi)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞的黏附伸展及繁殖狀態(tài)，將儀器設(shè)置30 min/次，監(jiān)測(cè)并記錄細(xì)胞指數(shù)值（cell index，CI），于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，連續(xù)觀察200 h。

1.2.2RTCA監(jiān)測(cè)HCMV感染MRC-5細(xì)胞的致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE） MRC-5細(xì)胞以5.0×104個(gè)/孔的濃度接種于8孔電子板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后棄去營(yíng)養(yǎng)液，再加入300 μl/孔10倍系列稀釋的HCMV AD169株病毒懸液以1.0×105、1.0 ×104、1.0×103、1.0×102PFU/孔到8孔電子板，感染MRC-5細(xì)胞，對(duì)照組加入300 μl維持液。37℃，5%CO2條件下孵育1.5 h后棄去病毒懸液，加入300 μl/孔含2%小牛血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)病毒稀釋度做復(fù)孔，加入病毒后將8孔電子板放回實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀內(nèi)，設(shè)置每隔30 min監(jiān)測(cè)并記錄CI值，共200 h。

1.2.3空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒懸液滴度 將MRC-5細(xì)胞以5.0×104個(gè)/孔的量加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)成單層時(shí)，病毒以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=0.1接種到MRC-5細(xì)胞上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄去病毒液，PBS洗3遍，加入含有2%FBS的培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于孵育后0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204 h收集培養(yǎng)液，用維持液將病毒懸液10倍系列稀釋后，再以0.2 ml/孔的量加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組，37℃孵育1.5 h，加入含有1%瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)液0.5 ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。其間逐日鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及其CPE，終止觀察后加入含10%甲醛的結(jié)晶紫染色液，染色5 min后流水沖去瓊脂凝塊。在倒置顯微鏡下觀察空斑并計(jì)數(shù)。病毒空斑形成單位（PFU/ml）=蝕斑均數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/病毒接種量。

1.2.4免疫熒光檢測(cè)HCMV在MRC-5細(xì)胞中復(fù)制

將MRC-5細(xì)胞以5.0×104個(gè)/孔的量加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)成單層時(shí)，病毒以MOI= 0.1接種到MRC-5細(xì)胞上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄去病毒液，PBS洗3遍，加入含有2% NBS的培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于孵育后 0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204 h收集培養(yǎng)液，用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)不同時(shí)間段病毒的滴度，具體操作步驟如下：①將細(xì)胞爬片取出后PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定30 min；②加1%Trixon至玻片上，蓋滿玻片為準(zhǔn)，37℃、5 min；③PBS洗滌3次，每次3 min，加入 5%小牛血清封閉液，37℃、1 h；④PBS洗滌3次，每次3 min，加入HCMV pp65單抗于玻片上，以蓋滿玻片為準(zhǔn)，37℃、2 h；⑤PBS洗滌3次，每次3 min，加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG，蓋滿玻片，37℃、1 h；⑥PBS洗滌3次，每次3 min，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察記錄結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，使用了重復(fù)測(cè)量資料方差分析、線性相關(guān)分析等方法處理，數(shù)值變量采用χ2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。

2　結(jié)果

2.1MRC-5細(xì)胞最適濃度的確定 本實(shí)驗(yàn)使用RTCA技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖CI值，并由此確定接種病毒的最佳時(shí)間點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，當(dāng)MRC-5細(xì)胞以0.5×105個(gè)/孔加入孔板內(nèi)時(shí)，細(xì)胞在生長(zhǎng)24 h后形成單層細(xì)胞層，無(wú)細(xì)胞聚集疊加現(xiàn)象，并且細(xì)胞平臺(tái)期時(shí)間滿足觀察HCMV感染細(xì)胞CPE時(shí)間，與倒置顯微鏡下觀察結(jié)果一致（圖1）。

圖1　RTCA監(jiān)測(cè)MRC-5細(xì)胞增殖曲線

2.2RTCA監(jiān)測(cè)HCMV致MRC-5細(xì)胞CPE效應(yīng) 在MRC-5細(xì)胞中，當(dāng) MOI=2（即 HCMV滴度為2.0×105PFU/ml），半數(shù)細(xì)胞指數(shù)值（half cell index time，CIT50）為77 h，而當(dāng)MOI=0.2（即 HCMV滴度為2.0×104PFU/ml），細(xì)胞CIT50為104 h，水平線與細(xì)胞指數(shù)曲線相應(yīng)交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的時(shí)間即為CIT50。當(dāng)病毒以MOI=0.1接種于MRC-5細(xì)胞24 h后，顯微鏡下觀察少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)變圓、腫脹現(xiàn)象，折光性增強(qiáng)，在接種達(dá)到96 h時(shí)，部分細(xì)胞出現(xiàn)脫落、凋亡現(xiàn)象。與鏡下觀察比較，RTCA細(xì)胞分析系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確得反映病毒致細(xì)胞CPE效應(yīng)。見(jiàn)圖2。HCMV感染MRC-5細(xì)胞后CPE效應(yīng)隨著時(shí)間增加而遞增，并且在不同HCMV感染劑量下，細(xì)胞CI值下降隨時(shí)間遞增（圖3）。

圖2　HCMV接種MRC-5細(xì)胞致CPE效應(yīng) ×100

圖3　RTCA監(jiān)測(cè)HCMV致MRC-5細(xì)胞CPE效應(yīng)

2.3空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCMV病毒滴度 結(jié)晶紫染色液染色后，空斑呈無(wú)色圓形，散在均勻分布，界限明顯（圖4）?？瞻咝纬蓪?shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，HCMV接種 MRC-5細(xì)胞后在40 h以內(nèi)病毒滴度處于平穩(wěn)期，這個(gè)時(shí)間包含了病毒的吸附期及隱蔽期，約在50 h時(shí)病毒滴度出現(xiàn)陡升，提示病毒在細(xì)胞內(nèi)數(shù)量急劇增加，動(dòng)力學(xué)曲線呈線性函數(shù)關(guān)系。此時(shí)，在顯微鏡下明顯看出CPE。到150 h時(shí)病毒增殖速度明顯下降，此時(shí)鏡下觀察細(xì)胞病變處于“”，部分細(xì)胞開(kāi)始脫落，此時(shí)病毒滴度較初始病毒滴度增加約2 000倍（圖5）。

圖4　空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCMV滴度

圖5　空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCMV在MRC-5細(xì)胞中復(fù)制（±s，n=3）

2.4間接免疫熒光驗(yàn)證HCMV在MRC-5細(xì)胞中復(fù)制 熒光顯微鏡下觀察，HCMV在細(xì)胞中隨著時(shí)間的增加，pp65蛋白大量復(fù)制表達(dá)，感染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不斷增多（圖6）。將不同方法檢測(cè)病毒滴度結(jié)果進(jìn)行重復(fù)測(cè)量資料方差分析（表1），間接免疫熒光法和空斑形成實(shí)驗(yàn)相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 0.745，P=0.437）。

2.5HCMV增殖滴度與CIT50及CI值相關(guān)分析 病毒在經(jīng)過(guò)10倍系列稀釋梯度下接種細(xì)胞后，細(xì)胞CIT50值隨病毒滴度遞減而呈遞增趨勢(shì)，分別以CIT50值為Y軸，HCMV滴度為X軸繪制曲線，獲得線性圖（圖7）。CIT50值與HCMV感染劑量的log PFU呈反比，R2值為0.957，提示兩者之間有良好的線性回歸關(guān)系，通過(guò)生成的公式Y(jié)=-26.800X+211.30，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的CIT50值可以直接計(jì)算出初始病毒的滴度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較表明，細(xì)胞指數(shù)與病毒滴度存在相關(guān)性，在病毒接種后36 h內(nèi)，細(xì)胞指數(shù)相對(duì)穩(wěn)定、貼壁狀況良好；而隨著感染時(shí)間的增加，病毒開(kāi)始大量復(fù)制，細(xì)胞CPE效應(yīng)增加，細(xì)胞指數(shù)也隨之急劇下降，通過(guò)散點(diǎn)圖顯示病毒滴度與細(xì)胞指數(shù)是非線性趨勢(shì)。因此對(duì)細(xì)胞指數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（圖8），轉(zhuǎn)換后的變量結(jié)果為L(zhǎng)n（代表細(xì)胞指數(shù)），通過(guò)散點(diǎn)圖可以發(fā)現(xiàn)病毒滴度和Ln基本呈線性趨勢(shì)，對(duì)兩個(gè)變量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果表明兩個(gè)變量都是正態(tài)分布。滿足線性相關(guān)條件。病毒滴度和Ln的相關(guān)系數(shù)，二者呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.977，P＜0.05）。以病毒滴度為因變量，Ln為自變量進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示自變量對(duì)變量的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6　HCMV在MRC-5中不同時(shí)間段熒光顯微鏡觀察結(jié)果 ×200

表1　兩種方法檢測(cè)HCMV病毒滴度結(jié)果比較（×103，±s）

表1　兩種方法檢測(cè)HCMV病毒滴度結(jié)果比較（×103，±s）

方法24 h　48 h　72 h　96 h免疫熒光（GFU/ml）3.16±0.13　3.97±0.32　9.86±0.21　25.2±1.0空斑形成（PFU/ml）3.08±0.16　4.04±0.29　9.74±0.19　23.2±3.3

圖7　MRC-5細(xì)胞感染HCMV的滴度與CIT50線性關(guān)系

圖8　病毒感染過(guò)程中病毒滴度與細(xì)胞指數(shù)的相關(guān)分析

3　討論

目前對(duì)于HCMV增殖復(fù)制與宿主間復(fù)雜的相互作用缺乏深入了解。研究病毒的最常用方法仍是空斑形成實(shí)驗(yàn)，但此法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不宜快速檢測(cè)，且無(wú)法獲取病毒復(fù)制及其引起的細(xì)胞病變的完整信息。各實(shí)驗(yàn)室條件和體系不同，數(shù)據(jù)無(wú)法參比，為基礎(chǔ)研究帶來(lái)了困難。另外，此外某些病毒如減毒突變株可能會(huì)在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成功，但由于其作用微弱，在單層細(xì)胞上產(chǎn)生的空斑難以識(shí)別，因此空斑試驗(yàn)無(wú)法研究此類病毒的CPE。

本研究采用RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HCMV在MRC-5細(xì)胞中的增殖狀況。在進(jìn)行MRC-5細(xì)胞測(cè)試HCMV的CPE檢測(cè)之前，先使用RTCA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖進(jìn)行定量分析，以確定病毒感染性實(shí)驗(yàn)的最佳細(xì)胞濃度。判斷依據(jù)為正常細(xì)胞增殖處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并且平臺(tái)期維持在6 d以上，確保感染病毒后細(xì)胞能被持續(xù)觀察。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)細(xì)胞濃度為5.0×104個(gè)/孔時(shí)，最適合病毒的接種，RTCA檢測(cè)細(xì)胞接種HCMV后的CI值與空斑形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，病毒的滴度與CI值呈明顯負(fù)相關(guān)性，提示通過(guò)RTCA檢測(cè)細(xì)胞CI值可實(shí)時(shí)反映病毒的滴度。

RTCA與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比有明顯優(yōu)勢(shì)，操作簡(jiǎn)單、步驟少、人為干擾?。煌暾?xì)胞效應(yīng)圖譜，提供大量、重要的動(dòng)態(tài)反應(yīng)信息；實(shí)驗(yàn)結(jié)果客觀、重復(fù)性好；降低了操作人員與病毒接觸的次數(shù)（實(shí)驗(yàn)全過(guò)程僅需一次），安全系數(shù)高，尤其對(duì)高致病性病原體；全自動(dòng)實(shí)時(shí)監(jiān)控，全過(guò)程動(dòng)態(tài)觀察；可以高通量的進(jìn)行特異性抗體的檢測(cè)及疫苗的保護(hù)性效果評(píng)價(jià)。RTCA的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，涉及新藥研發(fā)、毒理學(xué)、腫瘤學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及病毒學(xué)等。Lu et al［5］運(yùn)用RTCA技術(shù)評(píng)估了H1N1疫苗接種是否成功，Solly et al［6］運(yùn)用RTCA做一些以細(xì)胞為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)，為新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本文運(yùn)用RTCA細(xì)胞分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞實(shí)時(shí)全程動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，在臨床疾病指導(dǎo)治療等方面的應(yīng)用也具有很高的價(jià)值，為今后抗病毒藥物的研制及疫苗的研發(fā)提供可靠有力的實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)。

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Monitoring of HCMV replication with real-time cell assay on MRC-5

Zhang Yeting，Zhong Feng，Yao Yao，et al
（Dept of Microbiololgy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To detect the human cytomegalovirus（HCMV）replication in MRC-5 cells by applying realtime cell assay（RTCA）system，and evaluate the applicable value of this method in the dynamic monitoring of viral replication.Methods RTCA was applicated to monitor cell index（CI）in different growth stages.The optimal concentration of cell was selected to study HCMV replication.Additionally，traditional plaque formation assay and immunofluorescence assay were used to compare and validate the result of RTCA system.Results The most suitable cell concentration was 0.5×105cells per plate.Compared with the plaque formation assay and immunofluorescence assay，the value of half cell index（CIT50）had a satisfactory linear correlation with the initial virus titer.The RTCA system showed a significant negative correlation with time continuation for the detection of cell index and the virus titer（r=-0.977，P＜0.05）.Conclusion RTCA technique is successfully established to monitor the growth status of the cells in real time，which might reflect the cell's adhesion and spreading.The RTCA system could timely monitor HCMV titer with cell index.All the data are solid and reliable.The method would be helpful for future basic experiments on creating new experimental techniques and methods.

real-time cell assay；human cytomegalovirus；proliferation

R 373.9

A

1000-1492（2016）07-0935-05

2016-02-22接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30872253）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2012ZD08）

安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥 230032

張業(yè)婷，女，碩士研究生；王明麗，女，教授，碩士導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：1952987441 @qq.com