重組TACI-Ig融合蛋白抑制抗CD3抗體誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖與活化

楊思民，汪慶童，劉亢亢，汪龍生，吳　莉，魏　偉

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◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

重組TACI-Ig融合蛋白抑制抗CD3抗體誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖與活化

楊思民，汪慶童，劉亢亢，汪龍生，吳莉，魏偉

目的 探討抗CD3抗體誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖與活化的機(jī)制并觀察重組人TACI-Ig融合蛋白（rhTACI-Ig）對(duì)其的影響。方法 免疫磁珠純化得到小鼠T淋巴細(xì)胞，用抗CD3抗體刺激，同時(shí)給予rhTACI-Ig、rhTNFR∶Fc或IgG-Fc。［3H］-TdR參入法檢測(cè)T細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群比率，Western blot法檢測(cè)B淋巴細(xì)胞刺激因子、BAFF受體（BAFFR）和跨膜激活劑及鈣調(diào)親環(huán)素配體相互作用分子（TACI）兩個(gè)受體及IL-2受體（IL-2R）表達(dá)水平和NF-κB活性，采用小干擾RNA（siRNA）抑制T細(xì)胞BAFFR 或TACI的表達(dá)。結(jié)果 抗CD3抗體體外可促進(jìn)T細(xì)胞增殖與活化，BAFF、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）分泌，BAFFR、TACI、IL-2R表達(dá)升高和NF-κB活性增強(qiáng)（P＜0.05）。RhTACI-Ig（0.1、1、10、100 μg/ml）體外給藥可抑制抗CD3抗體誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖（P＜0.05）；rhTACI-Ig（1、10、100 μg/ml）可明顯降低抗 CD3抗體誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平（P＜0.05，P＜0.01），顯著抑制CD4+CD69+T細(xì)胞、CD4+CD154+T細(xì)胞比率，提高CD4+CD62L+T細(xì)胞比率（P＜0.05，P＜0.01），且 rhTACI-Ig （10、100 μg/ml）能降低 T細(xì)胞上BAFFR、TACI、IL-2受體的表達(dá)，抑制NF-κB活性（P＜0.05）。沉默BAFFR或TACI對(duì)抗CD3抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖有抑制作用（P＜0.01）。結(jié)論 抗CD3抗體部分通過(guò)產(chǎn)生BAFF，激活BAFFR信號(hào)而促進(jìn)T細(xì)胞增殖與活化，rhTACI-Ig中和BAFF，抑制BAFF相關(guān)受體的表達(dá)和NF-κB活性，減少T細(xì)胞表達(dá)IL-2受體，阻止T細(xì)胞過(guò)度增殖與活化。

B淋巴細(xì)胞刺激因子；重組TACI-Ig融合蛋白；T淋巴細(xì)胞；免疫治療；自身免疫病

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-6 13：52：31 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.002.html

抗CD3抗體可以上調(diào)T淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素2受體（interleukine-2 receptor，IL-2R）表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與活化［1］?；罨腡細(xì)胞能分泌IL-1、IL-2、IL-6、IL-10和B淋巴細(xì)胞刺激因子（B lymphocyte stimulator，BlyS or BAFF）等多種細(xì)胞因子［2］。BAFF及APRIL水平的異常與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等自身免疫病的發(fā)病密切相關(guān)［3］。BAFF與APRIL有兩個(gè)共同受體，即跨膜激活劑及鈣調(diào)親環(huán)素配體相互作用分子（transmembrane activator or calcium-modulating cyclophylin ligand-interactor，TACI）和 BAFF受體 （receptor for B-cell activating factor，BAFFR）。重組TACI-Ig融合蛋白（rhTACI-Ig）是TACI的胞外部分和人IgG1的Fc段鏈接而成，能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合BAFF和APRIL。該實(shí)驗(yàn)觀察rhTACI-Ig對(duì)抗CD3抗體活化的T淋巴細(xì)胞及其相關(guān)受體和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，并從BAFFR和TACI及其下游信號(hào)分子通路的角度，進(jìn)一步探討B(tài)AFF影響T細(xì)胞的機(jī)制，為rhTACI-Ig控制T細(xì)胞增殖與活化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，7～8周齡，（20±2）g，購(gòu)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。實(shí)驗(yàn)中涉及的小鼠實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2藥物和試劑 小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；全T細(xì)胞分選試劑盒購(gòu)于德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所；T細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-2、IL-4、干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司；兔抗CD3多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；rhTNFR：Fc購(gòu)于上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司；重組TACI-Ig融合蛋白（批號(hào)：20120607）和陰性對(duì)照IgG-Fc（批號(hào)：20120603）由煙臺(tái)榮昌生物制藥有限公司提供；流式抗體CD69/PE、CD154/ PE、CD62L/PE、CD4/FITC購(gòu)于美國(guó)Biolgend公司；抗BAFFR、TACI、IL-2R一抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；抗NF-κB p100/p52和抗磷酸化NF-κB p100/ p52（S865）一抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的分離 處死小鼠，無(wú)菌剝離脾臟，常規(guī)制備小鼠脾臟細(xì)胞懸液后用小鼠淋巴細(xì)胞分離液純化，分離得脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至每40μl含107個(gè)細(xì)胞。每107個(gè)細(xì)胞加入10 μl非T細(xì)胞的生物素化抗體混合物，輕輕震蕩混合經(jīng)4℃孵育后再按照每107個(gè)細(xì)胞加入20 μl抗生物素微珠的比例，輕輕震蕩混合經(jīng)4℃孵育后，將細(xì)胞懸液在沖洗的PBS流凈前加入處于磁場(chǎng)中的分離柱，收集流出液，再用500 μl PBS沖洗3遍后得到未被磁性標(biāo)記的T淋巴細(xì)胞。將得到的T淋巴細(xì)胞重新計(jì)數(shù)鋪板培養(yǎng)。

1.3.2分組和給藥 將收集到的T淋巴細(xì)胞分為正常組、刺激組、rhTACI-Ig濃度組（0.01、0.1、1、10、100 μg/ml）、IgG-Fc（10 μg/ml）陰性對(duì)照組和重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（tumour necrosis factor Fc fusion protein，rhTNFR：Fc）（10 μg/ml）陽(yáng)性對(duì)照組。除正常組外，其余各組均用anti-CD3（10 μg/ml）刺激。T淋巴細(xì)胞給藥培養(yǎng)72 h后分別用于細(xì)胞增殖檢測(cè)、細(xì)胞因子水平測(cè)定、細(xì)胞亞群檢測(cè)以及受體和信號(hào)分子表達(dá)水平測(cè)定。

1.3.3T淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè) 在96孔培養(yǎng)板上，每孔加入100 μl純化T淋巴細(xì)胞懸液（終濃度為1 ×107/ml）及anti-CD3（終濃度為10 μg/ml），同時(shí)每個(gè)孔加入不同濃度的rhTACI-Ig（終濃度為0.01、0.1、1、10、100 μg/ml）、rhTNFR：Fc（終濃度為10 μg/ml）或IgG-Fc（終濃度為10 μg/ml），每孔的終容積為200 μl，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在收集細(xì)胞前12 h時(shí)每孔加入25μl3H-TdR（105Bq/ml）后培養(yǎng)結(jié)束，用多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上，用液閃儀測(cè)其放射性。

1.3.4T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、TGF-β水平檢測(cè) 在24孔培養(yǎng)板上，每孔加入500 μl純化T淋巴細(xì)胞懸液（1×107/ml）和anti-CD3（終濃度為10 μg/ml），同時(shí)每個(gè)孔加入不同濃度的rhTACI-Ig、rhTNFR：Fc或IgG-Fc，每孔的終容積為1 ml。培養(yǎng)72 h后離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，采用ELISA法檢測(cè)IL-2、IFN-γ、IL-4、TGF-β水平。

1.3.5T淋巴細(xì)胞亞群比例檢測(cè) 在50 ml培養(yǎng)瓶中，每瓶分別加入2×107個(gè)經(jīng)純化T淋巴細(xì)胞懸液和抗CD3（終濃度為10 μg/ml），加入后最終的容積為2 ml，加入不同濃度的rhTACI-Ig、rhTNFR：Fc或IgG-Fc，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，每管300 μl細(xì)胞懸液（1×106/ml），分別加入5 μl適當(dāng)稀釋的CD154-PE/CD4-FITC一抗、CD69-PE/CD4-FITC一抗、CD62L-PE/CD4-FITC一抗，4℃避光孵育30 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.6T淋巴細(xì)胞BAFFR、TACI、IL-2R、磷酸化和總NF-κB p100/p52檢測(cè) 將6孔板內(nèi)給藥處理后的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2 ml EP管中，離心（3 000 r/ min，5 min），棄去培養(yǎng)液。每管加入50 μl蛋白裂解液（PMSF 1∶100），充分混勻，冰上靜置裂解30 min后，在-80℃和4℃冰箱間反復(fù)凍融3次，離心（14 000 r/min，15 min），小心吸取上清液即得總蛋白，用Western blot法檢測(cè)BAFFR、TACI、IL-2R、磷酸化和總NF-κB p100/p52的表達(dá)。將提取的蛋白定量后加入上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用封閉液封閉2 h，洗脫緩沖液洗3次，4℃冰箱孵育一抗過(guò)夜。次日，室溫下復(fù)溫10 min，洗脫緩沖液洗3次，37℃搖床孵育對(duì)應(yīng)的二抗2 h，洗脫緩沖液洗3次，ECL試劑盒顯色。用凝膠成像系統(tǒng)掃描結(jié)果，以特異性條帶的灰度值來(lái)反映蛋白表達(dá)水平。

1.3.7siRNA轉(zhuǎn)染 將分離的T淋巴細(xì)胞按3×106/孔接種在12孔培養(yǎng)板中，1 000 r/min，離心10 min，棄上清液。每管加入100 μl Nucleofector Solution、100 nmol/L siRNA，使用細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)后，立即補(bǔ)充培養(yǎng)液至1.5 ml，培養(yǎng)24 h后加BAFF繼續(xù)作用24 h。TACI siRNA序列為5′-CAGCGGAGTGGAGAAGTTGAA-3′；BAFFR siRNA序列為5′-TGTGGAAAGGACGAAACACC-3′。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以表示，兩組均數(shù)間差異比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間差異的比較采用One Way Anova檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1抗CD3抗體誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞BAFF分泌和增殖及hTACI-Ig的作用 抗CD3抗體不同濃度梯度和作用時(shí)間實(shí)驗(yàn)顯示，10 μg/ml抗體刺激T淋巴細(xì)胞72 h為體外刺激的亞適濃度和最適時(shí)間?？笴D3抗體（10 μg/ml）刺激72 h，T淋巴細(xì)胞分泌大量BAFF且增殖功能明顯亢進(jìn)（F=2.869，P= 0.000 4）。rhTACI-Ig（0.1、1、10、100 μg/ml）和rhTNFR∶Fc（10 μg/ml）可明顯抑制異常活化的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（F=51.75，P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

2.2抗CD3抗體刺激對(duì)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平的影響以及rhTACI-Ig對(duì)其的影響抗CD3抗體刺激可使T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ和TGF-β水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），IL-4濃度升高但無(wú)顯著性。rhTACI-Ig（1、10、100 μg/ml）可明顯降低IL-2（F=5.571，P＜0.01）和IFN-γ（F=3.876，P＜0.01）水平；降低IL-4 （F=7.105，P＜0.05）和TGF-β（F=1.663，P＜0.05）水平。RhTNFR：Fc可以顯著降低抗CD3抗體刺激后升高的 IL-2、IL-4水平（P＜0.05），但對(duì)IFN-γ和TGF-β無(wú)明顯作用；IgG-Fc組對(duì)上述經(jīng)抗CD3刺激后升高的細(xì)胞因子水平均無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖2。

圖1　rhTACI-Ig體外對(duì)抗CD3抗體誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

2.3rhTACI-Ig對(duì)抗CD3抗體刺激的T淋巴細(xì)胞亞群比率的影響 抗CD3抗體體外刺激T淋巴細(xì)胞，可使CD4+CD69+和CD4+CD154+細(xì)胞比率顯著升高（P＜0.01），同時(shí)顯著降低CD4+CD62L+細(xì)胞比率（P＜0.01）。rhTACI-Ig（1、10、100 μg/ml）可顯著抑制被升高的CD4+CD69+細(xì)胞比率（F= 14.19，P＜0.05，P＜0.01）；rhTACI-Ig（0.1、1、10、100 μg/ml）可明顯降低CD4+CD154+細(xì)胞比率（F=19.31，P＜0.05，P＜0.01）；rhTACI-Ig（10、100 μg/ml）可顯著升高CD4+CD62L+細(xì)胞比率（F= 12.69，P＜0.05）；rhTNFR∶Fc可以明顯升高CD4+CD62L+細(xì)胞比率（P＜0.05），但對(duì)CD4+CD69+和CD4+CD154+無(wú)影響；IgG-Fc組對(duì)上述細(xì)胞亞群比率均無(wú)影響（圖3）。

圖2　抗CD3抗體刺激對(duì)于T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平的影響以及RhTACI-Ig對(duì)其的影響

2.4RhTACI-Ig對(duì)T淋巴細(xì)胞BAFFR、TACI、IL-2R表達(dá)和NF-κB p100/p52蛋白表達(dá)情況活性的影響 純化培養(yǎng)T細(xì)胞，抗CD3抗體體外刺激可顯著升高T淋巴細(xì)胞TACI、BAFFR、IL-2R的表達(dá)；rhTACI-Ig（1、10 μg/ml）體外給藥對(duì)異常升高的TACI（F=562.3，P＜0.01）、BAFFR（F=1032，P＜0.01）、IL-2R（F=9.126，P＜0.05）水平有抑制作用，提示rhTACI-Ig抑制BAFF受體信號(hào)通路，并阻止T細(xì)胞活化。抗CD3抗體可促進(jìn)T細(xì)胞NF-κB p100/p52 865位點(diǎn)絲氨酸磷酸化活化，不改變總NF-κB p100/p52水平；rhTACI-Ig（1、10 μg/ml）阻止了抗CD3抗體誘導(dǎo)的NF-κB p100/p52磷酸化（F= 20.60，P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4　RhTACI-Ig對(duì)T淋巴細(xì)胞BAFFR、TACI、IL-2R表達(dá)和NF-κB活性的影響

2.5T淋巴細(xì)胞BAFFR或TACI受體對(duì)抗CD3抗體誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的影響 用電轉(zhuǎn)法將BAFFR或 TACI siRNA分別轉(zhuǎn)染入分離純化的小鼠T淋巴細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48 h后用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，篩選最佳siRNA序列。實(shí)驗(yàn)表明BAFFR siRNA的最高沉默率為58.3%（F=64.05），TACI siRNA的最高沉默率為 63.4%（F=41.35）（圖 5）。沉默BAFFR后，抗CD3抗體雖然仍能刺激T細(xì)胞輕度增殖，但增殖程度顯著低于對(duì)照組（F=51.49，P＜0.01）；沉默TACI也對(duì)抗CD3抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖有抑制作用（F=57.63，P＜0.001）（圖6），提示抗CD3抗體體外促進(jìn)T細(xì)胞增殖和活化的作用部分通過(guò)分泌BAFF，激活BAFFR和TACI受體及下游信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。

圖5　沉默BAFFR或TACI對(duì)抗CD3抗體受體表達(dá)水平的影響

圖6　沉默BAFFR或TACI對(duì)抗CD3抗體誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖的影響

3　討論

免疫調(diào)節(jié)的異常在自身免疫病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，涉及到多種免疫性細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞的異常增殖與活化在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展及病理?yè)p傷起著重要的作用［4］。CD3分子作為分布于所有T淋巴細(xì)胞膜上的重要分化抗原，是T淋巴細(xì)胞共有的分子表面標(biāo)志物。當(dāng)CD3與T淋巴細(xì)胞上的T淋巴細(xì)胞受體（TCR）特異性識(shí)別結(jié)合后，CD3通過(guò)TCR-CD3復(fù)合體將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到T淋巴細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，在誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖以及各種細(xì)胞因子的分泌［5］。因此，抗 CD3抗體能夠模擬抗原與TCR結(jié)合，向T淋巴細(xì)胞傳遞有效的信號(hào)模擬CD3與TCR結(jié)合后產(chǎn)生的效應(yīng)。靜息T細(xì)胞不表達(dá)IL-2R，一旦被活化，T細(xì)胞分泌大量IL-2并迅速表達(dá)IL-2R［6］。本實(shí)驗(yàn)顯示，抗CD3抗體促進(jìn)T淋巴細(xì)胞高表達(dá)IL-2R，活化NF-κB p100/p52，產(chǎn)生大量BAFF，進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞的增殖活化。抑制BAFF受體BAFFR或TACI表達(dá)可減弱抗CD3抗體對(duì)T細(xì)胞的刺激作用，提示BAFF通路是除TCR信號(hào)外，抗CD3抗體活化T細(xì)胞的重要通路之一。

目前，在B淋巴細(xì)胞中作為BAFF的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑rhTACI-Ig對(duì)其作用以及相關(guān)的作用機(jī)制的研究［7］已較深入，但在T淋巴細(xì)胞中rhTACI-Ig的影響及相關(guān)作用機(jī)制尚未清楚。然而在RA、SLE等自身免疫病中，CD4+T淋巴細(xì)胞對(duì)于炎癥免疫反應(yīng)的誘發(fā)和持續(xù)起重要作用。CD4+T細(xì)胞被自身抗原或細(xì)胞因子刺激活化后，分化為不同的功能亞群，如Th1、Th2細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。這些CD4+T細(xì)胞通過(guò)與其他免疫細(xì)胞的相互作用，形成復(fù)雜的功能網(wǎng)絡(luò)，釋放Th1（IL-2、IFN-γ）、Th2（IL-4）、Treg（TGF-β）型細(xì)胞因子［8］。本實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)抗CD3抗體刺激的T淋巴細(xì)胞上清中上述細(xì)胞因子均出現(xiàn)了不同程度的升高，而在rhTACI-Ig體外用藥時(shí)發(fā)現(xiàn)其能不同程度地降低其水平。

CD62L表達(dá)于初始T淋巴細(xì)胞，在相關(guān)特異性細(xì)胞因子或趨化因子激活淋巴細(xì)胞后，可使其細(xì)胞表面CD62L表達(dá)迅速下調(diào)［9］。CD69在T淋巴細(xì)胞活化后很短時(shí)間即可表達(dá)并迅速達(dá)到高峰，也是最早表達(dá)的分子表面標(biāo)志，其作為細(xì)胞共刺激信號(hào)可進(jìn)一步增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的活化或增殖分化［10］。CD154（CD40L）與B淋巴細(xì)胞表面的CD40結(jié)合，CD154與CD40這對(duì)共刺激分子在B淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生關(guān)鍵的作用，可以活化B淋巴細(xì)胞、刺激抗體產(chǎn)生以及免疫球蛋白類(lèi)型轉(zhuǎn)換等，同時(shí)，對(duì)于T淋巴細(xì)胞活化與增殖及調(diào)節(jié)其所分泌的細(xì)胞因子等過(guò)程中也起重要的作用。未活化Th細(xì)胞（CD4+CD62L+）、表達(dá)活化誘導(dǎo)分子 Th細(xì)胞（CD4+/CD69+）和表達(dá)CD40L的Th細(xì)胞（CD4+/CD154+）比例及其所分泌的細(xì)胞因子在RA、SLE等自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，其比例變化可反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)及藥物的作用療效［11］。RhTACIIg可調(diào)節(jié)T細(xì)胞表面活化標(biāo)志分子的表達(dá)。

TACI和BAFFR與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）偶聯(lián)，活化核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p52，降解促凋亡蛋白 Bim，介導(dǎo)細(xì)胞活化［12］。RhTACI-Ig作為一種誘騙受體，可作為競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑結(jié)合BAFF和APRIL，阻止它們與其表達(dá)在細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，從而阻斷其下游信號(hào)通路，減少炎性免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生［13］。在一些自身免疫病的報(bào)道中，使用rhTACI-Ig后病情可以得到一定的緩解，體內(nèi)的血清中免疫球蛋白和自身抗體水平快速降低，并且能使病人體內(nèi)表達(dá)水平升高的BAFF/APRIL同源三聚體及異源三聚體降低［14-15］。本研究顯示，rhTACIIg可以通過(guò)中和抗CD3抗體刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的BAFF，抑制BAFF受體信號(hào)和NF-κB活性，減少T細(xì)胞表達(dá)IL-2R，阻止T細(xì)胞增殖，顯著抑制Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生，明顯降低活化Th細(xì)胞（CD4+/ CD69+和CD4+/CD154+）比例，升高未活化T細(xì)胞（CD4+CD62L+）比例。綜上，rhTACI-Ig對(duì)治療T細(xì)胞反應(yīng)依賴(lài)的自身免疫病有良好前景。

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Inhibitory effect of rhTACI-Ig on anti-CD3 antibody induced T lymphocytes proliferation and activation

Yang Simin，Wang Qingtong，Liu Kangkang，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine of Education Ministry of China，Collaborative Innovation Center of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Hefei 230032）

Objective To investigate the molecular mechanism of anti-CD3 antibody induced T lymphocytes proliferation and activation and observe the effect of recombination human TACI-Ig（rhTACI-Ig）.Methods T lymphocytes were purified from the spleens of mice by immunomagnetic beads and treated with anti-CD3 antibody with or without different concentrations of rhTACI-Ig，recombinant human tumor necrosis factor-α receptor II：IgG Fc（rhTNFR：Fc）or IgGFc.The proliferation of T lymphocytes was determined by［3H］-TdR incorporation，the percentages of T lymphocytes subsets were tested by flow cytometry.Western blot was applied to evaluate the expression of B cell activating factor receptor（BAFFR），transmembraneactivator or calcium-modulating cyclophylin ligand-interactor（TACI），IL-2 receptor（IL-2R）and the phosphorylation of NF-κB.Small interfering RNAs were used to block BAFFR or TACI expression.Results Anti-CD3 obviously induced the activation of T lymphocytes，upregulated BAFF，interleukin-2（IL-2），interferon-γ（IFN-γ）and transforming growth factor-β（TGF-β）secretion，promoted BAFFR，TACI and IL-2R expression，activated NF-κB（P＜0.05）.The administration of rhTACI-Ig（0.1，1，10，100 μg/ml）inhibited the proliferation of T lymphocytes induced by anti-CD3 antibody（P＜0.05）.RhTACIIg（1，10，100 μg/ml）significantly decreased the production of cytokines（P＜0.05，P＜0.01），markedly downregulated the percentage of CD4+CD69+and CD4+CD154+T lymphocytes，elevated the proportion of CD4+CD62L+T lymphocytes（P＜0.05，P＜0.01）.Meanwhile，rhTACI-Ig（10，100 μg/ml）treatment decreased the level of BAFFR，TACI，IL-2 on T lymphocytes，as well as attenuated the activation of NF-κB（P＜0.05）.Depletion of BAFFR or TACI markedly blocked anti-CD3 antibody dependent T cell proliferation（P＜0.05，P＜0.01）. Conclusion Anti-CD3 antibody promotes T lymphocytes activation partially through BAFF production and BAFF receptors signaling.RhTACI-Ig neutralizes BAFF，inhibits BAFF signaling and therefore attenuates T lymphocytes activation.

B-cell activating factor；recombination human TACI-Ig；T lymphocytes；immunological therapy；autoimmune diseases

R 593.22；R 392.3；R 392.5；R 967；R 979.5

A

1000-1492（2016）07-0919-07

2016-04-06接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81173075、81330081、81202541）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1208085QH146）；安徽醫(yī)科大學(xué)青年拔尖人才支持計(jì)劃（2013）；第三批安徽醫(yī)科大學(xué)校級(jí)中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人基金

安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、安徽抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230032

楊思民，男，碩士研究生；魏 偉，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wwei@ ahmu.edu.cn；汪慶童，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hfwqt727@163.com