微生物誘導下甲烷厭氧氧化及碳酸鹽礦物生成實驗

劉肖，許天福，魏銘聰，溫玉娟，金光榮，曹玉清

（吉林大學 地下水資源與環(huán)境教育部重點實驗室，吉林 長春，130021）

微生物誘導下甲烷厭氧氧化及碳酸鹽礦物生成實驗

劉肖，許天福，魏銘聰，溫玉娟，金光榮，曹玉清

（吉林大學 地下水資源與環(huán)境教育部重點實驗室，吉林 長春，130021）

從淤泥樣品中，培育甲烷氧化菌并對其進行 DNA測序；進而在自行研制的反應系統(tǒng)中開展甲烷氧化菌-水-巖石相互作用實驗，檢測微生物的數(shù)量和 HCO3-質量濃度的變化，最后對巖石樣品進行掃描電鏡分析。研究結果表明：所培養(yǎng)的淡水甲烷氧化菌為假單胞菌屬；微生物注入反應器后有HCO3-的生成，HCO3-質量濃度變化與微生物數(shù)量和活性有關；石英砂表面生成無定形鐵白云石、亮白色菱柱狀碳酸鹽和長石類礦物的中間產物。

甲烷氧化菌；甲烷厭氧氧化；碳酸鹽礦物

甲烷是一種重要的溫室氣體，從生態(tài)學的角度分析，自然界中廣泛存在產甲烷菌，有機物被不斷地降解釋放甲烷［1］，甲烷在大氣中的停留時間大約為 7.9 a［2-3］，對全球氣候變暖的影響是二氧化碳的25倍［1-3］。而厭氧的海洋沉積物作為地球上最大的甲烷儲層，其中的甲烷或溶解在沉積物孔隙水中并向海底滲漏，或在適合的溫度壓力和地質條件下形成天然氣水合物［4］，海洋沉積物的甲烷生成率為（85～300）×1012g/a［5-7］，若甲烷釋放到大氣中，則將嚴重加劇溫室效應。但實際監(jiān)測結果顯示，產于海洋沉積物的甲烷對總甲烷氣體釋放量的貢獻較小（～2%）［7-8］；同時聯(lián)合國環(huán)境保護署2010年的研究報告也顯示，占全球總面積71%的海洋對大氣圈自然排放甲烷總量的貢獻僅為3.5%［9］，該控制甲烷氣體釋放的現(xiàn)象是由于海洋沉積物產生的大量甲烷向海底泄漏（或運移）過程中被沉積物中厭氧生物所消耗，發(fā)生甲烷厭氧氧化反應（anaerobic oxidation of methane， AOM）［5］，并轉化為碳酸鹽［9］導致的。大量海洋地質調查獲得的同位素分餾特征等地球化學數(shù)據表明［5，10］：甲烷厭氧氧化（AOM）反應普遍存在，通常發(fā)生在冷泉區(qū)、泥火山和天然氣水合物儲層上方等富甲烷流體滲漏逃逸的地方。在AOM 區(qū)中，海底甲烷分別在甲烷氧化細菌和硫酸鹽還原細菌2種微生物的協(xié)同作用下［11-13］，發(fā)生如下反應：CH4+SO42-→HCO3-+HS-+H2O，其中的甲烷作為電子供體，硫酸鹽作為電子受體，生成的重碳酸根可與地層中的陽離子反應生成碳酸鹽礦物［14-15］。甲烷厭氧氧化（AOM）消耗海洋沉積物產生的甲烷，并可將其轉化為碳酸鹽巖礦物保存下來，故研究甲烷厭氧氧化機理及其誘導下的礦物生成機制對了解其在全球碳循環(huán)和全球氣候變化的作用以及由甲烷氣泄漏引起的環(huán)境效應的研究中均有著重要的意義。近年來，有關AOM的研究越來越多，但實驗室內關于AOM的研究多是用于確定其生物機理［16］、甲烷厭氧氧化速率［17-18］或者其同位素分餾特征［19］。如KNITTEL等［16］對甲烷厭氧氧化反應的速率、環(huán)境影響因素以及ANME的作用機制進行了介紹；NAUHAUS等［17-18］對甲烷厭氧氧化反應的速率進行了研究，結果顯示在不同的甲烷分壓情況下，AOM的反應速率可差幾個數(shù)量級。梁洪野等［20-21］也進行了甲烷氧化菌的分離鑒定相關工作，其初衷多是進行淡水環(huán)境下甲烷氧化菌快速、高密度培養(yǎng)［20］以便應用在工業(yè)生物催化中或者降解污水中的三氯甲烷、三氯乙烯等有毒鹵代烴和多環(huán)芳烴［21-22］；近年來，國內也開展了部分關于海洋環(huán)境中微生物方面的研究［23］，但仍然處于起步階段。而在實驗室條件下有關AOM的礦物生成機制以及其與生物活動間關系的報道較少，關于生物活動與礦物沉積間機理仍然不清楚。CHEN等［24］觀察到AOM過程中的細胞微生物團被硅酸鹽包裹，并提出了AOM生物團的礦物生成機制。因此，研究海底甲烷滲漏背景下的甲烷厭氧氧化誘導的礦物形成機制十分必要。本文作者采用實驗室內微生物培育技術、水化學分析以及礦物表面形態(tài)觀察和成分分析等方法，獲得甲烷-微生物實驗的微生物、水化學、礦物組分結果，探討AOM 過程中微生物生長以及水化學變化、礦物形成的機理。

1 實驗

1.1 樣品采集

甲烷氧化菌廣泛分布于湖泊、沼澤、海底中，而海底底泥樣品不易取得，故為了便于實驗，本次采集長春某湖底淤泥樣品培養(yǎng)甲烷氧化菌。

1.2 甲烷氧化菌培養(yǎng)

分別稱取淤泥樣品5 g，置于已滅菌并加入液體培養(yǎng)基（表 1）100 mL的錐形瓶中，用錫箔紙封口。用100 mL無菌注射器充入甲烷氣體（甲烷氣體購于大連氣體廠，純度為99.99%），放置在30 ℃、轉速為110 r/min的震蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 d直到培養(yǎng)液混濁，得到微生物的母液，期間每隔1 d充1次甲烷氣體。為了使微生物更好地適應富含甲烷的環(huán)境，逐漸增加充入的甲烷氣體量。作為空白對照的錐形瓶中，僅加入液體培養(yǎng)液和甲烷氣體進行培養(yǎng)，不添加淤泥樣品。

表1 培養(yǎng)基的成分（質量濃度）Table 1 Composition of culture medium g/L

為了得到純度更高的微生物菌液，取20 mL已培養(yǎng)6 d的培養(yǎng)液上清液接種于新鮮培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)6 d至培養(yǎng)液混濁，重復培養(yǎng)多次，培養(yǎng)期間逐漸加大充入的甲烷氣體量，獲得純度較高的微生物菌液。

通過母液的培養(yǎng)、傳代以及純化等步驟，得到了能夠利用甲烷進行生長的菌液。空白樣培養(yǎng)液清澈透明，說明培養(yǎng)出的菌量很少，可認為幾乎沒有，其他的培養(yǎng)液混濁，說明培養(yǎng)的微生物為甲烷氧化菌。

1.3 菌種鑒定

為了進一步確定所培養(yǎng)的微生物為甲烷氧化菌，本次實驗進行了菌種的分子生物學鑒定。采用平板涂布法（表 1）對甲烷氧化菌進行純種分離，待菌落生長后挑取單菌落采用劃線平板法分離純化，獲得優(yōu)勢菌株，并郵寄至上海生工進行分子生物學鑒定。甲烷氧化菌的 DNA提取使用 UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工），提取流程按照DNA提取盒的說明進行。用細菌 16S rDNA通用引物27F（5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和 1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴增16S rDNA片段。PCR體系選用25 μL反應體系：基因組DNA（20～50 mg/L）0.5 μL；5×PCR 緩沖液 2.5 μL；dNTP（各

2.5 mmol/L） 1 μL；F（10 μmol/L） 0.5 μL；R（10 μmol/L）0.5 μL；ddH2O補足體積。在PCR儀上進行擴增，條件為：98 ℃預變性3 min；98 ℃時進行25 s，55 ℃時進行25 s，72 ℃時進行1 min，30個循環(huán)；72 ℃修復延伸10 min；4 ℃保存。

根據獲得的16S rDNA序列，采用BLAST對菌種的DNA序列進行同源性對比，獲知其菌種屬性。

1.4 微生物-水-巖石-甲烷相互作用實驗

1.4.1 實驗裝置

實驗在自行研制的多功能水合物模擬實驗系統(tǒng)（圖1）中進行，該系統(tǒng)專為微生物-水-巖石-甲烷相互作用及其次生礦物生成實驗設計。系統(tǒng)由供氣、微生物注入、反應釜、控溫、數(shù)據采集等子系統(tǒng)構成，反應釜的結構采用快開式以方便拆卸，反應釜內徑為80 mm，高為 200 mm，有效體積為 1 000 mL，耐壓值為25 MPa。釜體安裝熱電阻溫度傳感器和壓力傳感器。溫度傳感器（Pt100）探針伸入到釜體液面（溶液）中20 mm，精度為±0.1 ℃。壓力傳感器最大量程為 40 MPa，精度為±0.25%，并配有壓力表以方便觀察，實驗過程中的溫度和壓力變化由數(shù)據采集系統(tǒng)自動記錄。實驗時反應釜內分為飽水的砂、水、氣三層，由微生物注入系統(tǒng)向低溫高壓反應釜中注入甲烷氧化菌，實驗過程中取水樣測試HCO3-等的變化以探究甲烷氧化機理。

圖1 高壓反應釜實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental device of high pressure reactor

1.4.2 實驗條件

根據GUAN等［25］的研究，甲烷厭氧氧化可發(fā)生在水合物儲層上方、泥火山等甲烷滲漏區(qū)，其在水深約470 m到大于3 000 m的海底均有發(fā)現(xiàn)，其相應的溫度在 0～8 ℃之間，溫度相對較低；相應的壓力在4.0～30.0 MPa間變化。因此，在現(xiàn)有的條件下，本文開展了 2組微生物-水-巖石-甲烷相互作用實驗，在固定實驗溫度為1.8 ℃條件下，分別進行了壓力為4.5和7.0 MPa的2組實驗。

1.4.3 實驗步驟及測試分析

在將培養(yǎng)好的菌液注入反應釜前，選擇生長好的甲烷氧化菌進行擴增、濃縮后用紫外分光光度計（UV2100，尤尼科（上海）儀器有限公司）調節(jié)甲烷氧化菌菌液的光密度（OD）為1（OD為被檢測物吸收掉的光密度，能夠定性表征甲烷氧化菌菌液的濃度，本次實驗在600 nm下測定）。將OD為1的甲烷氧化菌菌液50 mL注入到微生物容器（圖1）中，通過平流泵將微生物容器中的微生物菌液注入到反應釜中。注入后，取液體樣，分別進行HCO3-質量濃度的測定和甲烷氧化菌的平板計數(shù)。HCO3-質量濃度的測定采用酸堿中和滴定法測試，單位為mg/L；而甲烷氧化菌的平板計數(shù)采用涂布平板法，單位為個。在實驗結束后，將巖石樣品烘干并進行掃描電鏡分析，巖石片的表面形態(tài)觀察在吉林大學古生物中心實驗室中進行，利用配置的JSM-6700F型掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM， JEOL Corporation， Tokyo， Japan）和INCAX-SIGHT型能譜儀（energy-dispersive X-ray spectrometer， EDS，Oxford， UK）進行表面形態(tài)觀察和礦物成分分析。

2 實驗結果與分析

2.1 微生物鑒定結果

由菌落微生物提取的總DNA在凝膠成像系統(tǒng)下拍照結果可知：各菌落均得到1條較為清晰的電泳條帶，說明其基因組DNA提取有效。對以上DNA進行PCR擴增，結果如圖2所示。與Marker比較可知，擴增后各菌落微生物的基因片段約為1 400 bp。

圖2 各菌落16S rDNA PCR 擴增產物瓊脂糖電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA for different samples

利用菌落的DNA序列采用BLAST進行同源性序列對比：圖中S1408菌屬于假單胞菌屬，與假單胞菌fluorescens strain LMG 14576 16S同源性為100%； S1409菌屬于假單胞菌屬，與假單胞菌putida H8234菌株序列同源性為99%；S1410菌屬于不動桿菌屬，與不動桿菌屬calcoaceticus strain YLZZ-1 16S同源性為 99%；S1411菌屬假單胞菌屬，與假單胞菌fluorescens strain LMG 14576 16S同源性為99%；由此判定所培養(yǎng)的微生物為假單胞菌屬的甲烷氧化菌。

2.2 微生物-水-巖石-甲烷相互作用結果

微生物注入后實驗過程中HCO3-質量濃度隨時間的變化如圖3（a）和4（a）所示。由圖3（a）和4（a）可以看出：甲烷氧化菌菌液注入后，其t=0時刻的HCO3-質量濃度為注入菌液中含有的 HCO3-被稀釋的結果，HCO3-質量濃度初始時刻背景值分別為23 mg/L和10 mg/L，而微生物注入后的微生物數(shù)量背景值分別為1.45×106和1.70×106個；甲烷氧化菌在飽和甲烷的反應釜中生長，代謝產生HCO3-，HCO3-質量濃度增加，4.5 MPa（實驗 1）時，HCO3-質量濃度最高約 47 mg/L，7.0 MPa（實驗2）時最高能達到49 mg/L；隨后HCO3-質量濃度降低，接近但高于其初始質量濃度。

從圖3（a）可以看出：HCO3-質量濃度隨時間呈現(xiàn)先增加（0～90 min）后減?。?0～150 min）的趨勢。反應液中 HCO3-質量濃度的變化是微生物-甲烷相互作用的結果，注入的甲烷氧化菌利用甲烷單加氧酶氧化反應釜內的甲烷氣，發(fā)生的反應式為：CH4+3H2O→HCO3-+4H2+H+，產生 HCO3-，這個反應是由微生物引起的反向甲烷生成反應［26-28］，從熱力學角度來說是可以實現(xiàn)的［27］。微生物注入后，微生物需適應反應釜中的新環(huán)境，原菌液中營養(yǎng)物質充分，部分微生物活性較高；且微生物在適應新環(huán)境過程中不斷地代謝產生HCO3-，HCO3-質量濃度增加，在90 min時HCO3-質量濃度達到最大值47.65 mg/L。而在適應新環(huán)境的過程中，部分微生物不能適應新環(huán)境而導致生物活性受到抑制或死亡，微生物數(shù)量降低，90 min時微生物的數(shù)量最小達到9.30×105個（圖3（b））。微生物在適應了新環(huán)境后，利用原有菌液中的營養(yǎng)物質生長，微生物數(shù)量增加到 2.75×106個（90～150 min）。隨后由于HCO3-與溶液中的某些陽離子結合生成沉淀消耗HCO3-，消耗量大于微生物作用下甲烷厭氧氧化反應生成的量，因此，HCO3-質量濃度在逐漸減小。由于實驗 1時間較短，150 min時的 HCO3-質量濃度為29.32 mg/L，比初始時刻的23.46 mg/L高出5.86 mg/L。因此，在實驗2時加長了微生物與甲烷相互作用的時間，以期獲得效果更好的HCO3-質量濃度變化數(shù)據。

圖3 4.5 MPa時HCO3-質量濃度和微生物數(shù)量隨時間的變化Fig.3 Changes of mass concentration of HCO3-and microbial quantity over time at 4.5 MPa

從圖4（a）可以看出：HCO3-質量濃度隨時間也是先增加（0～90 min）后減?。?0～1 170 min）的趨勢，在90 min時HCO3-質量濃度達到最大值48.45 mg/L。同實驗 1，此時的微生物最活躍，對應圖4（b）中微生物數(shù)量最少。微生物在適應了環(huán)境的過程中，利用原有菌液中的營養(yǎng)物質生長，微生物數(shù)量增加到2.85×106個（150～210 min間）。210 min后，微生物繼續(xù)利用反應釜內的營養(yǎng)物質生長，微生物的數(shù)量超過3.00×106個，無法計數(shù)，但是能看出微生物數(shù)量增加。在1 170 min時，檢測溶液中HCO3-質量濃度降為4.39 mg/L，這是HCO3-與溶液中的某些陽離子結合生成沉淀所造成的。

圖4 7.0 MPa時HCO3-質量濃度和微生物數(shù)量隨時間的變化Fig.4 Changes of mass concentration of HCO3-and microbial quantity over time at 7.0 MPa

2次不同壓力下的實驗顯示：微生物在不同壓力下的HCO3-質量濃度均呈先增加后減小的趨勢，達到HCO3-質量濃度峰值點所需的時間基本一致。HCO3-質量濃度最高的時候是微生物個數(shù)最低的時候，HCO3-質量濃度的增大和減小能夠表征微生物的生長及其活性衰減情況。在整個甲烷厭氧氧化反應發(fā)生的過程中，微生物不斷的適應新環(huán)境，從初始時刻到實驗結束時，微生物的形態(tài)發(fā)生了改變（圖5），微生物菌落的形態(tài)由開始的直徑3 mm左右的圓形菌轉變?yōu)楹笃诘? mm左右的圓形菌居多。其中的甲烷氧化菌為甲烷的氧化提供動力，促使甲烷厭氧氧化反應的發(fā)生。

實驗結束后，在石英砂表面發(fā)現(xiàn)了含 Ca，F(xiàn)e和Mg的碳酸鹽礦物。典型的碳酸礦物照片如圖6（a）和6（b）所示，其中圖6（a）所示為團狀的無定形礦物，含Mg，Ca，F(xiàn)e，Na，Si，C和O等組分（圖6（c）），推斷為鐵白云石。而實驗所用石英砂主要含石英和長石類礦物，因此掃描電鏡結果所含的Al和Si為背景礦物所含組分。而圖6（b）所示為亮白色菱柱狀礦物，含Mg，Ca，F(xiàn)e，Na，Si，C和O等組分（圖6（d）），推斷為碳酸鹽礦物和長石類礦物的中間產物。

基于現(xiàn)有的實驗結果，結合CHEN等［24］關于甲烷厭氧氧化的研究成果，將甲烷厭氧氧化中微生物的活動以及礦物沉積間的關系表示如圖7所示。由于甲烷氧化菌的代謝作用，反應釜中的甲烷被微生物利用，發(fā)生甲烷厭氧氧化反應，生成了HCO3-，導致溶液堿度增加，HCO3-與溶液中的陽離子結合，發(fā)生反應：HCO3-+Ca2+（Mg2+， Fe2+）→CaCO3（MgCO3， FeCO3）+H+，生成碳酸鹽礦物。

圖5 平板計數(shù)照片F(xiàn)ig.5 Photos of plate count

圖6 掃描電鏡觀察結果Fig.6 Results from SEM observation

圖7 甲烷氧化菌與碳酸鹽礦物沉淀的關系［24］Fig.7 Relationship between microbial metabolism and precipitation of carbonate［24］

3 結論

1） 本室內實驗培養(yǎng)的甲烷氧化菌為假單胞菌屬，可利用甲烷作為碳源生長。

2） 微生物注入反應釜后，甲烷被消耗，發(fā)生了甲烷厭氧氧化反應CH4+3H2O→HCO3-+4H2+H+，實驗獲得的HCO3-質量濃度變化與微生物數(shù)量和活性有關。HCO3-的這種變化趨勢間接地表征微生物的生長和活性衰減情況。

3） 甲烷氧化菌注入低溫、高壓條件的反應器后，需要一定時間適應新的環(huán)境，適應環(huán)境后，微生物數(shù)量增加；但后期因營養(yǎng)物質得不到補充，甲烷氧化菌生物活性衰減。

4） 在甲烷氧化細菌的作用下，石英砂表面生成了無定形鐵白云石以及亮白色菱柱狀碳酸鹽和長石類礦物的中間產物，印證了甲烷厭氧氧化反應的發(fā)生。

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（編輯 楊幼平）

Experiment on anaerobic oxidation of methane and precipitation of carbonate mediated by microbes

LIU Xiao， XU Tianfu， WEI Mingcong， WEN Yujuan， JIN Guangrong， CAO yuqing

（Key Laboratory of Groundwater Resources and Environment， Ministry of Education， Jilin University，Changchun 130021， China）

The methane oxidizing bacteria was isolated from lake bottom sediment and the corresponding DNA sequencing was carried out. Experiment of interaction between methane oxidizing bacteria-water-rock was conducted in a self-developed reactor system， and variations of the number of microorganisms and the mass concentration of HCO3-were analyzed， respectively. Finally， rock slices were viewed with scanning electron microscope （SEM）. The results show that the cultured methane oxidizing bacteria belongs to pseudomonas genus. HCO3-produced after bacteria injected into the reactor. Changes of mass concentration of HCO3-have certain correlation relationship with the number and microbial activity of microorganism. Intermediate minerals， including amorphous ankerite， bright columnar of carbonate and feldspars， are precipitated on the surface of quartz sandstone. Key words: methane oxidizing bacteria； anaerobic oxidation of methane； carbonates

P593

A

1672-7207（2016）05-1473-07

10.11817/j.issn.1672-7207.2016.05.003

2015-05-21；

2015-07-16

中國博士后面上基金資助項目（2015M571369）；吉林大學研究生創(chuàng)新基金資助項目（2014104） （Project（2015M571369）supported by the Postdoctoral Science Foundation of China； Project（2014104） supported by the Graduate Innovation Fund of Jilin University）

許天福，博士，教授，從事海洋天然氣水合物試開采優(yōu)化和相關自生礦物形成、地熱能開發(fā)與利用等研究；E-mail： Tianfu_Xu@jlu.edu.cn