人體腦組織RNA表達(dá)水平與早期PMI的相關(guān)性

呂葉輝，馬開(kāi)軍，李志宏，顧　峻，鮑建瑛，楊智昉，高　靜，曾　顏，陶　麗，陳　龍（．上海健康醫(yī)學(xué)院，上海 08；．上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 0008；．復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 000）

人體腦組織RNA表達(dá)水平與早期PMI的相關(guān)性

呂葉輝1，馬開(kāi)軍2，李志宏1，顧峻1，鮑建瑛1，楊智昉1，高靜1，曾顏3，陶麗3，陳龍3
（1．上海健康醫(yī)學(xué)院，上海 201318；2．上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；3．復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032）

目的 探討人體腦組織多種RNA指標(biāo)的表達(dá)水平與早期死亡時(shí)間（PMI）的相關(guān)性。方法 選取12例已知PMI（4.3～22.5h）的個(gè)體，提取腦組織總RNA。選取8種常用RNA指標(biāo)（β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9、miRNA-125b），通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在腦組織中的表達(dá)水平。運(yùn)用geNorm軟件篩選早期PMI表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參指標(biāo)，并分析其表達(dá)水平與相關(guān)因素（年齡、性別、死亡原因）的關(guān)系。運(yùn)用R軟件將內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化的RNA指標(biāo)代入前期研究建立的數(shù)學(xué)模型推斷PMI，計(jì)算推斷PMI的誤差率以驗(yàn)證模型精確性。結(jié)果 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b表達(dá)穩(wěn)定，其表達(dá)水平與年齡、性別、死亡原因無(wú)關(guān)。利用β-actin推斷PMI的誤差率為24.6%，GAPDH為41.0%。結(jié)論 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b在死亡早期表達(dá)穩(wěn)定，適合作為人體腦組織的內(nèi)參指標(biāo)。β-actin表達(dá)水平與PMI相關(guān)性良好，有望成為推測(cè)早期PMI的輔助指標(biāo)。

法醫(yī)病理學(xué)；RNA；腦；死亡時(shí)間；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用RNA時(shí)序性降解規(guī)律推斷PMI逐漸成為研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)RNA并非想象中那樣脆弱，可以通過(guò)測(cè)定某些管家基因mRNA含量變化推斷PMI，如β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）等［1］，但針對(duì)早期PMI的研究相對(duì)較少。作為快速高效的RNA定量技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在PMI推斷的研究領(lǐng)域得到越來(lái)越多的應(yīng)用。但由于該方法得到的結(jié)果必須依賴于內(nèi)參指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化處理，尋找穩(wěn)定、適用的內(nèi)參指標(biāo)十分必要。

由于人體死亡后不同個(gè)體間存在諸如溫度、濕度、死亡原因等內(nèi)外因素的干擾，無(wú)法進(jìn)行系統(tǒng)規(guī)律的研究，通過(guò)動(dòng)物模型對(duì)研究人體死亡后體內(nèi)RNA降解變化規(guī)律有著重要的參考價(jià)值。筆者在前期研究［2］中已經(jīng)建立了大鼠腦組織多溫度、多RNA指標(biāo)的數(shù)學(xué)模型推斷早期PMI，但還需要人體樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究收集已知PMI的人體樣本，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)死亡早期人體腦組織各RNA指標(biāo)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，篩選表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參指標(biāo)，并將內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化的RNA指標(biāo)代入數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證，以期探討運(yùn)用該方法推斷PMI的準(zhǔn)確性和有效性。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：9700型PCR擴(kuò)增儀、Prism?7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)AB公司），NanoDrop 1000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），Agilent 2100生物分析儀（美國(guó)Agilent公司）。

試劑：TRIzol試劑盒（美國(guó) Invitrogen公司），RNAlater保護(hù)液、PrimeScriptTMRT reagent試劑盒、One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），DEPC水（焦碳酸二乙酯處理并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水）。

1.2樣本

選取12例上海市公安局物證鑒定中心的檢案案例，每例均有準(zhǔn)確的卷宗記錄，包括性別、年齡、環(huán)境平均溫度、死亡原因、PMI等，詳見(jiàn)表1。死者尸體沒(méi)有呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的腐敗現(xiàn)象，尸體解剖前沒(méi)有經(jīng)過(guò)冰凍和解凍過(guò)程。解剖時(shí)取額葉腦組織50～100mg，用無(wú)菌眼科剪剪碎后分裝于RNAlater保護(hù)液中，立即置于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1　12例人體樣本詳細(xì)信息

1.3指標(biāo)選擇

本研究選擇 8種 RNA指標(biāo)，分別為 β-actin、GAPDH、核糖體蛋白 S29（ribosomal protein S29，RPS29）、18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）、5S核糖體RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）、U6微核RNA（U6 small nuclear RNA，U6 snRNA）、微小RNA-9（microRNA-9，miR-9）及微小RNA-125b （microRNA-125b，miR-125b）。引物設(shè)計(jì)至少跨一個(gè)外顯子或外顯子區(qū)域以保證cDNA正確的合成與擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度均在200bp以下。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

表2　實(shí)驗(yàn)選取的RNA指標(biāo)及引物序列

1.4總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

準(zhǔn)確稱取腦組織質(zhì)量，按照TRIzol試劑盒總RNA提取說(shuō)明書(shū)提取總RNA，加入30μL DEPC水溶解后置于-80℃凍存。NanoDrop 1000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度及濃度。Agilent 2100生物分析儀測(cè)定RNA完整性。應(yīng)用PrimeScriptTMRT reagent試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以用于β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。應(yīng)用One Step Prime-Script?miRNA cDNA Synthesis試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以用于5S rRNA、U6 snRNA、miR-9、miR-125b的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR

應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制20 μL反應(yīng)體系，并應(yīng)用Prism?7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。每個(gè)樣本重復(fù)3次，結(jié)果由系統(tǒng)自動(dòng)生成，從而得到各個(gè)RNA指標(biāo)的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.6.1內(nèi)參選擇及穩(wěn)定性評(píng)估

運(yùn)用geNorm v3.5軟件（比利時(shí)Biogazelle公司）對(duì)RNA指標(biāo)的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理［3］。根據(jù)平均表達(dá)穩(wěn)定度M值確定最穩(wěn)定的指標(biāo)，M值越小，指標(biāo)的穩(wěn)定性越高。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異V值判斷引入新的內(nèi)參指標(biāo)是否會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化因子產(chǎn)生顯著影響，默認(rèn)V值為0.15，如果Vn/Vn+1（n＞1）小于0.15（當(dāng)多個(gè)V值符合時(shí)選取最小值），說(shuō)明n或n+1個(gè)RNA指標(biāo)可以作為內(nèi)參指標(biāo)使用。

運(yùn)用SPSS v22.0軟件分析內(nèi)參指標(biāo)表達(dá)水平與性別、年齡、死亡原因之間的關(guān)系，檢驗(yàn)方法分別采用t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

除內(nèi)參指標(biāo)外，其余RNA指標(biāo)作為候選指標(biāo)。

1.6.2PMI推斷及數(shù)學(xué)模型驗(yàn)證

運(yùn)用SPSS v22.0軟件對(duì)候選RNA指標(biāo)Ct值進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化（ΔCt=Ct候選指標(biāo)-Ct內(nèi)參均值），內(nèi)參均值為內(nèi)參指標(biāo)的幾何平均數(shù)，并對(duì)各候選指標(biāo)ΔCt值及PMI進(jìn)行三次方回歸分析并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。

本課題組在前期研究［2］中已經(jīng)建立了大鼠腦組織死后24 h內(nèi)的三元（ΔCt值、溫度、PMI）二次數(shù)學(xué)模型推斷PMI。本研究運(yùn)用R v3.2.3軟件（美國(guó)RStudio公司）將人體樣本數(shù)據(jù)代入已建模型推斷PMI，并計(jì)算PMI推斷和PMI實(shí)際之間的差異程度，用誤差率表示，誤差率=|PMI推斷-PMI實(shí)際|/PMI實(shí)際×100%。

2　結(jié)　果

2.1內(nèi)參選擇及穩(wěn)定性評(píng)估

所有人體樣本抽提的RNA均成功擴(kuò)增，引物特異性高。經(jīng)geNorm v3.5軟件處理后，得到各RNA指標(biāo)的平均表達(dá)穩(wěn)定度 M值：β-actin＞GAPDH＞18S rRNA＞RPS29＞U6 snRNA＞5S rRNA＞miR-9=miR-125b；標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異Vn/Vn+1值：V2/V3=0.082，V3/V4=0.095，V4/V5=0.087，V5/V6=0.112，V6/V7=0.137，V7/V8=0.153。結(jié)果表明，miR-9和miR-125b最為穩(wěn)定，而β-actin最不穩(wěn)定；V2/V3小于0.15且最小，即選擇2個(gè)或3個(gè)RNA指標(biāo)作為內(nèi)參最為合適。為和前期研究結(jié)果保持一致，本研究選取3個(gè)RNA指標(biāo)作為內(nèi)參指標(biāo)，即5S rRNA、miR-9和miR-125b。

分別采用t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，分析5S rRNA、miR-9和miR-125b平均表達(dá)水平與性別、年齡及死亡原因之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在死亡早期人腦組織中，三種指標(biāo)的表達(dá)水平是穩(wěn)定的，不受性別影響，男女表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；上述指標(biāo)表達(dá)水平與年齡之間無(wú)相關(guān)性（r=0.2102，P＞0.05），排除了年齡因素的影響；上述指標(biāo)在不同死亡原因中表達(dá)水平差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。綜合分析，在死亡早期，5S rRNA、miR-9 和miR-125b的表達(dá)水平不受性別、年齡和死亡原因的影響。

2.2PMI推斷及數(shù)學(xué)模型驗(yàn)證

對(duì)候選RNA指標(biāo)Ct值進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化處理并分析其與PMI的相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)r分別為：β-actin，0.837 2（P＜0.01）；GAPDH，0.683 1（P＜0.01）；18S rRNA，0.472 5（P＞0.01），RPS29，0.403 6（P＞0.01）；U6 snRNA，0.2036（P＞0.01）。經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后，人體腦組織中βactin與PMI的相關(guān)性最好，GAPDH次之，其余RNA指標(biāo)與PMI相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

運(yùn)用R v3.2.3軟件分別將已知ΔCt值及溫度分別代入已建的β-actin、GAPDH模型［2］進(jìn)行驗(yàn)證，分別得到β-actin和GAPDH的PMI推斷值，推斷值范圍設(shè)定為［0，24］，并計(jì)算推斷PMI與實(shí)際PMI的誤差率，結(jié)果見(jiàn)表3。

對(duì)于所有樣本，運(yùn)用β-actin模型推斷PMI的總誤差率為24.6%，GAPDH為41.0%。對(duì)于1～6號(hào)案例（PMI實(shí)際在0～12h），運(yùn)用β-actin模型推斷PMI的平均誤差率為35.2%，GAPDH為48.9%。對(duì)于7～12號(hào)案例（PMI實(shí)際在12～24h），運(yùn)用β-actin模型推斷PMI的平均誤差率為14.1%，GAPDH為33.1%。與GAPDH比較，運(yùn)用β-actin模型推斷PMI誤差率相對(duì)較低。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)GAPDH推斷PMI的誤差率與案例樣本的死亡原因有關(guān)，失血性休克死亡樣本誤差率為43.8%，機(jī)械性窒息死亡樣本誤差率為44.5%，兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01），但均大于顱腦損傷死亡樣本誤差率（32.0%，P＜0.01）。

表3　利用數(shù)學(xué)模型推斷樣本PMI

3　討　論

PMI的推斷一直是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要且復(fù)雜的課題，其推斷方法多種多樣，近年來(lái)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定RNA表達(dá)水平推斷PMI已成為研究熱點(diǎn)［4］。由于人體死亡后不同個(gè)體間存在諸如年齡、性別、溫度、死亡原因等內(nèi)外因素的干擾，直接進(jìn)行人體資料的研究缺乏可行性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，組織易于獲取和保存，實(shí)驗(yàn)條件（如溫度、PMI等）可控，建立的方程可信度較高，因此建立動(dòng)物模型研究RNA降解變化規(guī)律對(duì)于人體PMI推斷有著重要的參考價(jià)值。本課題組在前期研究［2］中已經(jīng)建立了大鼠腦組織24 h內(nèi)多溫度、多RNA指標(biāo)的數(shù)學(xué)模型推斷早期PMI，但缺乏人體樣本的進(jìn)一步驗(yàn)證。為了證實(shí)該方法的可行性及準(zhǔn)確性，本研究收集已知PMI的人體樣本，探討人體腦組織中多種RNA含量與早期PMI的相關(guān)性。

為了將人體樣本和動(dòng)物樣本數(shù)據(jù)有效統(tǒng)一，盡可能消除大鼠與人體組織種屬差異的影響，本研究所選用的RNA指標(biāo)均具有良好的保守性與穩(wěn)定性。βactin和GAPDH是常用的管家基因，廣泛存在于所有細(xì)胞中，高度穩(wěn)定保守［5-6］；RPS29屬于核糖體蛋白家族，用于編碼40S亞基的核糖體蛋白，在不同的細(xì)胞系中擁有良好的穩(wěn)定性，是一類廣泛存在的基因［7］；18S rRNA和5S rRNA是核糖體RNA，其突變速率相對(duì)恒定，而且進(jìn)化過(guò)程相對(duì)緩慢，其保守區(qū)常用于構(gòu)建生命的統(tǒng)一進(jìn)化樹(shù)，在不同物種間具有很高的保守性［8］；U6 snRNA是核內(nèi)小RNA，參與真核生物細(xì)胞核中RNA的加工，在一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)上都高度保守［9］；miRNA也是真核生物中廣泛存在的小分子RNA，可調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)，并在不同物種間有著較好的連續(xù)性和保守型，也常用于研究物種的進(jìn)化規(guī)律［10］。此外，本研究中人體RNA引物設(shè)計(jì)位置和序列與前期研究大鼠引物盡量一致，其擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小和序列也盡量保持一致，進(jìn)一步消除種屬差異的影響。

除此之外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上取決于內(nèi)參指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化。選取穩(wěn)定的內(nèi)參指標(biāo)可以排除個(gè)體差異帶來(lái)的誤差，使統(tǒng)計(jì)結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確。對(duì)于人體樣本，找到合適的內(nèi)參指標(biāo)對(duì)于RNA表達(dá)水平的準(zhǔn)確定量至關(guān)重要。經(jīng)geNorm軟件統(tǒng)計(jì)分析，5S rRNA、miR-9和miR-125b具有最好的穩(wěn)定性。為了排除相關(guān)參數(shù)（如性別、年齡及死亡原因等）對(duì)候選RNA表達(dá)的影響，本研究還做了進(jìn)一步的研究，以確定所選的三個(gè)內(nèi)參是否可作為穩(wěn)定可靠的內(nèi)參指標(biāo)應(yīng)用于PMI推斷研究。結(jié)果顯示三個(gè)內(nèi)參指標(biāo)的表達(dá)水平與上述參數(shù)無(wú)明顯的相關(guān)性，表明5S rRNA、miR-9和miR-125b適合作為內(nèi)參指標(biāo)，其表達(dá)不易受內(nèi)外因素的影響，在死亡早期腦組織中表達(dá)穩(wěn)定。

篩選出內(nèi)參指標(biāo)后，對(duì)其余候選RNA指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并計(jì)算各RNA表達(dá)水平與PMI的關(guān)系。結(jié)果表明β-actin相關(guān)系數(shù)最高，GAPDH次之，表明這兩個(gè)指標(biāo)更易受PMI的影響，與前期研究［2］結(jié)果一致。分別將標(biāo)準(zhǔn)化后的β-actin和GAPDH代入相應(yīng)數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行PMI推斷。結(jié)果表明，在12個(gè)人體樣本中，運(yùn)用β-actin模型推斷PMI的總誤差率為24.6%，運(yùn)用GAPDH模型推斷PMI的總誤差率為41.0%，分別高于前期研究中動(dòng)物樣本的14.1%和22.2%。對(duì)于GAPDH，在進(jìn)行人體樣本PMI推斷時(shí)其誤差率較高，且在失血性休克死亡和機(jī)械性窒息死亡樣本中誤差率明顯高于顱腦損傷樣本，表明GAPDH可能受死亡原因影響。GAPDH是常用的RNA指標(biāo)，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定保守，但也有研究［11］表明，GAPDH在特定環(huán)境中（如缺氧情況下）表達(dá)水平發(fā)生改變。Koppelkamm等［6］報(bào)道GAPDH表達(dá)水平在窒息死亡樣本中高于顱腦損傷死亡樣本。Yamanaka等［12］發(fā)現(xiàn)在人皮膚成纖維細(xì)胞中，GAPDH在缺氧情況下表達(dá)上調(diào)而β-actin保持不變。本研究中GAPDH誤差率較高可能是由于GAPDH在失血性休克和機(jī)械性窒息樣本中表達(dá)上調(diào)，ΔCt值變小，以致誤差率升高。對(duì)于β-actin，在動(dòng)物樣本和人體樣本中其誤差率都相對(duì)較低，推測(cè)是由于其表達(dá)水平不受死亡原因的影響，與PMI的相關(guān)性更好，表明利用β-actin進(jìn)行PMI推斷相對(duì)準(zhǔn)確。研究還發(fā)現(xiàn)PMI在12～24 h的人體樣本推斷誤差率明顯小于PMI在0～12 h的樣本，推測(cè)是由于隨PMI延長(zhǎng)RNA降解速率加快，ΔCt增加明顯所致。因此，對(duì)于更早期的PMI推斷還需篩選時(shí)序性降解更敏感的RNA指標(biāo)做進(jìn)一步研究。

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究人體腦組織8種RNA指標(biāo)在死亡早期的降解規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5S rRNA、miR-9和miR-125b在人體樣本中表達(dá)穩(wěn)定，其表達(dá)水平與年齡、性別、死亡原因無(wú)關(guān)，適合作為PMI推斷的內(nèi)參指標(biāo)。經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化處理后，分別將β-actin和GAPDH代入前期研究中建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行PMI推斷，推斷誤差率分別為24.6% 和41.0%。GAPDH推斷誤差率較高，推測(cè)是特定RNA表達(dá)受死亡原因影響所致。β-actin表達(dá)水平與PMI相關(guān)性良好，推斷誤差率也相對(duì)較低，證實(shí)運(yùn)用該方法推斷人體樣本早期PMI相對(duì)準(zhǔn)確有效。本課題將繼續(xù)收集人體組織進(jìn)行大樣本驗(yàn)證，以期優(yōu)化數(shù)學(xué)模型，提升推斷精確度，以符合實(shí)際檢案的需要。

［1］Partemi S，Berne PM，Batlle M，et al.Analysis of mRNA from human heart tissue and putative applications in forensic molecular pathology［J］.Forensic Sci Int，2010，203（1-3）：99-105.

［2］呂葉輝，李志宏，托婭，等.不同溫度下大鼠腦組織RNA降解與早期PMI的相關(guān)性［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（3）：165-170.

［3］Vandesompele J，De Preter K，Pattyn F，et al.Ac

curate normalization of real-time quantitative RT-PCR databygeometricaveragingofmultipleinternal control genes［J］.Genome Biol，2002，3（7）：H34.

［4］ González-Herrera L，Valenzuela A，Marchal JA，et al.Studies on RNA integrity and gene expression in human myocardial tissue，pericardial fluid and blood，and its postmortem stability［J］.Forensic Sci Int，2013，232（1-3）：218-228.

［5］ Thellin O，Zorzi W，Lakaye B，et al.Housekeeping genes as internal standards：use and limits［J］.J Biotechnol，1999，75（2-3）：291-295.

［6］ Koppelkamm A，Vennemann B，F(xiàn)racasso T，et al. Validation of adequate endogenous reference genes for the normalisation of qPCR gene expression data in human post mortem tissue［J］.Int J Legal Med，2010，124（5）：371-380.

［7］ Bortoluzzi S，d’Alessi F，Romualdi C，et al.Differential expression of genes coding for ribosomal proteins in different human tissues［J］.Bioinformatics，2001，17（12）：1152-1157.

［8］ Tajrishimm，Tuteja R，Tuteja N.Nucleolin：The most abundant multifunctional phosphoprotein of nucleolus［J］.Commun Integr Biol，2011，4（3）：267-275.

［9］Marz M，Kirsten T，Stadler PF.Evolution of spliceosomal snRNA genes in metazoan animals［J］.J Mol Evol，2008，67（6）：594-607.

［10］Chen K，Rajewsky N.The evolution of gene regulation by transcription factors and microRNAs［J］.Nat Rev Genet，2007，8（2）：93-103.

［11］Zhong H，Simons JW.Direct comparison of GAPDH，beta-actin，cyclophilin，and 28S rRNA as internal standards for quantifying RNA levels under hypoxia［J］. Biochem Biophys Res Commun，1999，259（3）：523-526.

［12］Yamanaka M，Ishikawa O.Hypoxic conditions decrease the mRNA expression of proalpha1（Ⅰ）and（Ⅲ）collagens and increase matrix metalloproteinases-1 of dermal fibroblasts in three-dimensional cultures［J］.J Dermatol Sci，2000，24（2）：99-104.

（本文編輯：鄒冬華）

Correlation between RNA Expression Level and Early PMI in Human Brain Tissue

Lü Ye-hui1，MA Kai-jun2，LI Zhi-hong1，GU Jun1，BAO Jian-ying1，YANG Zhi-fang1，GAO Jing1，ZENG Yan3，TAO Li3，CHEN Long3
（1.Shanghai University of Medicine&Health Science，Shanghai 201318，China；2.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence，Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China；3.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Science，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

Objective To explore the correlation between the expression levels of several RNA markers in human brain tissue and early postmortem interval（PMI）.Methods Twelve individuals with known PMI （range from 4.3 to 22.5 h）were selected and total RNA was extracted from brain tissue.Eight commonly used RNA markers were chosen including β-actin，GAPDH，RPS29，18S rRNA，5S rRNA，U6 snRNA，miRNA-9 and miRNA-125b，and the expression levels were detected in brain tissue by realtime fluorescent quantitative PCR.The internal reference markers with stable expression in early PMI were screened using geNorm software and the relationship between its expression level and some relevant factors such as age，gender and cause of death were analyzed.RNA markers normalized by internal reference were inserted into the mathematic model established by previous research for PMI estimation using R software.Model quality was judged by the error rate calculated with estimated PMI.Results 5S rRNA，miRNA-9 and miRNA-125b showed quite stable expression and their expression levels had no relation with age，gender and cause of death.The error rate of estimated PMI using β-actin was 24.6%，while GAPDH was 41.0%.Conclusion 5S rRNA，miRNA-9 and miRNA-125b are suitable as internal reference markers of human brain tissue owing to their stable expression in early PMI.The expression level of βactin correlates well with PMI，which can be used as an additional index for early PMI estimation.

forensic pathology；RNA；brain；postmortem interval；real-time fluorescent quantitative PCR

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.002

1004-5619（2016）04-0245-05

國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（81373242、81671863）；上海健康醫(yī)學(xué)院種子基金項(xiàng)目；上海高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃

呂葉輝（1989—），男，博士研究生，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)教學(xué)、科研工作；E-mail：yeyeliushu@163.com

陳龍，男，博士，主任法醫(yī)師，副教授，主要從事法醫(yī)病理學(xué)及法醫(yī)臨床學(xué)研究；E-mail：chenlong@shmu.edu.cn

2016-03-28）