MiR-30a在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚中的作用

潘偉 趙娟 羅韶金 楊澤福 黃景文

基礎(chǔ)研究

MiR-30a在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚中的作用

潘偉 趙娟 羅韶金 楊澤福 黃景文

目的 探討miR-30a是否介導(dǎo)了血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心肌肥厚。方法 將心肌細胞分為對照組和AngⅡ誘導(dǎo)組，用Real-time PCR觀察AngⅡ刺激后心肌細胞miR-30a的變化和肥厚基因的表達。將心肌細胞分為對照組和AngⅡ誘導(dǎo)組，用激光共聚焦觀察AngⅡ刺激后心肌細胞大小的變化。將心肌細胞分為對照組（AngⅡ+NC）、miR-30a誘導(dǎo)組（AngⅡ+miR-30a mimics）和 miR-30a抑制組（AngⅡ+miR-30a inhibitors），通過對miR-30a過表達或者抑制miR-30a活性后，觀察心肌細胞肥厚基因表達和心肌細胞大小的變化。結(jié)果 AngⅡ刺激心肌細胞后，心肌細胞miR-30a表達量下調(diào)至刺激前的32.9%。AngⅡ+miR-30a mimics組心肌細胞肥厚基因ANP和β-MHC表達分別是negative control組的51.7%和53.5%，AngⅡ+miR-30a inhibitors組心肌細胞肥厚基因ANP和β-MHC表達分別是AngⅡ+negative control組的1.88倍和1.64倍。激光共聚焦檢測形態(tài)學(xué)的改變，AngⅡ刺激心肌細胞使心肌細胞面積增加至刺激前的2.95倍。與negative control組比較，AngⅡ+miR-30a mimics組心肌細胞面積減少至57.8%，AngⅡ+miR-30a inhibitors組心肌細胞面積增加至1.50倍。結(jié)論 miR-30a下調(diào)可介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚。

MiR-30a； 血管緊張素Ⅱ； 心肌肥厚

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin-system，RAS）在心臟重構(gòu)（cardiac remodeling）發(fā)生中起重要作用。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAS中最主要的生物活性物質(zhì)。我們的前期研究[1]表明，心臟肥厚（cardiac hypertrophy）大鼠心臟組織miR-30a下調(diào)。那么，AngⅡ是否是通過下調(diào)miR-30a引起心肌肥厚呢？即我們試圖證明是否存在如下的心臟重構(gòu)機制：AngⅡ↑→miR-30a↓→心肌肥厚。

1 材料與方法

1.1 大鼠原代心肌細胞培養(yǎng)及干預(yù) 出生1～3 d的新生SD大鼠，剪取心尖部，剪碎，胰蛋白酶消化，收集上清。過濾，離心，收集細胞懸液，差速分離培養(yǎng)心肌細胞。第5天予以含miR-30a mimics或inhibitors的慢病毒感染［4×105個心肌細胞予以20μl病毒（109 TU/ml）和 polybrene（終濃度 5 mg/ml）］，第6天予以10-6mol/L AngⅡ刺激。第9天收集樣本檢測肥厚基因ANP和β-MHC、miR-30a及細胞形態(tài)。根據(jù)實驗?zāi)康牟煌纸M，將心肌細胞分為對照組和AngⅡ誘導(dǎo)組，觀察AngⅡ刺激后心肌細胞miR-30a的變化、肥厚基因的表達和心肌細胞大小的變化；將心肌細胞分為對照組（AngⅡ+NC）、miR-30a誘導(dǎo)組（AngⅡ+miR-30a mimics）和miR-30a抑制組（AngⅡ+miR-30a inhibitors），觀察心肌細胞肥厚基因表達和心肌細胞大小的變化。

1.2 細胞樣本肥厚基因和miR-30a的Real-time RT-PCR Trizol提取總RNA。肥厚基因按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。25 μl PCR反應(yīng)體系：2×UDG mix 12.5 μl，ROX（1∶10）0.5 μl，Primer （F+R）1.0 μl，cDNA 2.0 μl，DEPC-treated water 9.0 μl。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min→95 ℃ 2 min→95℃ 15 s→62℃ 30 s。每個樣品做3個復(fù)孔，并重復(fù)熒光定量PCR的檢測，結(jié)果取平均值。經(jīng)熒光信號理論方程推導(dǎo)出基因表達量計算公式，采用18 s作為內(nèi)參對照，計算肥厚基因相對表達量=2－ΔΔCT。Trizol提取總 RNA后按如下體系 RT：40 U/μl RNaseOUT 0.125 μl，10×RT Buffer 2.000 μl，10 mM dNTPmix 0.750 μl，1 μM miR RT primer 1.200 μl，200 U/μl MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.100 μl，80 ng/μl總RNA 2.000 μl，DEPC 處理水 13.825 μl。PCR 反應(yīng)體系：反應(yīng)獲得的模板 2.00 μl，2×Real-time PCR Master Mix 10.00 μl、5 μM miRNA specific primer set 0.36 μl，5 U/μl rTaq DNA polymerase 0.20 μl，25 μmol/L ROX 0.80 μl，DEPC 處 理 水 6.64 μl。MiR-30a的表達采用U6作為內(nèi)參對照。計算2－ΔΔCT為 miRNA 相對表達量。引物序列：18 s：FP：5′-ACCGCAGCTAGGAATAATGGA-3′，RP：5′-GC －CTCAGTTCCGAAAACCA-3′。ANP：FP：5′-GGGGGTAGGATTGACAGGAT-3′，RP：5′-CTCCAGGAGGGTATTCACCA-3′。β-MHC：FP：5′-CCTCGCAATATCAAGGGAAA-3′，RP：5′-TACAGGTGCATCAGCTCCAG-3′。U6-F：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，U6-R：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。

1.3 激光共聚焦 心肌細胞直接種植于培養(yǎng)孔中，用鬼筆環(huán)肽（fluorescent phallotoxins）Alexa FluorR555 Phalloidin與DAPI染色，LSM 710激光共聚焦顯微鏡攝片觀察，結(jié)果用image pro軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用PASW Statistics 18.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用±s表示，是否正態(tài)分布用Shapiro-Wilk檢驗。使用Levene′檢驗判斷是否方差齊性。兩組計量資料組間比較，若正態(tài)分布資料使用Student′s t檢驗。多樣本正態(tài)、方差齊性計量資料比較使用ANOVA。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ引起的心肌細胞miR-30a表達變化 與對照組（con組）比較，心肌細胞miR-30a表達量下調(diào)至刺激前的32.9%（P<0.05）。見圖1。

2.2 心肌細胞miR-30a的變化對AngⅡ引起的心肌細胞肥厚基因表達的影響 在AngⅡ刺激心肌細胞肥大的基礎(chǔ)上使心肌細胞過表達miR-30a mimics，miR-30a mimics組心肌細胞 ANP和 β-MHC表達分別是對照組的51.7%和53.5%（P<0.05）。在AngⅡ刺激心肌細胞肥大的基礎(chǔ)上使心肌細胞過表達 negative control或者 miR-30a inhibitors，miR-30a inhibitors組 ANP和 β-MHC 表達分別是negative control組的1.88倍和1.64倍（P<0.05）。見圖 2。

圖1 AngⅡ引起的心肌細胞miR-30a表達變化

圖2 miR-30a對心肌細胞肥厚相關(guān)基因表達的影響

2.3 激光共聚焦分析心肌細胞miR-30a的變化對AngⅡ引起的心肌細胞大小的影響 激光共聚焦檢測形態(tài)學(xué)的改變，結(jié)果顯示，AngⅡ刺激心肌細胞使心肌細胞面積增加至刺激前的2.95倍（P<0.05）。在AngⅡ刺激心肌細胞肥大的基礎(chǔ)上使心肌細胞過表達 negative control，或者 miR-30a mimics，或者miR-30a inhibitors，與 negative control組比較，miR-30a mimics組心肌細胞面積減少至57.8%（P<0.05），miR-30a inhibitors組心肌細胞面積增加1.50 倍。見圖 3、4。

圖3 AngⅡ引起的心肌細胞大小變化

圖4 MiR-30a對心肌細胞大小的影響

3 討論

MicroRNA（miRNA）是一類在生物進化過程中高度保守的非編碼微小RNA，是內(nèi)源性（≈22核苷酸）非編碼RNA分子，通過與靶基因mRNA的 3′UTR互補結(jié)合，降解目的mRNA或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)目的基因表達，導(dǎo)致降解或抑制翻譯，進而影響細胞或生物個體的生理病理狀態(tài)。MiRNA調(diào)控生物健康、疾病，包括心血管疾病。目前報道的microRNAs有1.8萬多個。

在發(fā)達國家，1%～2%的成人患心力衰竭，而在70歲以上人群，該比例高達10%以上[2]。20世紀90年代前，60%～70%的心力衰竭患者在診斷心力衰竭5年內(nèi)死亡。因心力衰竭住院的患者耗費了大量的醫(yī)療資源，患者生活質(zhì)量嚴重下降。近年來，經(jīng)過包括利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、β受體阻滯劑、醛固酮受體阻滯劑等藥物優(yōu)化治療和心臟再同步化治療（cardiac resynchronization therapy，CRT）等器械治療的綜合治療后，心衰患者預(yù)后較前改善，住院率減少，但仍不容樂觀。人類對心力衰竭發(fā)病機制的認識不斷深入，從20世紀40～60年代的心腎學(xué)說到70～80年代血流動力學(xué)說，再到90年代以來的心臟重構(gòu)學(xué)說。目前認為，心臟重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機制，因而對心臟重構(gòu)學(xué)說的研究不斷深入。在各種病理刺激下，心臟出現(xiàn)實質(zhì)和間質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，如心肌細胞肥大、心臟間質(zhì)纖維化等，稱為心臟重構(gòu)[3]。心臟肥厚是心臟重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)，對心臟肥厚機制的進一步深入探討可能為我們提供心力衰竭新的防治靶點。心肌細胞損傷和丟失在心臟肥厚和心臟重構(gòu)中起重要作用。目前，人們把眼光逐步放在細胞水平，通過修復(fù)細胞損傷的途徑來改善心臟重構(gòu)。關(guān)于miRNA調(diào)控心臟重構(gòu)的研究近年來有報道，miR-199b在心臟肥厚小鼠心肌組織中表達上調(diào)，抑制miR-199b的表達能逆轉(zhuǎn)小鼠的心肌細胞肥大和纖維化[4]。

正如其他miRNA一樣，近年來對miR-30的研究涉及廣泛。目前報道的人類和褐家鼠miR-30家族有 miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d和miR-30e六個亞型。每個亞型均能生成5p和3p兩個片段，其中miR-30c-1與miR-30c-2的5p片段相同。文獻中未明確注明的默認為5p片段，3p片段有時也可以標注“*”，如“hsa-miR-30a-3p”可寫作“hsa-miR-30a*”。MiR-30家族與腫瘤，以及神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病和脂肪生成、細胞衰老、藥物代謝、細胞分化有關(guān)[5-14]。MiR-30與循環(huán)系統(tǒng)疾病的研究亦有報道。一項研究[15]對6例胸主動脈夾層患者和6例年齡匹配的無主動脈疾病患者行主動脈組織microRNAs芯片檢測發(fā)現(xiàn)，18種microRNAs上調(diào)2倍以上，56種microRNAs下調(diào)。選擇其中7種microRNAs進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-30家族可能通過調(diào)控MAPK信號通路在胸主動脈夾層發(fā)生中起重要作用。

關(guān)于miR-30與心臟重構(gòu)的關(guān)系，偶有報道。Duisters等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-30家族在小鼠肥厚心臟和左室肥厚（LVH）患者的心臟活檢組織中顯著下調(diào)。MiR-30c調(diào)控結(jié)締組織生長因子（CTGF），在心肌基質(zhì)重構(gòu)中起作用，參與心臟重構(gòu)。一項研究[17]對miR-30在心臟重構(gòu)中的作用進行了探討，研究者不是采用傳統(tǒng)的壓力負荷所致心臟肥厚模型，而是酒精攝入。該研究顯示慢性酒精攝入導(dǎo)致小鼠心肌肥厚、收縮功能受損、自噬增強。酒精代謝物乙醛引起miR-30a下調(diào)，導(dǎo)致自噬過度是其中的機制之一。另一項研究也顯示，慢性酒精攝入導(dǎo)致小鼠肥厚心臟組織中miR-30a顯著下調(diào)[18]。慢性房顫除了電重構(gòu)之外，心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)也是導(dǎo)致房顫發(fā)生的基礎(chǔ)。Li等[19]快速起搏犬左上肺靜脈制造慢性房顫犬模型，其心房組織miR-30下調(diào)。MiR-30在慢性房顫結(jié)構(gòu)改變中起重要的作用。

Duisters等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-30家族在小鼠肥厚心臟和左心室肥厚患者的心臟活檢組織中顯著下調(diào)。我們通過體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞，予以AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥大的同時，心肌細胞miR-30a水平下調(diào)。我們使心肌細胞過表達miR-30a mimics后，能緩解心肌細胞肥厚基因的表達；抑制心肌細胞miR-30a的活性能增加心肌細胞肥厚基因的表達。接下來，我們進一步行形態(tài)學(xué)實驗驗證。

鬼筆環(huán)肽攜帶有熒光基團，能使心肌細胞骨架蛋白F-actinin染色，在激光共聚焦顯微鏡下可以顯示心肌細胞的輪廓，進而計算細胞的表面積大小[20]。我們使心肌細胞過表達miR-30a mimics后，能減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌自噬和心肌細胞形態(tài)學(xué)上的肥厚；抑制心肌細胞miR-30a的活性能加重AngⅡ誘導(dǎo)的心肌自噬和心肌細胞形態(tài)學(xué)上的肥厚。

綜上所述，miR-30a水平下調(diào)介導(dǎo)了AngⅡ引起的心肌肥厚。故我們提出的一條可能參與心肌肥厚的新通路：AngⅡ↑→miR-30a↓→心肌肥厚。

在心臟重構(gòu)的整個病理生理過程的不同階段，并不是總以心肌肥厚為主要特征表現(xiàn)，所以該通路不能盲目擴大到適合所有心臟重構(gòu)的過程。

本研究采用的心肌細胞部分為原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞，而與乳鼠心肌細胞相比，成年鼠心肌細胞更接近疾病發(fā)生的內(nèi)環(huán)境，所以，如果能在成年鼠心肌細胞上作研究，實驗設(shè)計將會更加嚴謹。另外，本研究僅僅在細胞層面論證了miR-30a下調(diào)介導(dǎo)了AngⅡ引起的心肌肥厚，有待進一步在動物體內(nèi)論證這一機制。

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Role of miR-30a on AngⅡ-induced myocardial hypertrophy

PAN Wei＊，ZHAO Juan，LUO Shao-jin，et al.＊Cardiovascular Department，Nanhai Hospital Affiliated to Southern Medical University，F(xiàn)oshan 528200，China

Objective To investigate whether miR-30a could mediate angiotensin Ⅱ（AngⅡ）-induced myocardial hypertrophy or not.Methods The neonatal cardiomyocytes were divided into control group and AngⅡ-induced group and relative expression of miR-30a and hypertrophy-related genes were analyzed in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes by real-time PCR.The neonatal cardiomyocytes were divided into control group and AngⅡ-induced group and influence of AngⅡon relative cell area in cardiomyocytes was evaluated by confocal microscopy.The neonatal cardiomyocytes were divided into control group（AngⅡ+NC），miR-30a-induced group（AngⅡ+miR-30a mimics）and miR-30a-inhibited group （AngⅡ+miR-30a mimics）.Influence of miR-30a on mRNA level of ANP and β-MHC was evaluated in hypertrophic cardiomyocytes.Results The expression of miR-30a in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes was only 32.9%of that in unstimulated cells.The expression of ANP and β-MHC was measured in AngⅡ induced hypertrophic cardiomyocytes，treatment with an miR-30a mimic decreased the expression of ANP and β-MHC by 48.3%and 46.5%，respectively，relative to the negative control.Conversely，in hypertrophic cardiomyocytes，treatment with an miR-30a inhibitor increased the expression of ANP and β-MHC by 1.88-and 1.64-fold，respectively，relative to the negative control.The morphological observations indicated that the surface area of hypertrophic cardiomyocytes was 2.95-fold that of untreated cells.Compared with hypertrophic cardiomyocytes treated with AngⅡ+negative control，the cell surface area decreased by 42.2%in cardiomyocytes treated with AngⅡ+miR-30a mimic，and increased 1.50-fold in cardiomyocytes treated with AngⅡ+miR-30a inhibitor.Conclusion Down-regulation of miR-30a mediates AngⅡ-induced myocardial hypertrophy.

MicroRNA-30a； AngiotensinⅡ； Myocardial hypertrophy

2014年廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項（項目編號：A2014712）

528200 廣東省佛山市，南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院心內(nèi)科（潘偉、羅韶金、楊澤福、黃景文），超聲科（趙娟）

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．06．023

Q95-33；R542

A

1672-5301（2016）06-0567-05

2015-12-24）