藍(lán)莓花色苷對過氧化氫所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

李亞巍,昌　盛,梁承武,王黎明,金　瑛

(吉林醫(yī)藥學(xué)院,藥物化學(xué)教研室,吉林吉林 132013)

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藍(lán)莓花色苷對過氧化氫所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

李亞巍,昌盛,梁承武,王黎明,金瑛*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院,藥物化學(xué)教研室,吉林吉林 132013)

目的:觀察藍(lán)莓花色苷對過氧化氫(H2O2)所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機制。方法:人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞EVC-304經(jīng)不同濃度藍(lán)莓花色苷(10、20、40 μg·mL-1)預(yù)培養(yǎng)24 h后,加入100 μmol/L H2O2再進(jìn)行培養(yǎng)12 h。MTT法檢測細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞儀檢測EVC-304細(xì)胞凋亡的變化,Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)激活型Caspase-3、細(xì)胞色素C(Cyto c)、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:同正常組相比,H2O2損傷組細(xì)胞存活率顯著降低(p<0.01),細(xì)胞凋亡率顯著升高(p<0.01),激活型Caspase-3、細(xì)胞質(zhì)中Cyto c表達(dá)水平,Bax/Bcl-2比值升高(p<0.01)。與H2O2損傷組相比,20 μg·mL-1和40 μg·mL-1藍(lán)莓花色苷處理組細(xì)胞存活率明顯升高(p<0.01),凋亡細(xì)胞率明顯下降(p<0.01),細(xì)胞內(nèi)激活型Caspase-3,Cyto c表達(dá),Bax/Bcl-2比值下降(p<0.01)。結(jié)論:藍(lán)莓花色苷對H2O2所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用,其機制可能與保護(hù)線粒體功能相關(guān)。

藍(lán)莓花色苷,細(xì)胞凋亡,過氧化氫,線粒體損傷

藍(lán)莓又名篤斯越橘,屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.),小果類果樹品種之一,廣泛分布于世界各地?；ㄉ帐撬{(lán)莓果實中最重要的次生代謝產(chǎn)物[1-2]。藍(lán)莓花色苷類是一種天然的抗氧化劑,具有很強的體外抗氧化活性,具有抗菌和抗糖尿病、改善大腦記憶、減少人體膽固醇積累、促進(jìn)視黃素再合成等功效,且對人體無任何毒副作用,在食品加工業(yè)和提高人類健康方面具有重要作用[3-4]。歐美國家及日本對藍(lán)莓花色苷的研究已多年,但我國藍(lán)莓花色苷研究剛剛起步[5-6],對藍(lán)莓花色苷的研究還不夠深入,對藍(lán)莓花色苷的抗氧化研究主要通過化學(xué)模擬方法評價其抗氧化效果,其作用機制還不淸楚。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)在血管疾病發(fā)展早期起著重要的作用,ROS引起的氧化損傷會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白以及酶的損傷,引起細(xì)胞功能受損和發(fā)生嚴(yán)重的凋亡。作為最重要的ROS成員之一的H2O2能輕易地穿過細(xì)胞膜損傷鄰近的組織,被廣泛的用于體外模型中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在心血管疾病的發(fā)病機制中具有重要作用,因此研究抗氧化劑和自由基清除劑可以部分逆轉(zhuǎn)凋亡過程,可對治療心血管疾病提供有益的干預(yù)[7]。本研究采用H2O2處理血管內(nèi)皮細(xì)胞,模擬氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,觀察藍(lán)莓花色苷對H2O2所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用的保護(hù)作用及其機制進(jìn)行研究,旨在為藍(lán)莓資源的綜合利用和開發(fā)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

長白山野生藍(lán)莓8月份采收,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株EVC-304由吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)教研室保存;小牛血清杭州四季青公司;DMEM高糖培養(yǎng)液美國Gibco公司;Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyto c抗體美國Santa Cruza公司;HRP-Goatanti-RabbitIg中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL發(fā)光液上海碧云天生物技術(shù)研究所;硝酸纖維素膜美國密理博。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

680型全自動酶標(biāo)儀美國Bio Rad;超凈工作臺(DL-CJ-1N)北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-18AIC)日本SANYO;倒置顯微鏡(CKX41-A32PH UIS2)日本奧林巴斯;高速臺式冷凍離心機(3-30K)德國SIGMA;Muse智能觸控細(xì)胞分析儀德國默克密理博公司。

1.2實驗方法

1.2.1藍(lán)莓花色苷的制備和含量測定花色苷是由花青素和糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類生物活性物質(zhì),藍(lán)莓花色苷的提取詳見參考文獻(xiàn)[8]。從冰箱取出冷凍保存的長白山篤斯越橘,稱重20 g,研磨至勻漿狀,按比例加入,用95%乙醇-1.5 mol/L HCl(85∶15)作為溶劑進(jìn)行提取,浸提3次,每次30 min,用真空抽濾去殘渣,花色苷提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮,含量測定采用pH示差法[9]。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)將EVC-304細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶底,采用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.3MTT實驗檢測細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL,接種于96孔板,每孔200 μL,培養(yǎng)24 h后隨機分為正常對照組、H2O2損傷模型組,花色苷防護(hù)組,每組設(shè)5個復(fù)孔。預(yù)先加入不同終濃度的藍(lán)莓花色苷(10、20、40 μg·mL-1)處理細(xì)胞24 h后,將濃度為100 μmol/L的H2O2加入損傷模型組和藍(lán)莓花色苷各組,每孔100 μL,處理12h。棄培養(yǎng)液,每孔加入100 μL新配制的0.5 mg·L-1MTT溶液,37 ℃孵育4 h,小心吸棄孔內(nèi)液體,每孔再加入DMSO 150 μL,振蕩10 min,選擇490 nm波長處在酶標(biāo)儀檢測各孔光吸收(A)值,按公式計算細(xì)胞活力抑制率。

細(xì)胞活力抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期EVC-304細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板過夜,按照1.2.3方法分組處理后,PBS洗滌細(xì)胞1次,0.25%胰酶消化,1000 r/min離心5 min,每組收集細(xì)胞約1×105個,棄去培養(yǎng)液,加100 μL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。按照試劑盒說明書,每組加入100 μL Muse細(xì)胞分析儀凋亡試劑盒染料,Muse細(xì)胞分析儀檢測心肌細(xì)胞凋亡。

1.2.5免疫印跡實驗細(xì)胞按1.2.3方法分組處理后,取各組EVC-304細(xì)胞,0.25%胰酶消化,4 ℃離心收集細(xì)胞1000 r/min離心10 min,以PBS洗2次,用PIPA細(xì)胞裂解液置冰浴裂解,4 ℃、12000 r/min離心5 min,收集上清。經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量后,取等量樣品以12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h后,Bax、Bcl-2、Cyto c和Casepase-3抗體按照濃度1∶1000稀釋,孵育過夜,再以過氧化酶標(biāo)記的二抗封閉液孵育1 h,用ECL顯影,化學(xué)發(fā)光成像系檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1藍(lán)莓花色苷抑制H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力降低

如圖1所示,與正常對照組相比,H2O2處理組EVC-304細(xì)胞活力顯著降低(p<0.01)。而經(jīng)過不同濃度藍(lán)莓花色苷預(yù)處理組的EVC-304細(xì)胞,其增殖活性呈現(xiàn)升高趨勢,且隨著藍(lán)莓花色苷濃度的升高呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(圖1)。同損傷組相比,20 μg·mL-1和40 μg·mL-1花色苷預(yù)處理組細(xì)胞的存活率顯著升高(p<0.01),說明藍(lán)莓花色苷對H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。10 μg/mL防護(hù)組藥物作用不明顯,后續(xù)沒有進(jìn)行此濃度的實驗研究。

圖1　藍(lán)莓花色苷對H2O2誘導(dǎo)EVC-304細(xì)胞活性降低的影響Fig.1　Effect of Blueberry anthocyanins on hydrogen peroxide-induced injury of EVC-304 cells cells activity注:##p<0.01,與正常對照組相比;**p<0.01與模型組相比,圖2、圖3同。

2.2藍(lán)莓花色苷對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞凋亡的影響

100 μmol/L H2O2誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯,細(xì)胞凋亡率為33.72%±2.5%,與對照組相比4.45%±1.29%,顯著升高(p<0.01)。而20 μg·mL-1和40 μg·mL-1藍(lán)莓花色苷預(yù)處理組的EVC-304細(xì)胞凋亡率分別為25.38%±3.79%和13.48%±1.57%,同H2O2損傷組相比,明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。說明藍(lán)莓花色苷對H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有抑制作用(圖2)。

圖2　藍(lán)莓花色苷對H2O2誘導(dǎo)EVC-304細(xì)胞凋亡的影響Fig.2　Effect of Blueberry anthocyanins on hydrogenperoxide-induced apoptosis of EVC-304 cells注：A：對照組；B：模型組；C：20 μg·mL-1花色苷組；D:40 μg·mL-1花色苷組。

2.3Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)結(jié)果

如圖3顯示,經(jīng)過100 μmol/L的H2O2作用1 h后,EVC-304細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2蛋白比例、激活型Caspase-3和細(xì)胞質(zhì)中Cyto c蛋白表達(dá)同對照組相比明顯升高(p<0.01)。而同H2O2損傷組相比,經(jīng)過不同濃度藍(lán)莓花苷預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2蛋白比例、激活型Caspase-3和細(xì)胞質(zhì)中Cyto c蛋白表達(dá)成呈下降趨勢(p<0.01),且隨著藍(lán)莓花色苷濃度的增加呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(圖3)。

圖3　藍(lán)莓花色苷對H2O2誘導(dǎo)EVC-304細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3　Effects of Buleberry anthocyanidin on the eprotein express in EVC-304 cell injured by H2O2注:1. 對照組;2. H2O2損傷組;3. 20 μg·mL-1藍(lán)莓花色苷防護(hù)組;4. 40 μg·mL-1藍(lán)莓花色苷防護(hù)組。

3　結(jié)論與討論

目前許多研究者發(fā)現(xiàn)自由基是引起疾病的新致病因,它與生物膜中不飽和脂肪酸的弱鍵和不飽和鍵均具有高度的親和力,而且能夠進(jìn)一步啟動脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)鏈,進(jìn)而導(dǎo)致酶、DNA等結(jié)構(gòu)和功能的改變,從而引起動脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生[10-11]。通過食用具有抗氧化能力的食物可以有效防止多種疾病的發(fā)生。近年來,學(xué)者對于各種花色苷給予了很大的關(guān)注。藍(lán)莓花色苷具有很強的抗氧化活性,是一種非常好的氧自由基清除劑,但是關(guān)于藍(lán)莓花色苷對氧化應(yīng)激所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷研究相對較少[12]。

本研究應(yīng)用H2O2處理EVC-304細(xì)胞,模擬氧化應(yīng)激條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。實驗結(jié)果表明,預(yù)先加入藍(lán)莓花色苷能夠降低H2O2對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,提高細(xì)胞存活率,降低細(xì)胞凋亡率,說明藍(lán)莓花色苷對氧化應(yīng)激所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起著樞紐作用,線粒體膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡中最早發(fā)生的事件[13-14]。線粒體在細(xì)胞存亡機制中的作用越來越引起人們的重視,一方面是由于線粒體膜間隙的細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)后觸發(fā)caspase級聯(lián),導(dǎo)致細(xì)胞死亡。另一方面,線粒體外膜上的Bcl-2蛋白家族調(diào)控細(xì)胞色素C自線粒體的釋放。實驗結(jié)果顯示,藍(lán)莓花色苷能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3的活化,并可抑制細(xì)胞色素C的釋放,還可增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),減少促凋亡蛋白Bax 的表達(dá),從而發(fā)揮抗凋亡作用。

綜上所述,藍(lán)莓花色苷可以提高氧化損傷所致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性,并顯示出血較強的抗凋亡作用,其機制可能通過保護(hù)線粒體功能相關(guān)。本實驗從細(xì)胞水平上對藍(lán)莓花色苷的抗氧化作用進(jìn)行研究,為其今后在心血管疾病治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),但是具體機制仍需要進(jìn)一步的深入研究。

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Protective effects of blueberry anthocyanins on hydrogen peroxide-induced injury of vascular endothelial cells

LI Ya-wei,CHANG Sheng,LIANG Cheng-wu,WANG Li-ming,JIN Ying*

(Department of pharmaceutical chemistry,Jilin medical college,Jilin 132013,China)

Objective:To investigate the protective effects of blueberry anthocyanins on hydrogen peroxide(H2O2)-induced apoptosis of vascular endothelial cells. Methods:The EVC-304 cells cultured in logarithmic growth phase were incubated with 100 μmol/L H2O2for another 12 h after pretreatment with blueberry anthocyanins(10,20,and 40 μg·mL-1)for 24 h. Cell viability was determined by MTT assay,the change of cell apoptosis were measured with cytoanalyzer,and the expression levels of Cleaved Caspase-3,Cyto c,Bax,and Bcl-2 were detected by Western blotting. Results:Compared with the normal control group,the survival rate of H2O2-treated cells was decreased and the apoptosis ratio was increased significantly(p<0.01),the proportion of cleaved Caspase-3,Cytoc and Bax/Bcl-2 was increased(p<0.01). Compared with H2O2-treated group,the survival rate of cells in blueberry anthocyanins-pretreated groups was increased significantly(p<0.01),the apoptosis rate was decreased significantly(p<0.01).The expression of intracellular cleaved caspase-3,Cyto c and Bax/Bcl-2 was decreased(p<0.01). Conclusion:Blueberry anthocyanin had protective effect on hydrogen peroxide-induced vascular endothelial cells apoptosis and the possible mechanism may be associated with protection the function of mitochondrion.

blueberry anthocyanins;apoptosis;hydrogen peroxide;mitochondrion injuries

2015-12-10

李亞巍(1984- )，女，碩士, 講師，研究方向：藥物化學(xué)，E-mail:jlmpclyw@163.com。

金瑛(1973- )，女，博士，教授，研究方向：天然藥物有效成份的研究，E-mail：lyw135@163.com。

國家自然科學(xué)基金(21102055)資助項目。

TS201.2

A

1002-0306(2016)11-0338-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.061