響應(yīng)面法優(yōu)化L-抗壞血酸油酸酯合成及性能研究

王靈利,劉國琴,*,曹劉霞

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510641;2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450001)

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響應(yīng)面法優(yōu)化L-抗壞血酸油酸酯合成及性能研究

王靈利1,劉國琴1,*,曹劉霞2

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510641;2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450001)

針對目前市場上L-抗壞血酸脂肪酸酯種類單一、L-抗壞血酸飽和脂肪酸酯在油脂中溶解的不完全性等問題,探究高脂溶性L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯的合成方法尤為重要。本文以叔戊醇為溶劑,利用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化L-抗壞血酸油酸酯(L-AO)的合成工藝,對分離提純后的L-AO進行結(jié)構(gòu)表征,然后考察其脂溶性和在油脂中的抗氧化效果,并與L-抗壞血酸棕櫚酸酯(L-AP)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)進行比較。結(jié)果表明,在最佳工藝條件即L-抗壞血酸(L-A)與油酸摩爾比3.67∶1,反應(yīng)溫度50.98 ℃,脂肪酶添加量為5.13%,反應(yīng)時間24 h,分子篩添加量為60 mg/mL,產(chǎn)品得率為53.29%。核磁表征結(jié)果證實油酸和L-抗壞血酸發(fā)生酯化反應(yīng)生成L-抗壞血酸-6-油酸酯。其脂溶性高于L-AP,在油脂中的抗氧化效果依次為L-AO>TBHQ>L-AP>BHT。因此,L-抗壞血酸油酸酯是一種脂溶性良好的新型抗氧化劑,可嘗試應(yīng)用于油脂及油基食品的生產(chǎn)。

L-抗壞血酸油酸酯,脂肪酶,響應(yīng)面法,脂溶性,抗氧化性

L-抗壞血酸脂肪酸酯是一種新型的綠色抗氧化劑,根據(jù)脂肪酸的飽和度,可分為L-抗壞血酸脂不飽和肪酸酯(L-AUFAE)和L-抗壞血酸飽和脂肪酸酯(L-ASFAE)兩類,目前以對L-ASFAE的研究較為廣泛。Zhang Dong-hao[1]以L-抗壞血酸(L-A)和月桂酸為原料,以二甲基亞砜-丙酮的混合物為溶劑探究了底物摩爾比、分子篩及酶添加量對L-抗壞血酸月桂酸酯得率的影響。王軍凱[2]以L-A和棕櫚酸甲酯為原料,利用響應(yīng)面優(yōu)化酶法合成L-抗壞血酸棕櫚酸酯(L-ascorbyl palmitate,L-AP),并研究了L-抗壞血酸脂肪酸酯的抗氧化性。目前,L-AP已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),作為抗氧化劑和乳化劑應(yīng)用于食品和化妝品中[3]。然而,L-AP的脂溶性、營養(yǎng)性和抗氧化性不及L-AUFAE。因此,L-AUFAE成為近幾年的研究熱點[4-5]。

L-抗壞血酸油酸酯(L-ascorbate oleate,L-AO)是最重要的L-AUFAE之一。由于不飽和脂肪酸穩(wěn)定性差、L-AUFAE純化過程中損失嚴重及不飽和脂肪酸中的雙鍵可能與L-抗壞血酸中的羥基及脂肪酸中的羧基反應(yīng)產(chǎn)生副產(chǎn)物,產(chǎn)率較低[6],同時生產(chǎn)成本較高,故L-AO的研究進程相對緩慢。宋秋紅[7]、Song[8]、Moreno-Perez[9]等采用單因素法優(yōu)化了L-AO酶法合成工藝,其得出的最優(yōu)工藝未考察因素間的交互作用。應(yīng)艷杰[10]利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法優(yōu)化酶法合成工藝,但只考察了反應(yīng)溫度、油酸量、脂肪酶添加量對反應(yīng)的影響,優(yōu)化出的工藝條件具有局限性。同時,對L-AO的性能評價局限在理論分析,缺乏有力的數(shù)據(jù)支撐。為了提供更準確可靠的酶法合成工藝參數(shù)及性能評價,本文在前人的基礎(chǔ)上,綜合考察影響L-AO合成的因素,以叔戊醇為有機溶劑,lipozyme 435固定化酶為催化劑,采用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化L-AO的合成工藝,探究L-AO在油脂中的溶解性和抗氧化性,并與L-AP、TBHQ和BHT進行比較。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

L-抗壞血酸(>99%)、油酸(90%)購自上海國藥集團;花生油、菜籽油、葵花籽油和大豆油購自天津龍威糧油工業(yè)有限公司;TBHQ、BHT購自上海藍平實業(yè)有限公司;Lipozyme 435脂肪酶購自諾維信(中國)生物科技有限公司;溴化鉀、油酸、3?分子篩、叔戊醇等均為分析純購自廣州化學(xué)試劑廠。

P680型高效液相色譜儀美國Dionex公司;ELSD-2000ES蒸發(fā)光散射檢測器美國Agilent公司;Rancimat617型酸敗儀瑞士Metrohm公司;DFZ-6050型恒溫箱上海精密科學(xué)儀器有限公司;AVANCE III HD 300型超導(dǎo)核磁共振波譜儀德國Bruker公司。

1.2實驗方法

1.2.1L-AO的合成在棕色反應(yīng)瓶中,加入一定量的油酸、L-AO及脫水處理過的叔戊醇,恒溫條件下攪拌30 min,再加入一定量的脂肪酶,反應(yīng)預(yù)定的時間后向其中加入一定量經(jīng)過活化的分子篩。反應(yīng)結(jié)束后,過濾除去脂肪酶、分子篩等,濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。所得混合物與一定量的乙酸乙酯混合,再用一定量的蒸餾水洗滌三次,除去L-A,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯,用氯仿萃取結(jié)晶,進一步分離純化,再經(jīng)冷凍干燥得到產(chǎn)品。

1.2.2L-AO的NMR分析將分離純化后的L-AO溶解于DMSO-d6,在25 ℃下進行NMR分析,1H NMR和13C NMR的頻率分別為300.18、75.48 MHZ,分別以δ=2.50 和δ=39.51殘余溶劑峰為內(nèi)標,掃描次數(shù)為8000次,掃描間隔時間為2 s。

1.2.3L-AO的HPLC分析L-AO含量參照文獻[11]測定。色譜柱:Supelcosil C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),流動相:甲醇/水=90/10,v/v,流速為1.0 mL/min,蒸發(fā)光散射檢測器,檢測器溫度為50 ℃,氮氣速度1.3 mL/min。樣品濾去酶和分子篩后,用流動相稀釋至100 μL,取20 μL進樣。L-AO的得率(%)根據(jù)L-A的消耗量計算。

1.2.4L-AO合成的單因素實驗以L-AO得率為指標,考察溫度(40、45、50、55、60 ℃)、時間(12、16、20、24、28 h)、底物摩爾比(5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1)、酶添加量(2%、3%、4%、5%、6%)、分子篩添加量(40、60、80、100、120 mg/mL)等五個因素對目標產(chǎn)物得率的影響。

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化L-AO合成工藝以L-AO得率為實驗指標,分析單因素實驗結(jié)果,選擇反應(yīng)溫度、脂肪酶添加量和底物摩爾比三個影響較大的因素,設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗。因素水平設(shè)計如表1所示。

表1　響應(yīng)面實驗的因素水平表

1.2.6L-AO的脂溶性測定稱取5 mLL-AO和L-AP于三角瓶中,不斷攪拌,分別逐滴加入花生油、菜籽油、葵花籽油和大豆油,待L-AO和L-AP全部溶解,24 h后用硅鉬藍分光光度計測定其溶解度。

1.2.7Rancimat酸敗儀測定L-AO在油脂中的抗氧化效果將不同的抗氧化劑配成不同的濃度,添加到油脂樣品中,110 ℃條件下,用Rancimat儀,以油脂樣品的氧化誘導(dǎo)時間為指標,評價各抗氧化劑的抗氧化效果。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗操作重復(fù)三次,取平均值。采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,利用Design-Expert 8.0軟件進行對響應(yīng)面的實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與分析

2.1L-AO的結(jié)構(gòu)鑒定

對樣品進行NMR分析,產(chǎn)物經(jīng)1H NMR和13C NMR鑒定為L-抗壞血酸-6-油酸酯,這可能是因為6位羥基為一級羥基,相對5位羥基位阻較小,易酯化。其核磁數(shù)據(jù)分析如下。

圖1　合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)圖Fig.1　The structure of product

1H NMR(DMSO-d6):11.07(1H,br,C2′-OH);8.36(1H,br,C3′-OH);5.31(2H,m,H-9和H-10);4.65(1H,d,3JH4′-H5′=1.58,H-4′);4.08(1H,dd,2JH6′-H6′=10,44,3JH5′-H6′=8.20,H-6′);4.04(1H,dd,2JH6′-H6′=10.44,3JH5′-H6′=5.07,H-6′);3.96(1H,br,H-5′);3.37(1H,br,C5′-OH);2.30(2H,t,3JH2-H3=7.40,H-2);1.97(4H,m,H-8 i H-11);1.53(2H,m,H-3);1.40～1.14(20H,H-4,H-5,H-6,H-7,H-12,H-13,H-14,H-15,H-16,H-17);0.85(3H,t,3JH17-H18=6.62,H-18)。

13C NMR(DMSO-d6):172.62(C-1);170.33(C-1′);152.10(C-3′);129.58(C-10或C-9);129.55(C-9或C-10);118.24(C-2′);75.01(C-4′);65.53(C-5′);64.42(C-6′);33.40(C-2);31.32(C-16);29.14(×2);28.88;28.64;28.53(×2);28.50(×2);26.60(×2,C-8和C-11);24.38(C-3);22.12(C-17);13.89(C-18)。

2.2L-AO合成的單因素實驗

2.2.1反應(yīng)時間對L-AO合成的影響由圖2可知,隨著時間的延長,L-AO得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在24 h時達到最大值,為46.31%。因為L-AO的合成是一個可逆反應(yīng),當反應(yīng)達到平衡,繼續(xù)延長時間,反應(yīng)可能像逆反應(yīng)方向進行;另一方面,反應(yīng)時間過長也可能導(dǎo)致酶部分失活而影響反應(yīng)得率。因此,24 h是相對合理的反應(yīng)時間。

圖2　反應(yīng)時間對L-AO得率的影響Fig.2　Influence of reaction time on the yield of L-AO

2.2.2溫度對L-AO合成的影響從圖3可知,隨著溫度的升高,L-AO得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在50 ℃時達到最大值,為46.31%。這是由于溫度會影響脂肪酶的活性,隨著溫度的升高,酶活性增強,反應(yīng)速率加快,但過高的溫度會使脂肪酶部分失活,而且高溫也可能導(dǎo)致L-A和L-AO的分解,從而降低了L-AO得率。因此,50 ℃為比較理想的反應(yīng)溫度。

圖3　反應(yīng)溫度對L-AO得率的影響Fig.3　Influence of reaction temperature on the yield of L-AO

2.2.3脂肪酶添加量對L-AO合成的影響由圖4可知,隨著酶添加量的增加,L-AO得率隨著酶添加量的增加而增加,當酶添加量為5%時,達到最大值49.34%。當繼續(xù)添加酶時,得率趨于穩(wěn)定。這可能是由于增加酶量有利于增大酶與底物的接觸面積,使反應(yīng)完全。但過量的酶不但不能提高反應(yīng)的得率,反而可能增加副反應(yīng)的發(fā)生,同時增加生產(chǎn)成本。所以綜合理化指標和生產(chǎn)成本考慮,選取5%為合適的脂肪酶添加量。

圖4　脂肪酶添加量對L-AO得率的影響Fig.4　Influence of lipase amount on the yield of L-AO

2.2.4底物摩爾比對L-AO合成的影響由圖5可知,隨著底物摩爾比的增加,L-AO的得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在3∶1時達到最大值,為44.82%。這是因為增加底物的量有利于反應(yīng)向生成L-AO的方向進行,所以隨著底物摩爾比的增加,得率增加。但當繼續(xù)增加油酸的量,會增加反應(yīng)體系的傳質(zhì)阻力,影響反應(yīng)的進行。綜合考慮,選取3∶1為合適的底物摩爾比。

圖5　底物摩爾比對L-AO得率的影響Fig.5　Influence of substrate molar ratio on the yield of L-AO注:OA表示油酸,L-A表示L-抗壞血酸。

2.2.5分子篩添加量對L-AO合成的影響由圖6可知,隨著分子篩添加量的增加,L-AO得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,當分子篩添加量為60 mg/mL時,達到最大值45.34%。這是因為反應(yīng)過程中產(chǎn)生的水分會在酶的活性部位形成水簇,降低酶的活性,影響反應(yīng)得率。但保持酶活性位點的微水環(huán)境也是必須的,當分子篩過量時,可能會奪去脂肪酶必須的水分,使酶活性降低。因此,60 mg/mL是較為合適的分子篩添加量。

表3　回歸方程的方差分析

圖6　分子篩添加量對L-AO得率的影響Fig.6　Influence of molecular sieve amount on the yield of L-AO

2.3L-AO合成工藝的優(yōu)化

2.3.1回歸模型的建立在單因素實驗的基礎(chǔ)上,我們篩選出反應(yīng)溫度(A)、脂肪酶添加量(B)、底物摩爾比(C)三個影響較大的因素為自變量,以L-AO的得率為響應(yīng)值。Central Composite的實驗設(shè)計原理,確定L-AO合成的最佳工藝方案。響應(yīng)面的實驗方案和結(jié)果如表2所示。

表2　響應(yīng)面設(shè)計方案及實驗結(jié)果

圖7　L-AO得率的響應(yīng)曲面圖Fig.7　Response surface diagram of the yield of L-AO

2.3.2回歸方程方差分析利用Design-Expert 8.0對表2中的實驗結(jié)果進行多元回歸擬合,L-AO的二次多項回歸模型為:

Y=49.73+2.89A+2.08B+9.43C-0.24AB-0.72AC-1.27BC-6.07A2-4.47B2-6.85C2

式(1)

對20個實驗點的響應(yīng)值進行回歸分析,方程的方差分析如表3所示。從表3可知,所建響應(yīng)面回歸模型p<0.0001,說明其極為顯著。一次項A、B、C顯著(p<0.05)其中底物摩爾比對L-AO的得率影響最大。二次項A2、B2、C2對響應(yīng)值的影響也是顯著的(p<0.05)。交互效應(yīng)AB不顯著(p>0.05),AC、BC顯著(p<0.05)。失擬項p值為0.0929>0.05,不顯著,表明該模型擬合程度良好,誤差小,可以用來分析和預(yù)測L-AO的合成結(jié)果。

2.3.3響應(yīng)面圖分析圖7是由多元回歸方程(1)擬合的響應(yīng)面立體圖和等高線圖,由此可以對反應(yīng)溫度(A)、脂肪酶添加量(B)、底物摩爾比(C)三個因素中任意兩個的交互效應(yīng)進行分析,從立體圖可以看出在所選的因素水平范圍內(nèi)存在極值點,從等高線圖可以看出任意兩個因素的交互效應(yīng)是否顯著。再結(jié)合方差分析結(jié)果,可以得出A、B、C三個因素對L-AO得率影響的大小依次是:C、A、B。

利用Design-Expert 8.0優(yōu)化L-AO合成工藝,得出L-AO得率的最佳合成工藝條件:底物摩爾比3.67∶1,反應(yīng)溫度50.98 ℃,脂肪酶添加量為5.13%,產(chǎn)品得率53.29%。

2.3.4驗證實驗為驗證模型的可靠性,采用優(yōu)化條件進行驗證實驗。做三次重復(fù)實驗,得到L-AO得率為52.60%±1.05%,與預(yù)測值53.29%±0.76%相差0.69%。因此,可以用此條件指導(dǎo)L-AO的合成。

2.4L-AO的脂溶性

將L-AO和L-AP分別添加到不同的植物油中,24 h后測其溶解度,結(jié)果如表4所示。

表4　L-AO和L-AP的在不同植物油中的溶解度

從表4可以看出,L-AO在油中的溶解度明顯高于L-AP,尤其是在花生油和菜籽油中。這說明,在L-A上引入含有雙鍵的不飽和脂肪酸能改善L-A在油脂中的溶解性能,擴大其在非水相體系中的應(yīng)用。

2.5L-AO的抗氧化效果

分別取植物油重0.005%、0.01%、0.015%、0.02%的L-AO、L-AP、TBHQ、BHT加入大豆油樣品中,以氧化誘導(dǎo)時間為指標,用Rancimat酸敗儀研究各抗氧化劑在大豆油中的抗氧化效果。結(jié)果如圖8所示。

圖8　添加不同抗氧化劑的大豆油氧化誘導(dǎo)時間的比較Fig.8　Comparison of induction time of soybean oil containing different antioxidants

誘導(dǎo)時間越長,油脂的氧化程度越小,說明物質(zhì)的抗氧化能力越強。從圖10可知,四種抗氧化劑的氧化誘導(dǎo)時間隨著抗氧化劑添加量的增大而延長,在相同的抗氧化劑添加量,誘導(dǎo)時間從長到短依次為:L-AO、TBHQ、L-AP、BHT,說明四種抗氧化劑在油脂中的抗氧化效果是:L-AO>TBHQ>L-AP>BHT,此結(jié)果與Reyes-Duarte[12]、Viklund[6]的結(jié)果相一致。

3　結(jié)論

采用單因素和響應(yīng)面的方法確定了L-AO合成的最佳工藝為底物摩爾比3.67∶1,反應(yīng)溫度50.98 ℃,脂肪酶添加量為5.13%,反應(yīng)時間為24 h,分子篩添加量為60 mg/mL。此時L-AO得率為53.29%,與實測值52.60%相近,驗證了其可行性。

L-AO在不同油脂中的溶解性明顯高于L-A和L-AP,彌補了L-AP在油脂中溶解不完全的缺陷。

用Rancimat酸敗儀法的實驗結(jié)果表明L-AO的抗氧化效果顯著高于TBHQ、L-AP 和BHT,可作為抗氧化劑應(yīng)用于油脂生產(chǎn)中。

[1]Zhang D H,Li C,Xie L L,et al. Enzymatic Synthesis of

L-Ascorbyl Laurate in DMSO-Acetone Mixed Solvent[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research,2013,52(34):11875-11879.

[2]王軍凱. 酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯及其抗氧化性研究[D]. 武漢：華中科技大學(xué),2011.

[3]Karmee,S K. Lipase catalyzed synthesis of ester-based surfactants from biomass derivatives[J]. Biofuels Bioproducts & Biorefining-Biofpr,2008,2(2):144-154.

[4]Stojanovic M,Velickovic D,Dimitrijevic A,et al. Lipase-Catalyzed Synthesis of Ascorbyl Oleate in Acetone:Optimization of Reaction Conditions and Lipase Reusability[J]. Journal of Oleo Science,2013,62(8):591-603.

[5]Song Q X,Zhao Y,Xu W Q,et al. Enzymatic synthesis of L-ascorbyl linoleate in organic media[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering,2006,28(4):211-215.

[6]Viklund F,Alander J,Hult K. Antioxidative properties and enzymatic synthesis of ascorbyl FA esters[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society,2003,80(8):795-799.

[7]宋秋紅,王熙,田平芳. 酶催化合成維生素C脂肪酸酯的反應(yīng)條件優(yōu)化[J]. 化京化工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2009,36(6):77-81.

[8]Song Q-X,Wei D-Z. Study of Vitamin C ester synthesis by immobilized lipase from Candida sp[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2002,18(4-6):261-266.

[9]Moreno-Perez S,Filice M,Guisan J M,et al. Synthesis of ascorbyl oleate by transesterification of olive oil with ascorbic acid in polar organic media catalyzed by immobilized lipases[J]. Chemistry and Physics of Lipids,2013,174:48-54.

[10]應(yīng)艷杰,邵平,何晉浙,等. 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化非水相脂肪酶催化合成抗壞血酸油酸酯的條件研究[J]. 生物數(shù)學(xué)學(xué)報,2009,24(2):293-298.

[11]Adamczak M,Bornscheuer U T. Improving ascorbyl oleate synthesis catalyzed by Candida antarctica lipase B in ionic liquids and water activity control by salt hydrates[J]. Process Biochemistry,2009,44(3):257-261.

[12]Reyes-Duarte D,Lopez-Cortes N,Torres P,et al. Synthesis and Properties of Ascorbyl Esters Catalyzed by Lipozyme TL IM using Triglycerides as Acyl Donors[J]. Journal of the American Oil Chemists Society,2011,88(1):57-64.

Optimization ofL-ascorbate oleate production using response surface methodology and its properties

WANG Ling-li1,LIU Guo-qin1,*,CAO Liu-xia2

(1.College of Food Science and Technology,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Grain College,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

L-ascorbate fatty acid esters is hydrophobic antioxidant,which is used widely in the food,cosmetic and phamaceutical fields. In order to solve the present problems that the types ofL-ascorbate fatty acid esters in the market are single,L-ascorbate saturated fatty acid esters are not completely soluble in fats and oils andL-ascorbate unsaturated fatty acid esters are expensive,the synthesis method of highly fat-solubleL-ascorbate unsaturated fatty acid esters is particularly imperative. The objective of this study was to synthesizeL-ascorbate oleate(L-AO). Oleate acid was used as acyl donors in presence of immobilized lipases and t-amyl alcohol as organic solvent to obationedL-AO,the preparation process ofL-AO was optimized via single factors test and response surface test,and the preparedL-AO was characterized by infrared spectroscopy(IR)and nuclear magnetic resonance(NMR),and then its fat solubility and anti-oxygenation were analyzed and compared withL-ascorbyl palmitate(L-AP),tertiary butylhydroquinone(TBHQ)and butylated Hydroxytoluene(BHT). The results showed that under the optimal conditions,namely substrates molar ratio(oleic acid toL-ascorbic)of 3.67∶1,a reaction temperature of 50.98 ℃,a lipase amount of 5.13%,a reaction time of 24 h,and a molecular sieve amount of 60 mg/mL,the yield ofL-AO was 53.29%,which was close to the predicted value(52.60%),indicating that the model was suitable for the preparation ofL-AO. In addition,NMR confirmed the form of 6-O-L-ascorbyl oleate. the fat solubility ofL-AO was higher than that ofL-AP,and the antioxidant effect in oil and fat was thatL-AO>TBHQ>L-AP>BHT.

lipase;L-ascorbate oleate;response surface methodology;fat solubility;anti-oxygenation

2015-12-02

王靈利(1988-),女,在讀碩士研究生,研究方向:油脂營養(yǎng)與健康,E-mail:wangll0121@126.com。

劉國琴(1962-),女,博士，教授,主要從事油脂營養(yǎng)與安全研究,E-mail:guoqin@scut.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金面上項目(31271885,31471677);廣東省國際合作項目(2010B050600003);國家高新技術(shù)研究和開發(fā)項目(2013AA102103)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)11-0226-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.038