西藏羊八井地區(qū)牦牛酸乳中乳酸菌菌種鑒定

劉珊春,趙　欣,騫　宇,李　鍵,陳煉紅,陳　娟,索化夷,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715; 2.西南大學 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715; 3.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067; 4.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041; 5.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院,四川成都 610041)

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西藏羊八井地區(qū)牦牛酸乳中乳酸菌菌種鑒定

劉珊春1,2,趙欣3,騫宇3,李鍵4,5,陳煉紅4,5,陳娟5,索化夷1,2,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715; 2.西南大學 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715; 3.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067; 4.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041; 5.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院,四川成都 610041)

26株分離自西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳的菌株,經(jīng)形態(tài)學、分子生物學鑒定,其中18株為腸球菌屬(Enterococcus)、6株為乳桿菌屬(Lactobacillus)、2株為明串珠菌屬(Leuconostoc)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析乳酸菌的遺傳多樣性,并與其它地區(qū)牦牛酸乳中分離到的乳酸菌進行比較,發(fā)現(xiàn)西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中乳酸菌多樣性豐富,其優(yōu)勢乳酸菌株為腸球菌屬(Enterococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)。

乳酸菌,牦牛酸乳,菌種鑒定,16S rDNA

牦牛主要分布于青藏高原及其毗鄰高山地區(qū),西藏地區(qū)共有牦牛390萬頭,占全世界牦?？倲?shù)的30%[1-2]。牦牛為藏區(qū)牧民提供乳、肉、皮毛等畜產(chǎn)品,是當?shù)刂匾慕?jīng)濟來源[3]。與普通牛乳相比,牦牛乳富含蛋白質(zhì)、必需氨基酸、脂肪、乳糖和礦物質(zhì)等[4],深受當?shù)啬撩窈陀慰拖矏?。傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳是一種以新鮮牦牛乳為原料,經(jīng)多種乳酸菌和酵母菌等微生物共同發(fā)酵而成的一種低酒精含量風味乳品,其中有許多具有優(yōu)良特性的乳酸菌,是一個復(fù)雜的微生物體系。冶成君[5]研究發(fā)現(xiàn),青海玉樹牧區(qū)凝固型牦牛酸乳中有德氏乳桿菌、乳球菌、芽孢桿菌、腸球菌等多種乳酸菌;蔣厚陽[6]應(yīng)用PCR-DGGE法分析西藏傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪(奶渣)中乳酸菌,發(fā)現(xiàn)了副干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌等12種乳酸菌,其中德氏乳桿菌為優(yōu)勢菌種。

乳酸菌的鑒定方法主要分為表型特征鑒定法和基因型鑒定法。利用16S rDNA序列分析、變性梯度凝膠電泳標記技術(shù)(DGGE)等分子生物學技術(shù)對乳酸菌進行分類鑒定的優(yōu)勢日益明顯。夏雪娟等[7]采用屬特異性PCR、16S rDNA序列同源性分析、種特異性PCR與NEBcutter分析相結(jié)合的方法,對西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌進行鑒定。董曉婉[8]等采用傳統(tǒng)的生理生化實驗和16S rDNA基因序列分析相結(jié)合的方法,對新疆蒙古族和哈薩克族酸奶中乳酸菌進行鑒定。Yu[9]等研究發(fā)現(xiàn)PCR-RFLP分析和16S rDNA相結(jié)合的方法能快速、簡便、有效的鑒定乳酸菌。

本實驗以實驗室保存的分離純化自羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中的26株菌為研究對象,采用16S rDNA基因序列分析進行種屬鑒定,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹確定乳酸種屬,并與其他地區(qū)牦牛酸乳中分離到的乳酸菌進行比較,為牦牛酸乳中乳酸菌資源的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)信息。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

26株菌株來源于本實驗室保存的,從西藏羊八井地區(qū)牧民家庭的自然發(fā)酵牦牛酸乳中分離純化的菌種;MRS肉湯青島高科園海博生物技術(shù)公司;碳酸鈣(分析純)成都市科龍化工試劑廠;通用基因組DNA提取試劑盒、RNase A、蛋白酶K、DNA Lodaing Buffer、TAE緩沖溶液、瓊脂糖、Pfu DNA Polymerase、Pfu Buffer(含Mg2+)、dNTPs Mixture北京索萊寶科技有限公司;λDNA/HindⅢ、100 bp DNA Ladder天根生化(北京)科技有限公司;GelRed TM核酸染料Biotium中國總代理;引物1495R、27F上海生工生物工程公司。

Elix10純水系統(tǒng)、Biocel超純水系統(tǒng)美國Millipore公司;OLYMPUS-BX43生物顯微鏡日本奧林巴斯公司;S1000 Thermal Cycler梯度PCR儀、Mini-Sub Cell GT Cel小型水平電泳槽美國Bio-Rad公司;Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)英國SynGene公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的活化鏡檢本實驗樣本原保存于含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中,無菌條件下,從培養(yǎng)基表面挑取有溶鈣圈的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,置于搖床中30 ℃振蕩培養(yǎng)24～48 h。將培養(yǎng)后的MRS液體培養(yǎng)基振蕩搖勻,劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基中,置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)48～72 h,觀察并記錄菌落形態(tài)。重復(fù)以上步驟連續(xù)純化兩代,挑取單菌落于載玻片上,進行革蘭氏染色[10]、鏡檢。

1.2.2菌株基因組DNA提取確定無雜菌后,再次挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中,置于搖床中30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h,取培養(yǎng)液按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明對菌株進行DNA提取,并儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR擴增

1.2.3.1PCR引物PCR擴增對象為菌株的16S rDNA基因。PCR所用引物為生工生物技術(shù)公司合成的16S rDNA基因通用引物27F及1495R。

上游引物27F序列:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′

下游引物1495R序列:5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3′

1.2.3.2PCR擴增體系(25 μL反應(yīng)體系)模板DNA1 μL,上游引物27F 0.5 μL,下游引物1495R 0.5 μL,10×Taq plus Buffer(含Mg2+)2.5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2.0 μL,Taq plus(2.5 μ/μL)1.0 μL,ddH2O 17.5 μL。

1.2.3.3 PCR擴增條件94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1.5 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物,電壓80 V,電泳時間40 min,經(jīng)GelRed核酸染料染色后,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

1.2.516S rDNA PCR擴增產(chǎn)物測序、鑒定由北京華大基因公司對26株菌16S rDNA進行測序。用DNAStar 7.1中的SeqMan軟件進行序列拼接和校準,然后在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比對,利用其中的檢索庫進行序列的同源性分析并確定其種屬,根據(jù)樣本編號保存檢索結(jié)果,并按照種屬關(guān)系對樣本進行分類。

1.2.6系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建調(diào)取GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的16株乳酸菌的相同區(qū)段基因序列,利用ClustalX1.83軟件將測序菌株與標準菌株的16S rDNA基因序列進行多序列匹配比對,使用MEGA5.05軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)[11]計算,構(gòu)建乳酸菌的系統(tǒng)進化樹,采用自舉分析進行置信度檢測,自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)

如圖1、圖2所示,菌株劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后,有單菌落出現(xiàn),菌落形態(tài)呈圓形,顏色呈乳白色,表面光滑,邊緣整齊,不透明。

圖1　Y13菌落形態(tài)Fig.1　Colony morphology of Y13

圖2　Y4菌落形態(tài)Fig.2　Colony morphology of Y4

如圖3、圖4所示,顯微鏡下細胞染色為藍紫色,為革蘭氏陽性菌;形態(tài)為球形、橢圓、短桿狀、長桿狀等,細胞形態(tài)符合乳酸菌特征。

圖3　Y13革蘭氏染色結(jié)果(1000×)Fig.3　Gram staining results of Y13(1000×)

圖4　Y4革蘭氏染色結(jié)果(1000×)Fig.4　Gram staining results of Y4(1000×)

2.2乳酸菌16S rDNA序列PCR擴增結(jié)果

擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖5所示,陰性對照無條帶,說明擴增未出現(xiàn)污染;1～26泳道均得到長度約1500 bp的特異性擴增片段,符合預(yù)期擴增片段長度。

圖5　乳酸菌PCR擴增產(chǎn)物16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5　Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA-PCR products from lactobacillus注:M.100 bp DNA Ladder;0.空白組;1～26.編號為1～26的菌株。

2.3PCR擴增產(chǎn)物測序與GeneBank鑒定種屬

委托北京華大基因公司對擴增成功菌株的PCR產(chǎn)物進行雙向測序,獲得序列經(jīng)SeqMan軟件拼接后,通過BLAST在GeneBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對,有效(同源率98%以上)結(jié)果如表1所示。

表1　16S rDNA序列鑒定26株菌結(jié)果

表2　26株乳酸菌的16S rDNA序列鑒定結(jié)果

結(jié)果表明,26株菌均鑒定成功,其中有2株乳酸菌與GeneBank數(shù)據(jù)庫中已知乳酸菌具有高達100%的同源性;22株有99%的同源性;2株有98%的同源性?？偨Y(jié)26株乳酸菌的分子生物學鑒定結(jié)果,如表2所示。

這26株乳酸菌經(jīng)鑒定屬于3個屬,5個種。結(jié)果表明,西藏羊八井地區(qū)牦牛酸乳中球菌和桿菌分別以腸球菌屬(69.23%)和乳桿菌屬(23.07%)為優(yōu)勢菌屬。

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

由該進化樹可知,從總體上可將這26株乳酸菌分為3個大群。即菌株Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y9、Y10、Y11、Y12、Y14、Y15、Y18、Y19、Y20、Y21、Y23、Y24、Y25和耐久腸球菌為第一群;菌株Y6、Y7、Y8、Y13、Y16、Y17、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌為第二群;菌株Y22、Y26、乳明串珠菌、腸系膜明串珠菌為第三群。同時,系統(tǒng)發(fā)育進化樹也表明腸球菌屬和明串珠菌屬之間的親緣關(guān)系較近,而與乳桿菌屬之間的親緣關(guān)系較遠。另外,第3、4、16、21株在各自進化枝內(nèi)與其他菌株距離較遠,表明在種內(nèi)也有較高的遺傳多樣性。綜合看來,西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中含有豐富的乳酸菌菌種,反映出乳酸菌的生物多樣性。其優(yōu)勢菌種為耐久腸球菌和干酪乳桿菌。這與其他研究者對西藏地區(qū)牦牛酸乳中乳酸菌的研究結(jié)果不同。例如,Yu等[9]采用16S rRNA-RFLP技術(shù)對西藏地區(qū)牦牛酸乳的乳酸菌多樣性進行了研究,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌和瑞士乳桿菌是這一地區(qū)牦牛酸乳中的主要乳酸菌。楊俊俊[12]研究西藏牦牛奶渣中的乳酸菌,指出耐久腸球菌、類干酪乳桿菌干酪亞種、屎腸球菌和植物乳桿菌為主要乳酸菌;陳芝蘭等[13]對西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌進行分離、鑒定,發(fā)現(xiàn)其中的優(yōu)勢菌株為干酪乳桿菌、植物乳桿菌和類布氏乳桿菌。由此可見,西藏不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌菌種含量豐富,不同地區(qū)、甚至相同地區(qū)不同作坊的發(fā)酵乳、菌種也會有較大差異,發(fā)映出乳酸菌的生物多樣性。

圖6　26株乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.6　Phylogenetic tree of the 26 lactobacillus strains

雷霞[14]和旭日花[15]對內(nèi)蒙古不同地區(qū)的酸牛奶為研究對象進行了乳酸菌的分離鑒定,均分離得到了干酪乳桿菌、耐久腸球菌,同時,雷霞還分離到了乳明串珠菌,說明干酪乳桿菌、耐久腸球菌、乳明串珠菌是酸乳中常見的乳酸菌。Ao[16]等對四川紅原地區(qū)牦牛酸乳的研究發(fā)現(xiàn),耐久腸球菌、發(fā)酵乳桿菌和副干酪乳桿菌是其中的優(yōu)勢乳酸菌。楊俊俊[12]發(fā)現(xiàn)耐久腸球菌是西藏牦牛奶渣中的主要乳酸菌。不同地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中都發(fā)現(xiàn)了耐久腸球菌,有些甚至發(fā)現(xiàn)耐久腸球菌為優(yōu)勢乳酸菌。乳制品中出現(xiàn)腸球菌大多數(shù)是由于生產(chǎn)過程中受到糞便的污染,但許多傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中都分離出了耐久腸球菌和屎腸球菌,且有研究發(fā)現(xiàn),腸球菌能促進干酪成熟,改善奶酪的風味和口感[17],耐久腸球菌可以改善傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳的外觀和質(zhì)地[16]。

3　結(jié)論

對西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中26株菌進行鑒定,發(fā)現(xiàn)有2株乳酸菌與GeneBank數(shù)據(jù)庫中已知乳酸菌具有高達100%的同源性;22株有99%的同源性;2株有98%的同源性。采用16S rDNA序列分析對傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中的乳酸菌進行分子生物學鑒定,準確度高、結(jié)果可靠。經(jīng)鑒定,實驗中26株乳酸菌包括腸球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬等3個屬,耐久腸球菌(69.23%)、干酪乳桿菌(15.38%)、副干酪乳桿菌(7.69%)、腸系膜明串珠菌(3.85%)、乳明串珠菌(3.85%)等5個種。這說明西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中乳酸菌資源種類豐富,其中耐久腸球菌和干酪乳桿菌為主要的乳酸菌。西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中分離的乳酸菌種與其他地區(qū)奶制品中分離的乳酸菌存在明顯差異,推測造成這些差異的原因主要包括所用原料、制作工藝、發(fā)酵條件等方面。實驗中分離到的乳桿菌可以進行后續(xù)的益生性能和發(fā)酵優(yōu)良乳酸菌的篩選。

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Identification of lactobacillus isolated from fermented yak milk in Tibetan Yangbajing area

LIU Shan-chun1,2,ZHAO Xin3,QIAN Yu3,LI Jian4,5,CHEN Lian-hong4,5,CHEN Juan5,SUO Hua-yi1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China; 2.Chongqing Engineering Research Center of Regional Food,Chongqing 400715,China; 3.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 4.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China; 5.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

The 26 strains isolated from traditional fermented yak milk in Yangbajing area were identified by morphological and molecular identification,including 18Enterococcusstrains,6Lactobacillusstrains,2Leuconostocstrains.Construct phylogenetic tree to analysis the genetic diversity oflactobacillusand compare with thelactobacillusthat were separated from other places,finding that they have rich biodiversity,EnterococcusandLactobacilluswere the most common culturable species.

Lactobacillus;yak yogurt;identification;16S rDNA

2015-11-09

劉珊春(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵微生物，E-mail：liushanchun516@163.com。

索化夷(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵微生物，E-mail：birget@swu.edu.cn。

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303085)；重慶市社會民生科技創(chuàng)新專項(cstc2015shmszx80021)；重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項目(cstc2014pt-gc8001)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0208-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.034