甘草不同溶劑提取物對(duì)AChE、ACE以及α-葡萄糖苷酶的抑制活性和對(duì)亞硝酸根清除活性的研究

趙　巖,彭　蕾,郜玉鋼,何忠梅,楊　鶴,劉雙利,張連學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

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甘草不同溶劑提取物對(duì)AChE、ACE以及α-葡萄糖苷酶的抑制活性和對(duì)亞硝酸根清除活性的研究

趙巖,彭蕾,郜玉鋼*,何忠梅,楊鶴,劉雙利,張連學(xué)*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

目的:研究甘草不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶(AChE)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性的影響以及對(duì)亞硝酸根離子的清除能力。方法:采用高效液相色譜法測(cè)定甘草不同溶劑提取物對(duì)ACE的抑制作用,采用分光光度法測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶、AChE的抑制作用及對(duì)亞硝酸根離子的清除能力。結(jié)果表明:甘草石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物均對(duì)α-葡萄糖苷酶有較好的抑制作用,其IC50值分別為3.212、0.151、0.891 mg/mL,優(yōu)于陽(yáng)性藥阿卡波糖;甘草提取物乙酸乙酯部位、水部位對(duì)AChE有較強(qiáng)的抑制作用,其IC50值為0.489、0.872 mg/mL,優(yōu)于陽(yáng)性藥利斯的明;甘草乙酸乙酯提取物對(duì)亞硝酸根離子有較強(qiáng)的清除能力,其IC50值為1.068 mg/mL,優(yōu)于陽(yáng)性藥VC;甘草乙酸乙酯提取物對(duì)ACE有較強(qiáng)的抑制作用,其IC50值為0.815 mg/mL,優(yōu)于其陽(yáng)性藥卡托普利。在這5種甘草不同溶劑提取物中,甘草乙酸乙酯提取物抑制活性最強(qiáng)。結(jié)論:甘草乙酸乙酯提取物具有很強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE抑制作用且對(duì)亞硝酸離子有很好的清除能力。

甘草,抑制ACE的活性,抑制AChE的活性,抑制α-葡萄糖苷酶的活性,亞硝酸根離子清除活性

常用中藥甘草為豆科植物,中國(guó)藥典一部2010年版收載為甘草(GlycyrrhizauraleusisFisch.)、脹果甘草(G.inflataBat.)或光果甘草(G.glabraL.)的根及根莖[1],其中甘草為主流品種[2]。甘草的化學(xué)成分主要為黃酮、三萜、香豆素等[3-7],甘草的主要藥理活性為保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)咳、抗瘧、抗氧化、免疫調(diào)解和抗血小板凝集等[8-11]。雖然對(duì)甘草的藥理活性的研究已經(jīng)很深入,但目前對(duì)于研究甘草不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶(AChE)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性以及對(duì)亞硝酸根離子清除活性的研究并不深入。并且目前臨床上應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE等抑制劑主要為西藥如卡托普利、利斯的明、阿卡波糖等,價(jià)格都比較昂貴而且具有副作用。而甘草本身就是藥食同源,因此本研究選取甘草為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分別用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇、蒸餾水為溶劑提取其成分,測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE的抑制活性以及對(duì)亞硝酸根離子的清除活性,并比較不同溶劑提取物活性的差別。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甘草購(gòu)買(mǎi)于吉林大藥房,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)楊利民教授鑒定為甘草(GlycyrrhizauralenisisFisch)的干燥根;乙酰膽堿酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、α-葡萄糖糖苷酶、馬尿酰-組氨酸-亮氨酸、馬尿酸(BR>98%)美國(guó)Sigma公司;蔗糖、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、碘化硫代乙酰膽堿(AChI)、對(duì)氨基苯磺酸、N-1一萘基乙二胺鹽酸鹽阿拉丁公司;卡托普利片國(guó)藥準(zhǔn)字H31022986,中美上海施貴寶制藥有限公司;阿卡波糖片國(guó)藥準(zhǔn)字H19990205,拜耳醫(yī)藥有限公司;利斯的明國(guó)藥準(zhǔn)字H20130081,Novartis Farmaceutica S A;維生素C片國(guó)藥準(zhǔn)字H32025345,無(wú)錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司;其余試劑均為分析純。

CXTH-3000型高效液相色譜儀北京創(chuàng)新通恒科技有限公司;WD-2102A型自動(dòng)酶標(biāo)儀北京市八一儀器廠;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋箱江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1甘草不同溶劑提取物的制備取粉碎好的甘草藥材100 g置于1000 mL錐形瓶中,依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、95%乙醇、蒸餾水為溶劑按1∶10、1∶8、1∶6的比例,60 ℃超聲2 h,并將同溶劑的提取液進(jìn)行合并,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮,然后冷凍干燥得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、蒸餾水提取物。

1.2.2α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的測(cè)定供試品溶液的制備:取提取物4 mg定容于200 μL的PBS(pH=6.8)緩沖液中,即為初始濃度20 mg/mL,然后用PBS(pH=6.8)緩沖液依次稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的供試品溶液。

根據(jù)文獻(xiàn)方法改進(jìn)[12-14],檢測(cè)在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行,加入樣品溶液10 μL,15 μLα-葡萄糖糖苷酶,加入25 mmol/L蔗糖溶液和PBS(pH=6.8)緩沖液各10 μL,37 ℃反應(yīng)15 min,最后加入葡萄糖測(cè)試盒工作液180 μL,37 ℃溫育反應(yīng)15 min后,使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm下讀取OD值,并記錄。每個(gè)體系同時(shí)做3個(gè)平行,取平均值。實(shí)驗(yàn)以PBS(pH=6.8)緩沖液代替樣品溶液作為陰性,以阿卡波糖(拜糖平)代替樣品溶液作為陽(yáng)性。以PBS(pH=6.8)緩沖液代替α-葡萄糖糖苷酶作為樣品對(duì)照。按照抑制率(%)=OD陰性-(OD樣品-OD樣品對(duì)照)/OD陰性-OD空白×100計(jì)算,并求出相應(yīng)的IC50值。

1.2.3乙酰膽堿酶抑制活性的測(cè)定供試品溶液的制備:取提取物4 mg定容于200 μL的PBS(pH=6.8)緩沖液中,即為初始濃度20 mg/mL,然后用PBS(pH=6.8)緩沖液依次稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的供試品溶液。

根據(jù)已有的方法進(jìn)行改進(jìn)[15-16],檢測(cè)在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行,加入140 μL PBS緩沖液(pH=8.0),加入20 μL樣品,再加入15 μL AChE 溶液在微孔里混合,振蕩混勻,4 ℃培養(yǎng)20 min。然后加10 μL 0.01 mol/L的DTNB,最后加10 μL 0.075 mol/L的AChI開(kāi)始反應(yīng)。37 ℃培養(yǎng)20 min后,405 nm下測(cè)OD值。實(shí)驗(yàn)以20 μL PBS溶液代替樣品溶液作為空白組,以20 μL PBS溶液代替樣品溶液和15 μL PBS溶液代替酶液作為空白對(duì)照組,并以15 μL PBS溶液代替酶液作為樣品對(duì)照組并以利斯的明溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。按照抑制率(%)=[(OD空白-OD空白對(duì)照)-(OD樣品-OD樣品對(duì)照)]/(OD空白-OD空白對(duì)照)×100計(jì)算抑制率,并求出相應(yīng)的IC50值。

1.2.4清除亞硝酸根離子能力的活性篩選

1.2.4.1供試品溶液的制備取提取物4 mg定容于200 μL的PBS(pH=6.8)緩沖液中,即為初始濃度20 mg/mL,然后用PBS(pH=6.8)緩沖液依次稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的供試品溶液。

加入樣品溶液10 μL,20 μL 0.5 mg/mL亞硝酸鈉溶液,40 μL蒸餾水,最后再加入140 μL檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液(pH=3)溶液,37 ℃ 水浴1 h,取出冷卻至室溫。實(shí)驗(yàn)以10 μL蒸餾水代替樣品溶液作為空白,以20 μL蒸餾水代替亞硝酸鈉溶液作為樣品對(duì)照,以200 μL檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液作為空白對(duì)照。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。備用。

1.2.4.2亞硝酸根離子清除能力的測(cè)定在96孔酶標(biāo)板中,準(zhǔn)確吸取20 μL上述供試品溶液,40 μL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液搖勻,5 min后加入20 μL 0.2% N-1乙二胺鹽酸鹽溶液和120 μL蒸餾水。搖勻靜置15 min后于492 nm處測(cè)定OD值。按照清除率(%)=[(OD空白-OD空白對(duì)照)-(OD樣品-OD樣品對(duì)照)]/(OD空白-OD空白對(duì)照)×100,并求出相應(yīng)的IC50值。

表1　甘草提取物對(duì)α-葡萄糖糖苷酶的抑制活性(n=3)

注:“-”未檢測(cè)出;與陽(yáng)性組比較:*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01);表2～表4同。

表2　甘草提取物對(duì)乙酰膽堿酶的抑制活性(n=3)

1.2.5ACE抑制活性的測(cè)定供試品溶液的制備:取提取物4 mg定容于200 μL的PBS(pH=6.8)緩沖液中,即為初始濃度20 mg/mL,然后用PBS(pH=6.8)緩沖液依次稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的供試品溶液。

色譜條件:色譜柱ODS-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相:甲醇∶三氟乙酸水溶液(0.01%)=40∶60,檢測(cè)波長(zhǎng):228 nm,流速:0.5 mL/min,柱溫:25 ℃,進(jìn)樣量:20 μL。

加入75 μL硼酸鉀緩沖液(pH=8.3),加入樣品溶液10 μL,加入5 mmol/L底物馬尿酰-組氨酸-亮氨酸10 μL,37 ℃保溫5 min后,再加入5 μL ACE酶溶液,混勻,37 ℃培養(yǎng)30 min,最后加入1 mol/L HCl溶液300 μL終止反應(yīng),10000 r/min離心10 min,吸取上清,備用。實(shí)驗(yàn)以10 μL硼酸鉀緩沖液(pH=8.3)代替樣品溶液作為空白組,以卡托普利為陽(yáng)性對(duì)照。在上述色譜條件下取供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜峰面積并計(jì)算含量。按照抑制率(%)=(Ab-Ati)/Ab×100(Ab和Ati分別為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組馬尿酸的峰面積)計(jì)算提取物的抑制率,并求出相應(yīng)的IC50值。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1甘草不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的測(cè)定結(jié)果

測(cè)定甘草不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可看出,隨著濃度的增大,抑制率也逐漸增大,說(shuō)明提取物的濃度與抑制率成正比。與相同濃度陽(yáng)性對(duì)照組比較,氯仿提取物抑制率極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組;在濃度為0.625～10 mg/mL時(shí),95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物抑制率極顯著(p<0.01)高于陽(yáng)性對(duì)照組,在濃度為5～20 mg/mL時(shí),水提物的差異顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組,石油醚提取物(除5 mg/mL)無(wú)顯著差異。從抑制率和IC50值分析,與陽(yáng)性相比氯仿提取物和水提物對(duì)α-葡萄糖糖苷酶的抑制作用弱于陽(yáng)性藥阿卡波糖,而乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、石油醚提取物對(duì)α-葡萄糖糖苷酶的抑制作用強(qiáng)于陽(yáng)性藥。說(shuō)明這三種提取物中聚集了抑制α-葡萄糖糖苷酶的化學(xué)成分,孫佳明等[17]研究也表明甘草95%乙醇提取物中含有抑制α-葡萄糖糖苷酶的化學(xué)成分。

2.2甘草不同溶劑提取物對(duì)乙酰膽堿酶的抑制活性

測(cè)定甘草不同溶劑提取物對(duì)乙酰膽堿酶抑制活性的影響,結(jié)果見(jiàn)表2。表2數(shù)據(jù)表明隨著濃度的增大,抑制率也逐漸增大,說(shuō)明抑制率對(duì)濃度有一定的依賴(lài)性。從顯著性差異來(lái)分析,與陽(yáng)性對(duì)照組比較,在濃度為0.625～20 mg/mL時(shí)氯仿提取物、石油醚提取物、95%乙醇提取物抑制活性極顯著低于陽(yáng)性藥;在濃度為1.25～5 mg/mL時(shí)水提取物抑制活性顯著低于陽(yáng)性藥,10～20 mg/mL水提物抑制活性極顯著低于陽(yáng)性藥;乙酸乙酯提取物無(wú)顯著差異。從抑制率和IC50值分析,與陽(yáng)性相比,氯仿提取物、石油醚提取物、95%乙醇提取物和水提物的抑制作用低于陽(yáng)性藥利斯的明,然乙酸乙酯提取物的抑制作用強(qiáng)于陽(yáng)性藥。綜上所述乙酸乙酯提取物具有很強(qiáng)的乙酰膽堿酶抑制活性。

2.3甘草不同溶劑提取物對(duì)亞硝酸根離子的清除能力

表3　甘草提取物對(duì)亞硝酸根的清除活性(n=3)

表4　甘草提取物對(duì)ACE的抑制活性(n=3)

測(cè)定甘草不同溶劑提取物對(duì)亞硝酸根離子的清除能力,結(jié)果見(jiàn)表3。表3數(shù)據(jù)表明隨著濃度的增大,清除率也隨之增大,說(shuō)明清除率對(duì)濃度有一定的依賴(lài)性。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,在濃度為1.25～20 mg/mL時(shí)氯仿提取物、石油醚提取物清除率極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照藥;在濃度為0.625～2.5 mg/mL水提物顯著低于陽(yáng)性對(duì)照藥;乙酸乙酯提取物無(wú)顯著差異。從清除率和IC50值分析,與陽(yáng)性相比,氯仿提取物、石油醚提取物、乙醇提取物和水提物的清除能力低于陽(yáng)性藥VC,然而乙酸乙酯提取物的清除能力高于陽(yáng)性藥。綜上所述乙酸乙酯提取物具有很強(qiáng)的亞硝酸根清除能力。

2.4甘草不同溶劑提取物對(duì)ACE抑制活性的測(cè)定結(jié)果

測(cè)定甘草不同部溶劑位提取物對(duì)ACE抑制活性的影響,結(jié)果見(jiàn)表4。表4數(shù)據(jù)表明隨著濃度的增大,抑制率也隨之增大,說(shuō)明抑制率對(duì)濃度有一定的依賴(lài)性。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,在濃度為1.25～20 mg/mL石油醚提取物ACE抑制率極顯著低于陽(yáng)性藥;在10～20 mg/mL時(shí)95%乙醇提取物ACE抑制率極顯著低于陽(yáng)性藥;乙酸乙酯提取物抑制活性與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)顯著差異。然從抑制率結(jié)果和IC50值結(jié)果分析,與陽(yáng)性相比,氯仿提取物、石油醚提取物、95%乙醇提取物和抑制作用低于陽(yáng)性藥卡托普利,而乙酸乙酯提取物的抑制作用高于陽(yáng)性藥。綜上所述乙酸乙酯提取物很強(qiáng)的ACE抑制作用。

3　結(jié)論與討論

對(duì)甘草不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE抑制活性以及對(duì)亞硝酸根離子清除能力進(jìn)行了篩選研究,測(cè)定其IC50值并對(duì)其與陽(yáng)性藥進(jìn)行了顯著差異分析。結(jié)果表明甘草乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物的降血糖活性最顯著且優(yōu)于陽(yáng)性藥阿卡波糖(IC50=3.392 mg/mL),其IC50值為0.151、0.891 mg/mL;甘草乙酸乙酯提取物對(duì)乙酰膽堿酶的抑制作用效果顯著優(yōu)于陽(yáng)性藥利斯的明(IC50=0.703 mg/mL),其IC50值為0.489 mg/mL;甘草乙酸乙酯部位提取物對(duì)亞硝酸根得清除活性與其陽(yáng)性藥VC(IC50=1.128 mg/mL)作用效果無(wú)明顯差異,其IC50值為1.068 mg/mL;甘草乙酸乙酯提取物對(duì)ACE的抑制作用效果顯著優(yōu)于陽(yáng)性藥卡托普利(IC50=1.493 mg/mL),其IC50值為0.815 mg/mL。由此可知甘草粗提物乙酸乙酯部位具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE的抑制作用以及對(duì)亞硝酸離子有很好的清除能力,可作為進(jìn)一步活性追蹤的部位。甘草乙酸乙酯提取物的藥理作用和具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究,為進(jìn)一步探索甘草提取物化學(xué)成分有效活性的研究提供了理論依據(jù)。

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Study on AChE,ACE,α-glycosidase inhibitory activity and nitrite scavenging activity of the licorice extracts

ZHAO Yan,PENG Lei,GAO Yu-gang*,HE Zhong-mei,YANG He,LIU Shuang-li,ZHANG Lian-xue*

(Chinese Medicine Material College of Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)

Objective:To research the effect of different layer of licorice extracts onα-glycosidase enzymes,AchE and ACE activities and the influence of the effect of nitrite scavenging activity. Methods:Five kinds of licorice extracts were extracted fromGlycyrrhizauraleusisFisch.Their ACE inhibitory activity was determined by HPLC. The extracts’ nitrite scavenging capability and theirα-glucosidase and AChE inhibitory activity were measured by spectrophotometry,respectively. Results:The evaluation results showed that petroleum ether,ethyl acetate and ethanol fractions of licorice possessedα-glucosidase inhibitory effect and their IC50value was 3.212,0.151,0.891 mg/mL,which were more potent than that of acarbose,ethyl acetate,water fractions of licorice possessed AChE inhibitory effect and their IC50value was 0.489,0.872 mg/mL,which were more potent than that of rivastigmine.Ethyl acetate fractions of licorice possessed nitrite scavenging activity and their IC50value was 1.068 mg/mL,which was more potent than that of VC.Ethyl acetate fractions of licorice possessed ACE inhibitory effect and their IC50value was 0.815 mg/mL,which was more potent than that of captopril,so ethyl acetate fractions of licorice was the most potent inhibitory in five kinds of licorice extracts. Conclusion:Ethyl acetate fractions ofGlycyrrhizauraleusisFisch have shown high ACE,AChE andα-glycosidase inhibitory capacity and nitrite scavenging activity so they will be further guided isolation and purified to obtain active compounds.

GlycyrrhizauraleusisFisch;ACE inhibitory activity;AChE inhibitory activity;α-glycosidase inhibitory activity;nitrite scavenging activity

2015-10-22

趙巖(1979-)，男，博士，副教授，主要從事天然藥物化學(xué)成分與生物活性方面的研究，E-mail：zhyjlu79@163.com。

郜玉鋼(1970-),博士,教授,研究方向：藥用植物栽培與加工，E-mail:gaoyugang_2006@163.com。

張連學(xué)(1955-), 博士,教授,研究方向：藥用植物栽培與加工，E-mail:zlx863@163.com。

國(guó)家公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201303111)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)(20140204013YY, 20150307012YY)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)10-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.029