HPLC法測(cè)定10個(gè)引自北美藍(lán)莓品種果實(shí)中的糖酸組分及含量

于　淼,阮成江,李　賀,張少鳳,徐弘灝,劉向前

(大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，資源植物研究所,遼寧大連 116600)

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HPLC法測(cè)定10個(gè)引自北美藍(lán)莓品種果實(shí)中的糖酸組分及含量

于淼,阮成江*,李賀,張少鳳,徐弘灝,劉向前

(大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，資源植物研究所,遼寧大連 116600)

采用HPLC法對(duì)10個(gè)引自北美的藍(lán)莓品種果實(shí)中糖、酸組分及含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,藍(lán)莓果實(shí)中的可溶性糖以果糖和葡萄糖為主,果糖含量在18.916～73.899 mg/g之間,葡萄糖含量在19.194～79.521 mg/g之間;有機(jī)酸組分有草酸、奎寧酸、蘋果酸、維生素C和檸檬酸,其中以檸檬酸為主,含量在1.174～15.069 mg/g之間,草酸最低,含量在0.018～0.046 mg/g之間。不同品種藍(lán)莓果實(shí)的糖、酸含量存在明顯差異,其中果糖和葡萄糖含量最高的品種是北空,檸檬酸含量最高的品種是伊麗莎白。糖酸比和甜酸比是影響果實(shí)風(fēng)味的重要因素,10個(gè)藍(lán)莓品種果實(shí)的糖酸比在2.342～27.488之間,甜酸比在285.953～3393.854之間,表現(xiàn)為北空>芝妮>圣云>友誼>美登>北陸>藍(lán)光>愛國者>布麗吉塔>伊麗莎白。

HPLC法,藍(lán)莓,糖,有機(jī)酸,甜酸比

藍(lán)莓是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生落葉或常綠灌木漿果類果樹,原產(chǎn)于北美,主要分布于我國的東北和西南地區(qū)[1-3]。藍(lán)莓果實(shí)中含有豐富的花青素、多酚和維生素C等營養(yǎng)成分,具有提高記憶力、保護(hù)視力和軟化血管等保健功能[4-6]。目前,因其特殊的營養(yǎng)和藥用功能,人們對(duì)藍(lán)莓的研究越來越多,主要集中于品種篩選與栽培、果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)等研究。

作為藍(lán)莓果實(shí)中的主要風(fēng)味物質(zhì),可溶性糖和有機(jī)酸的組成和含量直接影響果實(shí)的甜酸風(fēng)味及口感[7],是衡量果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)[8-9]。但是,國內(nèi)外關(guān)于藍(lán)莓果實(shí)中糖、有機(jī)酸的組成分析的報(bào)道不多,魏鑫等[10]曾對(duì)四個(gè)藍(lán)莓品種進(jìn)行了糖、酸組分的測(cè)定,葛翠蓮等[11]選用國內(nèi)10個(gè)藍(lán)莓品種對(duì)可溶性糖及可滴定酸含量進(jìn)行分析,徐玉濤等[12]對(duì)大連地區(qū)26個(gè)藍(lán)莓品種進(jìn)行了有機(jī)酸含量的測(cè)定,結(jié)果表明不同品種的藍(lán)莓果實(shí)糖酸組成及含量存在較大差異。目前,國內(nèi)對(duì)引種于北美的高叢、半高叢及矮叢藍(lán)莓品種果實(shí)糖酸組分及含量方面的研究還未見報(bào)道。

高效液相色譜法(HPLC法)廣泛用于可溶性糖和有機(jī)酸酸的分離與測(cè)定,可快速、準(zhǔn)確地分析植物果實(shí)中的糖、酸組成及含量[13-15]。本文采用高效液相色譜法測(cè)定引自美國的10個(gè)藍(lán)莓品種果實(shí)中的糖、酸組分及含量,計(jì)算各品種果實(shí)的糖酸比及甜酸比,旨在為藍(lán)莓果實(shí)的口感評(píng)價(jià)及品質(zhì)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試的10個(gè)引自北美的藍(lán)莓品種(友誼Frendship、北陸Northland、北空Northsky、圣云St. Cloud、美登Blomidon、芝妮Chignecto、愛國者Patriot、藍(lán)光Blueray、布麗吉塔Brigitta、伊麗莎白Elizabeth)于2014年6月采自遼寧省瓦房店藍(lán)莓種植基地,實(shí)驗(yàn)室中-20 ℃長期保存;果糖、葡萄糖、蔗糖、奎寧酸、蘋果酸、維生素C、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品和磷酸二氫鉀(KH2PO4,色譜級(jí),≥99.5%)Sigma-Aldrich(中國)公司;草酸標(biāo)準(zhǔn)品德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈和甲醇(均為色譜純級(jí))美國Honeywell Burdick & Jackson公司;二硫蘇糖醇(DTT,≥99%)德國Merk公司;偏磷酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀及工作站美國Agilent公司;SB52000型超聲波清洗儀寧波新藝超聲設(shè)備有限公司;PL203型電子天平瑞士Mettler Toledo公司;H2100R型高速冷凍離心機(jī)湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;AD200L-P型分散勻質(zhì)機(jī)上海昂尼儀器儀表有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1糖待測(cè)樣品處理稱取藍(lán)莓鮮果2 g左右于離心管勻漿,渦旋振蕩2 min,超聲處理2 min后于4 ℃,13000 r/min,離心15 min,上清液置于10 mL離心管內(nèi),果實(shí)殘?jiān)尤? mL超純水重復(fù)上述渦旋振蕩2 min、超聲處理2 min和離心(4 ℃,13000 r/min,15 min)操作,合并上清液,超純水定容至5 mL,樣品液稀釋2倍后0.22 μm濾膜過膜待測(cè)。

1.2.2酸待測(cè)樣品處理將1.2.1中糖待測(cè)液樣品處理方法中的超純水換為2%偏磷酸(0.1%DTT),另外,樣品液過膜前不稀釋,其他操作同1.2.1。

1.2.3糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱取果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品各500 mg,蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品200 mg混合定溶于10 mL容量瓶,得到果糖50 mg/mL、葡萄糖50 mg/mL、果糖20 mg/mL的混標(biāo)母液,用超純水稀釋糖混標(biāo)母液,得到果糖和葡萄糖濃度為10.00、4.00、2.50、1.25、1.00、0.50 mg/mL,蔗糖濃度為6.00、2.40、1.50、0.75、0.60、0.30 mg/mL的一系列糖混標(biāo)溶液。

1.2.4糖組分與含量測(cè)定的色譜條件美國Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀,配有RID示差檢測(cè)器,色譜柱為Zorbax Carbohydrate Analys column(250 mm×4.6 mm,5 mm,Agilent),流動(dòng)相為乙腈∶水=7∶3,流速0.7 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.5酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱取草酸10 mg、奎寧酸50 mg、蘋果酸50 mg、維生素C 250 mg、檸檬酸500 mg,混合定容于10 mL容量瓶,得到草酸1 mg/mL、奎寧酸5 mg/mL、蘋果酸5 mg/mL、維生素C 25 mg/mL、檸檬酸50 mg/mL的有機(jī)酸混標(biāo)母液,用超純水稀釋有機(jī)酸混標(biāo)母液,得到草酸濃度為0.005、0.01、0.02、0.03 mg/mL,奎寧酸、蘋果酸濃度為0.10、0.20、0.30、0.50 mg/mL,維生素C濃度為0.01、0.02、0.04、0.05 mg/mL,檸檬酸濃度為0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL的一系列有機(jī)酸混標(biāo)溶液。

1.2.6酸組分與含量測(cè)定的色譜條件Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀,配有DAD二極管陣列檢測(cè)器,色譜柱為Shim-pack VP-ODS column(250 mm×4.6 mm,5 mm,Shimadzu),流動(dòng)相為40 mmol/L磷酸二氫鉀(0.1%DTT),流速0.4 mL/min,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量為20 μL,草酸、奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸的檢測(cè)波長為208 nm,維生素C的檢測(cè)波長為245 nm。

1.2.7測(cè)定的線性相關(guān)性、重復(fù)性和回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)供試的10個(gè)藍(lán)莓果實(shí)樣品平行制作5個(gè)待測(cè)液進(jìn)行重復(fù)測(cè)定,并擬合線性回歸方程,以峰面積對(duì)濃度求回歸方程和相關(guān)系數(shù),對(duì)回收率的測(cè)定本研究采用加標(biāo)回收法[16],根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度和檢出質(zhì)量濃度計(jì)算回收率。

1.2.8糖酸比及甜酸比測(cè)定果實(shí)總糖含量為果糖與葡萄糖含量之和,果實(shí)總酸含量為草酸等五種有機(jī)酸含量之和,果實(shí)總糖含量與總酸含量的比值即為果實(shí)糖酸比;果實(shí)甜度含量與總酸含量的比值即為果實(shí)甜酸比,甜度的計(jì)算參照梁俊等[16]和姚改芳等[17]的方法。將蔗糖甜度定為100,以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行甜度對(duì)比,則果糖為175,葡萄糖為70,甜酸比=(果糖含量×175+葡萄糖含量×70+蔗糖含量×100)/果實(shí)總酸含量。

1.2.9數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0進(jìn)行平均數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分析。

2　結(jié)果與討論

2.1糖、酸測(cè)定的線性相關(guān)性、重復(fù)性和回收率

2.1.1線性關(guān)系和重復(fù)性如表1和表2所示,兩種糖的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)在0.9902～0.9918之間;五種有機(jī)酸的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)在0.9905～0.9970之間,表明在設(shè)定的高效液相色譜條件下各種糖、酸組分的峰面積與其含量有較好的線性相關(guān)性,實(shí)驗(yàn)方法能在給定的濃度范圍內(nèi)較準(zhǔn)確地測(cè)定糖、酸組分的含量。糖、酸組分測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為分別3.24%～4.31%和0.042%～1.034%,說明本研究中所涉及的HPLC方法具有較好的重復(fù)性,達(dá)到了分析的要求。

2.1.2回收率如表3和表4所示,糖、酸組分的回收率為99.863%～100.763%和97.87%～103.86%,滿足了分析實(shí)驗(yàn)的要求。

表1　糖測(cè)定的線性回歸方程的相關(guān)性

注:回歸方程中X代表糖質(zhì)量濃度,Y代表峰面積;表2同。

表2　有機(jī)酸測(cè)定的線性回歸方程的相關(guān)性

表3　糖測(cè)定的回收率

表4　酸測(cè)定的回收率

2.2藍(lán)莓果實(shí)糖酸組分及含量

圖1　糖混合標(biāo)準(zhǔn)樣的色譜圖Fig.1　Chromatogram of mixed sugar standards 注:1:果糖,2:葡萄糖,3:蔗糖。

2.2.1糖組分含量如圖1所示為糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖,三種糖組分出峰時(shí)間依次為果糖9.357 min、葡萄糖10.181 min和蔗糖12.466 min,上述實(shí)驗(yàn)條件及方法可以很好地分離3種糖。圖2所示為愛國者果實(shí)樣品的色譜圖,果糖和葡萄糖分別在9.238 min和10.028 min出峰,未檢測(cè)到蔗糖。

圖2　果實(shí)樣品色譜圖 Fig.2　HPLC chromatogram of fruit sample 注:1:果糖,2:葡萄糖。

如表5所示,不同藍(lán)莓品種果實(shí)中主要的糖組分均為果糖和葡萄糖,但含量存在一定的差異。這與魏鑫等[10]的研究結(jié)果一致。10個(gè)北美藍(lán)莓品種中,果糖含量在18.916～73.899 mg/g之間,葡萄糖含量在19.194～79.521 mg/g之間。不同品種間兩種糖的含量有明顯差異,北空果實(shí)的果糖和葡萄糖含量最高,分別為73.899 mg/g和79.521 mg/g;友誼、芝妮果實(shí)其次,果糖和葡萄糖含量均在60～70 mg/g之間;伊麗莎白果實(shí)中果糖和葡萄糖含量最低,分別為18.916 mg/g和19.194 mg/g(表5)。

表5　藍(lán)莓果實(shí)糖組分及含量(mg/g)

2.2.2有機(jī)酸組分含量圖3為有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖,五種有機(jī)酸在20 min內(nèi)出峰完畢,出峰時(shí)間依次為草酸6.927 min、奎寧酸8.374 min、蘋果酸10.229 min、維生素C 12.154 min和檸檬酸17.531 min。圖4為愛國者果實(shí)樣品的色譜圖,五種有機(jī)酸均在樣品中檢測(cè)到,依次為草酸6.954 min、奎寧酸8.406 min、蘋果酸10.236 min、維生素C 12.151 min和檸檬酸17.843 min(維生素C含量在檢測(cè)波長為245 nm時(shí)達(dá)到最高)。

表6　藍(lán)莓果實(shí)有機(jī)酸組分及含量(mg/g)

表7　10個(gè)藍(lán)莓果實(shí)品種總糖、總酸含量及其糖酸比

圖3　有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜出峰圖Fig.3　HPLC chromatogram of mixed organic acids standards注:檢測(cè)波長為208、245 nm;1:草酸;2:奎寧酸;3:蘋果酸;4:維生素C;5:檸檬酸;圖4同。

圖4　愛國者藍(lán)莓果實(shí)有機(jī)酸的高效液相色譜出峰圖Fig.4　HPLC chromatogram of Patriot blueberry organic acids

如表6所示,10個(gè)北美藍(lán)莓品種中,有機(jī)酸組分含量最高的是檸檬酸(1.174～15.069 mg/g),奎寧酸、蘋果酸和維生素C含量差別不大,草酸含量最低(0.018～0.046 mg/g)。但北空、美登和愛國者果實(shí)的奎寧酸含量明顯高于其他品種,愛國者果實(shí)中奎寧酸含量最高,達(dá)到3.855 mg/g。布麗吉塔和伊麗莎白果實(shí)的檸檬酸含量明顯高于其他藍(lán)莓品種,說明不同品種間有機(jī)酸組分含量存在較大差別。本實(shí)驗(yàn)中,伊麗莎白果實(shí)檸檬酸含量最高,為15.069 mg/g;美登果實(shí)檸檬酸含量最低,為1.174 mg/g。徐玉濤等[12]對(duì)藍(lán)莓果實(shí)中8個(gè)有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示檸檬酸含量最高,其次為奎寧酸、蘋果酸和草酸,這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

2.3果實(shí)風(fēng)味評(píng)價(jià)

果實(shí)糖酸比和甜酸比均是反應(yīng)果實(shí)風(fēng)味的重要指標(biāo)。不同的糖其甜度和口感不同,果糖最甜,蔗糖次之,葡萄糖再次之,但其口感最佳。因此用糖酸比來體現(xiàn)果實(shí)的口感并不十分準(zhǔn)確,故在此基礎(chǔ)上選用甜酸比來反應(yīng)果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)。如表7所示,本研究中10個(gè)藍(lán)莓品種的糖酸比介于2.342～27.488,甜酸比介于285.953～3393.854,表現(xiàn)為北空>芝妮>圣云>友誼>美登>北陸>藍(lán)光>愛國者>布麗吉塔>伊麗莎白,糖酸比與甜酸比呈正相關(guān)性。北空果實(shí)的甜酸比最高,為3393.854,伊麗莎白果實(shí)的甜酸比最低,為285.953。因此,對(duì)于藍(lán)莓果實(shí)來說,糖酸比和甜酸比均是反應(yīng)果實(shí)口感的重要因素和指標(biāo),但用甜酸比來反應(yīng)果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)則更加準(zhǔn)確。

3　結(jié)論

藍(lán)莓果實(shí)中可溶性糖組分主要為果糖和葡萄糖,有機(jī)酸組分包括草酸、奎寧酸、蘋果酸、維生素C和檸檬酸。不同品種果實(shí)在糖、酸組成及含量上存在明顯的差異。本研究中10個(gè)北美藍(lán)莓品種中果糖和葡萄糖含量分別約占49.72%和50.28%,有機(jī)酸中檸檬酸含量最高,平均占總酸含量的74.48%,其次為奎寧酸,平均約占總酸含量的21.60%,最少的為草酸,平均占總酸含量的0.42%。糖酸比和甜酸比均是影響藍(lán)莓果實(shí)甜酸風(fēng)味的重要因素,但用甜酸比反映果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)更加準(zhǔn)確。10個(gè)品種中果實(shí)甜酸比較高的是北空、芝妮(>3300),最低的是伊麗莎白(<1000)。

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Components and contents of sugar and acid in 10 blueberry cultivars from the North American using HPLC

YU Miao,RUAN Cheng-jiang*,LI He,ZHANG Shao-feng,XU Hong-hao,LIU Xiang-qian

(Resources and Plant Research Institute,College of Environment and Resources, Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)

The sugars and organic acids of ten blueberry cultivars from the North American were analyzed by HPLC(high performance liquid chromatography)method. The results indicated that the soluble sugars in blueberry were fructose and glucose,fructose content was from 18.916～73.899 mg/g,glucose content was from 19.194～79.521 mg/g.The organic acid components in blueberry included oxalic acid,quinic acid,malic acid,vitamin C and citric acid. The content of citric acid was from 1.174 to 15.069 mg/g,much more than others. Oxalic acid content was lowest,from 0.018 to 0.046 mg/g. There were some obvious differences in composition and content of sugar and organic acid among ten blueberry cultivars. Beikong exhibited the highest levels of fructose and glucose in comparison to the others. The berries of Elizabeth contained highest citric acid among all the cultivars. The value of sugars/total acids and sweetness/total acids were important indicator to measure the sweet and sour flavors of blueberry. The sugars/total acids were from 2.342 to 27.488 among ten blueberry cultivars. The sugars/total acids was from 285.953 to 3393.854,and Northsky>Chignecto>St. Cloud>Frendship>Blomidon>Northland>Blueray>Patriot>Brigitta>Elizabeth.

high pressure liquid chromatography(HPLC);blueberry;sugar;organic acid;ratio of sugar to acid

2015-09-29

于淼(1993-),女,碩士,研究方向:植物資源與生態(tài)環(huán)境保護(hù),E-mail:yumiao8574@foxmail.com。

阮成江(1972-),男,博士,教授,研究方向:植物資源與生態(tài)環(huán)境保護(hù),E-mail:ruan@dlnu.edu.cn。

遼寧省自然科學(xué)基金(2014020135);大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃(X201412239)。

TS255.7

A

1002-0306(2016)10-0077-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.006