Gas-6蛋白對小鼠急性肺損傷保護(hù)作用的研究

尹　璐，楊　進(jìn)，汪　影，畢繼蕊，劉　輝，陸友金

Gas-6蛋白對小鼠急性肺損傷保護(hù)作用的研究

尹璐，楊進(jìn)，汪影，畢繼蕊，劉輝，陸友金

目的 研究外源性Gas-6蛋白對脂多糖（LPS）誘發(fā)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。方法 將Balb/c小鼠隨機(jī)分為空白對照組、Gas-6蛋白對照組、LPS處理組、Gas-6蛋白保護(hù)組。LPS處理組、Gas-6蛋白保護(hù)組分別通過腹腔注射LPS誘導(dǎo)急性肺損傷模型，其余組以等量生理鹽水作為對照。而后Gas-6蛋白對照組及Gas-6蛋白保護(hù)組立刻通過尾靜脈注入Gas-6蛋白，其余兩組以等量生理鹽水作為對照。LPS/生理鹽水注射12 h后，取小鼠血清及肺組織。HE染色觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變、測定肺組織病理學(xué)評分、肺組織濕/干質(zhì)量比、檢測血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）水平以及肺組織中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 肺組織病理學(xué)檢查顯示：與空白對照組比較，LPS處理組小鼠肺水腫、肺組織充血、中性粒細(xì)胞浸潤、炎性滲出較明顯，而Gas-6蛋白可減輕上述改變。LPS處理組小鼠肺組織濕/干質(zhì)量比、肺組織病理學(xué)評分、血清中TNF-α、IL-6水平及肺組織中TNF-αmRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)較空白對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護(hù)組上述指標(biāo)較LPS處理組均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 Gas-6蛋白對LPS所誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠有保護(hù)作用。

Gas-6蛋白；脂多糖；急性肺損傷

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.020.html

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是因各種損傷因素導(dǎo)致毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而造成彌漫性肺水腫，其發(fā)病的關(guān)鍵步驟是過度的炎癥反應(yīng)。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的關(guān)鍵成分，參與啟動機(jī)體炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致ALI［1］。Gas-6蛋白屬于維生素K依賴的蛋白家族。研究［2］表明Gas-6蛋白可作用于Tyro-3、Mer、Axl（簡稱TAM）3個(gè)不同的受體酪氨酸激酶，抑制炎癥反應(yīng)。Giangola et al［3］有關(guān)小鼠腎臟缺血/再灌注模型的研究表明，Gas-6蛋白能明顯減輕小鼠腎臟的炎癥反應(yīng)，減輕細(xì)胞凋亡及組織損傷，從而改善小鼠生存率。然而目前尚缺少有關(guān)Gas-6蛋白應(yīng)用于ALI的研究。該研究旨在通過LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型，探討Gas-6蛋白通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對小鼠ALI的保護(hù)作用，為臨床ALI的治療提供新的依據(jù)和思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 10～12周齡雌性Balb/c小鼠32只，20～25 g，SPF級，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材 LPS（E.coli 055：B5）（美國Sigma公司）；Gas-6蛋白（美國R&D Systems公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；RNA提取試劑盒（美國Promega公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；引物合成（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、多聚甲醛、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀（北京國藥集團(tuán)）；微量移液器（德國 Eppendorf公司）。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將32只10～12周齡雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水+生理鹽水）、Gas-6蛋白對照組（生理鹽水+Gas-6）、LPS處理組（LPS+生理鹽水）、Gas-6蛋白保護(hù)組（LPS+Gas-6），每組8只小鼠。LPS（E.coli 055：B5）用生理鹽水配制成濃度為2 mg/ml，Gas-6蛋白按照5μg/200μl溶解于生理鹽水中。LPS處理組和Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠分別腹腔注射20 mg/kg的LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型，其余兩組則腹腔注射等量的生理鹽水。然后Gas-6蛋白對照組和Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠立刻通過尾靜脈注入5μg的Gas-6蛋白，其余兩組分別尾靜脈注入等量生理鹽水。

1.2.2標(biāo)本制備 LPS/生理鹽水腹腔注射12 h后，摘眼球取血，血液收集于1.5 ml EP管中，然后通過頸椎脫臼法處死小鼠?？焖俅蜷_胸腔，取出肺組織。取兩葉右側(cè)肺組織進(jìn)行肺濕/干質(zhì)量比測定；一葉右肺組織4%多聚甲醛固定（室溫），24 h后送入安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行HE染色制備病理切片，光鏡下觀察組織病理變化；余肺經(jīng)0.01%DEPC水漂洗2遍后放入1.5 ml無酶EP管，立即放入-80℃冰箱中保存。血液在1.5 ml EP管中室溫靜置2 h后，3 500 r/min離心20 min后取上清液，迅速將血清移至-80℃冰箱中保存。

1.2.3肺濕/干質(zhì)量比測定 迅速分離小鼠五葉肺組織，取兩葉右側(cè)肺組織后立刻稱重，計(jì)為濕重。然后肺組織置于80℃烘箱中72 h后，再次稱重，計(jì)為干重。濕重/干重為肺濕/干質(zhì)量比。

1.2.4肺組織病理學(xué)變化及評分 取一葉右側(cè)肺組織固定于4%多聚甲醛中，室溫放置24 h后送入安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行HE染色制備病理切片，光鏡下觀察肺組織病理變化。采用Takao et al［4］的方法進(jìn)行病理評分。主要就肺泡及血管壁的中性粒細(xì)胞浸潤、肺充血情況、肺泡間隔增厚程度、肺透明膜的形成等對肺損傷程度進(jìn)行評分。每項(xiàng)指標(biāo)由輕到重評分記為0～4分。并隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行評估，最終將評分匯總，總分代表各組小鼠肺損傷程度。

1.2.5ELISA法檢測小鼠血清TNF-α及IL-6濃度

按照ELISA試劑盒說明書分別檢測血清TNF-a、IL-6濃度。酶標(biāo)儀上450 nm處測吸光度（optical density，OD）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，評估待測品濃度。1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）法檢測小鼠肺組織中 TNF-a mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)情況 每只小鼠分別稱取40 mg肺組織，液氮中碾碎，勻漿器反復(fù)勻漿。然后用美國Promega公司提供的試劑盒提取總RNA。用日本TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄及Script RT-qPCR試劑盒并參照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行qRT-PCR法檢測。從PubMed Genbank中檢索相關(guān)基因序列，由上海生工生物公司進(jìn)行引物設(shè)計(jì)合成。引物序列：TNF-α上游引物：5′-AGACCCTCACACTCAGATCATCTTC-3′，下游引物：5′-TTGCTACGACGTGGGCTACA-3′；IL-6上游引物：5′-ACCACGGCCTTCCCTACTTC-3′，下游引物：5′-CTCATTTCCACGATTTCCCAG-3′；GADPH上游引物：5′-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物：5′-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3′。反應(yīng)條件：95℃、30 s為預(yù)變性階段條件，95℃、5 s，60℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增階段，95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s為溶解曲線階段條件。以GADPH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Turkey檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠肺濕/干質(zhì)量比 經(jīng)LPS、Gas-6蛋白處理后，各組小鼠肺濕/干質(zhì)量比的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.58，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組小鼠肺濕/干質(zhì)量比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS處理組及Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠，肺濕/干質(zhì)量比較空白對照組小鼠均有所升高（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠肺濕/干質(zhì)量比較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。見表1。

表1　經(jīng)LPS及Gas-6蛋白處理后各組小鼠肺濕/干質(zhì)量比、肺組織病理學(xué)評分比較

表1　經(jīng)LPS及Gas-6蛋白處理后各組小鼠肺濕/干質(zhì)量比、肺組織病理學(xué)評分比較

與空白對照組比較：*P＜0.05；與 LPS處理組比較：#P＜0.05

組別肺組織濕/干質(zhì)量比（g/g）肺組織病理學(xué)評分（分）空白對照3.94±0.17　1.23±0.18 Gas-6蛋白對照　3.92±0.22　1.15±0.17 LPS處理　4.51±0.26*　5.95±0.43*Gas-6蛋白保護(hù)　4.22±0.15*#　3.43±0.27*#

2.2各組小鼠肺組織病理學(xué)變化及評分 與空白對照組、Gas-6蛋白對照組比較，經(jīng)LPS處理后的LPS處理組、Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠肺組織病理改變表現(xiàn)為不同程度的肺組織充血、炎性滲出、肺泡壁增厚和破壞、透明膜形成、中性粒細(xì)胞浸潤等。而Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠較LPS處理組小鼠上述情況有所減輕。見圖1。隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行評估，最終將評分匯總，總分代表小鼠肺損傷程度。經(jīng)LPS、Gas-6蛋白處理后，各組小鼠肺組織病理評分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=517.00，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組小鼠肺組織病理學(xué)評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS處理組及Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠肺組織病理學(xué)評分較空白對照組小鼠均有所升高（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠肺組織病理學(xué)評分較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。見表1。

2.3各組小鼠血清TNF-α及IL-6濃度 經(jīng)LPS、Gas-6蛋白處理后，各組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.98、140.20，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS處理組及Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度較空白對照組小鼠均有所升高（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。見圖2。

圖1　經(jīng)　LPS及　Gas-6蛋白處理后各組小鼠肺組織病理學(xué)改變 A：空白對照組；B：Gas-6蛋白對照組；C：LPS處理組；D：Gas-6蛋白保護(hù)組

圖2　ELISA法檢測經(jīng)　LPS及　Gas-6蛋白處理后各組小鼠血清　TNF-α、IL-6濃度1：空白對照組；2：Gas-6蛋白對照組；3：LPS處理組；4：Gas-6蛋白保護(hù)組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與　LPS處理組比較：#P＜0.05

2.4各組小鼠肺組織TNF-α及IL-6 mRNA表達(dá)

經(jīng)LPS、Gas-6蛋白處理后，各組小鼠肺組織TNF-αmRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.23，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組小鼠肺組織TNF-αmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS處理組及Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠肺組織TNF-αmRNA表達(dá)較空白對照組小鼠均有所升高（P＜0.05）。而Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠肺組織TNF-αmRNA表達(dá)較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。各組小鼠肺組織IL-6 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 30.38，P＜0.000 1）。其中空白對照組、Gas-6蛋白對照組、Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠肺組織IL-6 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Gas-6蛋白保護(hù)組小鼠肺組織IL-6 mRNA表達(dá)較LPS處理組小鼠有所降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3　qRT-PCR檢測經(jīng)LPS及　Gas-6蛋白處理后各組小鼠肺組織TNF-αmRNA、IL-6 mRNA表達(dá)1：空白對照組；2：Gas-6蛋白對照組；3：LPS處理組；4：Gas-6蛋白保護(hù)組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與　LPS處理組比較：#P＜0.05

3　討論

ALI是由于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致肺部炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致彌漫性肺水腫；其發(fā)病機(jī)制主要是大量中性粒細(xì)胞及單核-巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)聚集、活化并釋放炎癥因子導(dǎo)致的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。促炎因子主要包括IL-6、TNF-α、IL-17等［5］，在ALI發(fā)生時(shí)，這些炎癥因子被迅速激活，并通過細(xì)胞間信號傳導(dǎo)而放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)ALI的發(fā)展。盡管過去十年中由于保護(hù)性肺通氣策略的應(yīng)用，ALI的死亡率已經(jīng)有所降低［6］。但有研究［7］顯示，美國2007年死于該病的患者約74 500例。而幾項(xiàng)流行病學(xué)研究［8］表明我國ALI病死率高于西方發(fā)達(dá)國家。因此尋求有效治療ALI的方法顯得尤為重要。目前有關(guān)治療ALI的研究主要是圍繞減輕機(jī)體全身和局部的過度炎癥反應(yīng)，肺水腫程度及中性粒細(xì)胞在肺組織間隙的浸潤聚集程度［9］。

Gas-6蛋白是維生素K依賴的蛋白家族成員，廣泛表達(dá)于各類細(xì)胞，主要包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。臨床試驗(yàn)表明肺部感染［10］及急性胰腺炎［11］患者血漿Gas-6蛋白水平較正常組升高。Gas-6蛋白濃度與系統(tǒng)性紅斑狼瘡［12］、膿毒血癥［13］的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后成正相關(guān)。Alciato et al［14］的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則表明Gas-6蛋白可抑制單核/巨噬細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α等炎癥因子。以上研究均表明Gas-6蛋白可能在機(jī)體的炎癥反應(yīng)發(fā)展過程中發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究通過腹腔注射LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型，尾靜脈注射Gas-6蛋白證明其對小鼠ALI有一定保護(hù)作用。相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)及病理觀察表明，LPS處理的ALI小鼠較對照組小鼠出現(xiàn)血清及肺組織炎癥指標(biāo)上升，肺濕/干質(zhì)量比及肺組織病理學(xué)評分升高。并出現(xiàn)彌漫性肺水腫、肺組織充血、中性粒細(xì)胞浸潤、炎性滲出、透明膜形成等病理損傷。而Gas-6蛋白可減輕炎癥反應(yīng)、肺水腫程度及病理損傷。

綜上所述，Gas-6蛋白通過抑制全身及局部炎癥反應(yīng)，減輕彌漫性肺水腫，發(fā)揮對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的保護(hù)作用，為臨床ALI的治療提供新思路。目前認(rèn)為Gas-6蛋白抗炎作用的發(fā)揮與TAM有關(guān)，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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The protective effect of Gas-6 protein on murine acute lung injury

Yin Lu，Yang Jin，Wang Ying，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the effectof exogenous Gas-6 protein on LPS-induced acute lung injurymice. Methods Balb/c mice were randomly divided into control group，Gas-6 protein control group，LPS-treated group and Gas-6 protein protection group.LPSwas administered to inducemurine acute lung injurymodel by intraperitoneal injection in LPS-treated group and Gas-6 protein protection group，while the other groups used normal saline. Then Gas-6 protein was intravenously injected in Gas-6 protein control group and Gas-6 protein protection group at once，while the other groups used normal saline.12 hours after LPS/normal saline injection，serum and lung tissue ofmice were obtained.HE staining was used to observe pathological changes in the lung tissue ofmice.The lung pathological score，lung tissue wet-to-dry weight ratio，the levels of TNF-αand IL-6 in serum，the expression of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in lung tissue were analyzed at the same time.Results The pathological results showed that the degrees of pulmonary edema，lung congestion，neutrophil infiltration，inflammatory exudate of the LPS-induced group weremore serious than the control group.However，the Gas-6 protein could reduce the changes.Compared with the control group，the lung pathological score，lung tissuewet-to-dry weight ratio，the levels of TNF-αand IL-6 in serum，the expression of TNF-αmRNA and IL-6mRNA in lung tissue of the LPS-induced group were significantly increased（P＜0.05）.However，the index of the Gas-6 protein protection group was lower than the LPS-induced group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Gas-6 protein has protective effect on acute lung injury induced by LPS in mice.

Gas-6 protein；LPS；acute lung injury

◇預(yù)防醫(yī)學(xué)研究◇

R 563.8

A

1000-1492（2016）05-0655-05

2016-02-22接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81400058）；安徽高校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號：KJ2013Z154）

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥 230601

尹 璐，女，碩士研究生；

陸友金，男，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，Email：luyougolden@ hotmail.com