多重實(shí)時PCR檢測腹膜透析相關(guān)性腹膜炎致病菌的應(yīng)用分析

燕雯雯，沈繼錄，李曉峰，吳永貴

多重實(shí)時PCR檢測腹膜透析相關(guān)性腹膜炎致病菌的應(yīng)用分析

燕雯雯1，沈繼錄2，李曉峰1，吳永貴1

目的 探討多重實(shí)時PCR（RT-PCR）檢測腹膜透析相關(guān)性腹膜炎（PDAP）致病菌的應(yīng)用價值。方法 收集70例患者的腹透液標(biāo)本，分別行傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)與熒光染料法細(xì)菌通用引物RT-PCR檢測。根據(jù)70例樣本培養(yǎng)結(jié)果及相關(guān)參考文獻(xiàn)，選取最常見的6種PDAP致病菌作為檢測菌，設(shè)計各檢測菌特異引物，分別采用單一及多重?zé)晒馓结樂≧TPCR，針對通用RT-PCR法檢出的陽性樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果

70例標(biāo)本中傳統(tǒng)培養(yǎng)46例陽性，陽性率為65.71%；通用RT-PCR法57例陽性，陽性率為81.43%，兩種檢測方法陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在6種常見致病菌檢測中，對通用RT-PCR法檢出的57例陽性樣本行單一及多重RT-PCR檢測，兩者均檢出38例樣本在6種檢測菌范圍內(nèi)，兩種方法檢測結(jié)果一致，1例RT-PCR結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果不符，剩余19例菌種在6種檢測菌范圍以外。通用RT-PCR可在4～6 h內(nèi)明確是否存在細(xì)菌感染；針對6種致病菌的檢測，單一RT-PCR可在6～9 h內(nèi)完成，多重RT-PCR僅需3 h即可明確菌種。結(jié)論 與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，RT-PCR方法有較高靈敏性和特異性，多重RT-PCR因可同時檢測多種致病菌，較單一RT-PCR更加迅速、簡便、經(jīng)濟(jì)。

腹膜透析相關(guān)性腹膜炎；致病菌；實(shí)時熒光PCR；傳統(tǒng)培養(yǎng)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.046.html

腹膜透析相關(guān)性腹膜炎是腹膜透析最常見的急性并發(fā)癥及患者退出的重要原因。2010年國際腹膜透析協(xié)會指南（ISPD）認(rèn)為血培養(yǎng)為腹膜透析相關(guān)性腹膜炎（peritoneal dialysis-associated peritonitis，PDAP）明確致病菌的最佳方式，單中心培養(yǎng)陰性率不應(yīng)高于20%［1］；而我國目前培養(yǎng)陽性率僅50.7%～69.9%［2-3］，遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)。因此，如何快速、精準(zhǔn)的檢出致病菌是PDAP診療的關(guān)鍵問題之一。實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是目前用于病原菌檢測的最熱門技術(shù)之一，有高靈敏度、特異性強(qiáng)、快速、簡便以及可定量模板濃度等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛的應(yīng)用于生物遺傳、基因診斷、微生物分型鑒定等多個領(lǐng)域，并取得良好效果［4-6］。該實(shí)驗(yàn)旨在通過RT-PCR與傳統(tǒng)培養(yǎng)在PDAP致病菌檢出率的對比及單一、多重RT-PCR對PDAP常見的6種致病菌檢出率的對比分析，初步探討多重RT-PCR在臨床檢測PDAP致病菌中的應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1.1病例資料 收集2014年1月～2015年7月因PDAP入住安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科的患者腹透液標(biāo)本。參照2010年ISPD指南［1］，符合以下3條標(biāo)準(zhǔn)中的2條即可診斷為腹膜炎：①腹痛、腹透出液渾濁、伴或不伴發(fā)熱；②透出液中白細(xì)胞計數(shù)大于100×106/L，中性粒細(xì)胞比例大于0.50；③透出液中培養(yǎng)有病原微生物生長。滿足①與②診斷標(biāo)準(zhǔn)者作為本研究病例共70例，其中男33例，女37例，年齡18～73（49.94±13.11）歲，透析齡1～171（43.94±31.95）個月。

1.2方法

1.2.1傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng) 可疑PDAP患者入院時即刻抽取腹透流出液（以首袋出現(xiàn)渾濁的透出液最佳，6 h內(nèi)送檢），送檢腹透液常規(guī)，同時用血培養(yǎng)瓶（需氧及厭氧）留取透出液16～20 ml送檢細(xì)菌培養(yǎng)。另留取250 ml透出液分裝并行離心（4 000 r/ min、10 min）處理，棄上清液，保留沉淀分裝至1.5 m l無菌離心管中，置于-80℃冰箱保存用于后續(xù)模板DNA制備。

1.2.2腹透液細(xì)菌DNA提取 按照HiPure Plasmid EF Micro Kit微量 DNA提取試劑盒操作步驟從標(biāo)本中提取細(xì)菌DNA，用無菌雙蒸水溶解后，用紫外線分光光度儀測吸光度（optical density，OD），計算OD260/OD280，在1.7～2.0范圍內(nèi)，說明DNA純度較高。

1.2.3通用RT-PCR實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［7］，針對細(xì)菌16SrRNA基因保守片段，選用一對通用引物，上游引物序列為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列為：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。使用SYBR Green 1熒光染料法進(jìn)行檢測，設(shè)立金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取液為陽性對照，無菌DEPC水為陰性對照，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)孔以驗(yàn)證可重復(fù)性。反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；循環(huán)反應(yīng)：95℃、10 s，60℃、33 s（收集熒光，循環(huán)40次）；溶解曲線：95℃、15 s，60℃、60 s，95℃、15 s（收集熒光）。結(jié)果判定：在對照孔表達(dá)良好的前提下，熒光信號存在指數(shù)擴(kuò)增期，且陽性擴(kuò)增信號的最小拷貝數(shù)（CT值）≤32及溶解曲線呈現(xiàn)單峰，則判為PCR陽性。

1.2.4單一RT-PCR實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［8-10］及本實(shí)驗(yàn)病例培養(yǎng)結(jié)果，確立6種細(xì)菌作為檢測菌種，使用熒光探針法PCR進(jìn)行檢測，熒光探針法試劑購自常州博聞迪醫(yī)藥科技有限公司（各菌種引物及探針序列見表1），設(shè)立含各試驗(yàn)菌種靶基因片段的質(zhì)粒為陽性對照，無菌DEPC水為陰性對照，反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)步驟設(shè)置如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，58℃復(fù)性延伸40 s（收集熒光，循環(huán)40次）。結(jié)果判定：在對照孔表達(dá)良好的前提下，熒光信號若存在指數(shù)擴(kuò)增期，且Ct值≤37則判為PCR陽性。

1.2.5多重RT-PCR實(shí)驗(yàn) 將6種檢測菌分為兩組：表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和溶血性葡萄球菌為一組，草綠色鏈球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為一組。針對6種細(xì)菌分別設(shè)計一對通用引物及熒光探針（表2）。按上述分組行多重RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，建立適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。設(shè)立含各細(xì)菌靶基因片段質(zhì)粒為陽性對照，無菌DEPC水為陰性對照，反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)步驟設(shè)置如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃復(fù)性延伸32 s（收集熒光，循環(huán)50次）。結(jié)果判定：在對照孔表達(dá)良好的前提下，相應(yīng)熒光通道收集的熒光信號出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增期，且Ct值≤37則判為PCR陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以ˉx±s表示，計數(shù)資料采用配對Χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1傳統(tǒng)培養(yǎng) 70例樣本中，腹透液培養(yǎng)的陽性率為 65.71%（46/70），革蘭陽性球菌占71.74%（33/46），革蘭陰性桿菌占28.26%（13/46）；其中表皮葡萄球菌9例、金黃色葡萄球菌3例、溶血葡萄球菌10例、草綠色鏈球菌6例、大腸埃希菌5例、銅綠假單胞菌3例、肺炎克雷伯桿菌2例，頭部葡萄球菌頭部亞種、屎腸球菌、華納葡萄球菌、腐生葡萄球菌、解沒食子酸鏈球菌、產(chǎn)酸克雷伯桿菌、少動鞘氨醇單胞菌、深紅沙雷氏菌均為1例。

表1　單一　RT-PCR各試驗(yàn)菌種引物及探針序列

表2　多重　RT-PCR各試驗(yàn)菌種引物及探針序列

2.2單一及多重RT-PCR

2.2.1通用 RT-PCR 70例樣本中，通用RT-PCR檢出57例陽性；46例培養(yǎng)陽性的樣本中RT-PCR檢出44例陽性，2例陰性；24例培養(yǎng)陰性的樣本中，通用RT-PCR檢測出13例陽性，11例為陰性；以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，通用RT-PCR陽性率為 81.43%（57/ 70），敏感性為95.65%（44/46），特異性為45.83%（11/24），假陽性率54.17%（13/24），假陰性率4.34%（2/46），行Χ2檢驗(yàn)，兩者陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007）。擴(kuò)增曲線見圖1。

2.2.2單一RT-PCR 針對通用RT-PCR檢出的57例陽性樣本，行單一RT-PCR檢測，檢出38例樣本菌種在6種檢測菌范圍內(nèi)，1例與培養(yǎng)結(jié)果不符；19例單一RT-PCR檢測未明確致病菌。部分?jǐn)U增曲線見圖2、3。

2.2.3多重RT-PCR 針對通用RT-PCR檢出的57例陽性樣本，行多重RT-PCR檢測，檢出38例樣本菌種在6種檢測菌范圍內(nèi)，1例與培養(yǎng)結(jié)果不符；19例多重RT-PCR檢測未明確致病菌。本實(shí)驗(yàn)中6種檢測菌的分布與單一RT-PCR檢測結(jié)果一致，其中表皮葡萄球菌11例、金黃色葡萄球菌3例、溶血性葡萄球菌10例、草綠色鏈球菌6例、大腸埃希菌5例、銅綠假單胞桿菌3例；部分?jǐn)U增曲線見圖4。

3　討論

目前檢測PDAP致病菌的主要方式為血培養(yǎng)，盡管培養(yǎng)法較為準(zhǔn)確，但耗時長，敏感性低，易受細(xì)菌生理條件、數(shù)量和抗生素使用等限制，致使常規(guī)培養(yǎng)陽性率較低。傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率為65.71%，其中革蘭陽性球菌占71.74%，仍以表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等為主，這與其他腹透中心近幾年P(guān)DAP培養(yǎng)陽性率及細(xì)菌分布基本相符［9-10］，但仍遠(yuǎn)低于ISPD指南中陽性率大于80%的建議。臨床上在明確致病菌前，先給予經(jīng)驗(yàn)性廣譜抗生素治療，但對于PDAP最佳初始治療方案的選擇目前國際上暫無明確共識［11］；且長時程的超廣譜抗菌素的使用可能改變細(xì)菌耐藥性、增加二重感染及腹膜硬化等風(fēng)險。如何快速靈敏的檢出致病菌，指導(dǎo)抗生素的使用，是及時控制感染、保護(hù)腹膜功能的關(guān)鍵。

圖1　腹透液樣本通用　RT-PCR擴(kuò)增圖

圖2　表皮葡萄球菌陽性樣本單一　RT-PCR擴(kuò)增曲線

圖3　金黃色葡萄球菌陽性樣本單一RT-PCR擴(kuò)增曲線

圖4　腹透液樣本多重　RT-PCR擴(kuò)增曲線

PCR對于病原微生物的檢測不依賴于微生物表型標(biāo)記、酶學(xué)等方法，而是直接對于微生物保守基因片段進(jìn)行特異擴(kuò)增，因此更加快速靈敏特異。實(shí)驗(yàn)中70例樣本，通用RT-PCR陽性率為81.43%，與傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率比較，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以傳統(tǒng)培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，通用RT-PCR敏感性為95.65%，特異性為 45.83%，具有較高的靈敏度。且通用RT-PCR在4～6 h內(nèi)即可明確有無細(xì)菌感染，較傳統(tǒng)培養(yǎng)耗時明顯縮短。實(shí)驗(yàn)中，對于46例培養(yǎng)陽性的樣本中有2例通用RT-PCR反復(fù)檢測3次均為陰性，考慮可能在培養(yǎng)過程中樣本被污染，或在樣本原液保存、DNA提取及保存過程中DNA被破壞、分解，亦或是樣本中存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，在細(xì)菌DNA被提取后該抑制作用仍然存在。有文獻(xiàn)［12-13］報道，在血液、糞便、尿液中存在PCR反應(yīng)的抑制物，如脂多糖、肝素能干擾Taq聚合酶的作用；這種抑制可減小PCR的靈敏度，提高假陰性結(jié)果；改變樣本保存溫度、模板DNA濃度及提取方法可減少抑制作用，但不能完全消除。對于24例培養(yǎng)陰性的樣本，有13例通用RT-PCR陽性，這可能與PCR技術(shù)的高靈敏度相關(guān)，在樣本所含的細(xì)菌量極少時，傳統(tǒng)培養(yǎng)檢出的難度增大，但PCR通過指數(shù)擴(kuò)增可檢出含量極少的細(xì)菌。此外，其還可對已使用過抗生素樣本、苛養(yǎng)菌、疑難菌株、死菌、生化反應(yīng)及形態(tài)改變的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。因熒光染料法PCR無特異性，只要出現(xiàn)擴(kuò)增即可收集到熒光，若操作過程中有極少量的DNA、氣溶膠等污染均可出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，提高假陽性率；但暫無更為有效的檢驗(yàn)手段，用以明確這13例樣本是否存在假陽性的可能。

與染料法PCR不同的是探針法PCR在保證普通PCR高靈敏度的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中添加了探針，增加了實(shí)驗(yàn)的特異性，用于鑒定細(xì)菌種類比染料法更為可靠。在探針法PCR的57例樣本中，兩種RT-PCR均檢出38例樣本，其中1例傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果為金黃色葡萄球菌，RT-PCR結(jié)果為溶血性葡萄球菌，考慮可能在樣本培養(yǎng)過程中混入金黃色葡萄球菌，大量繁殖并作為優(yōu)勢菌抑制其他細(xì)菌生長所致；其余19例樣本可能因?qū)嶒?yàn)檢測范圍較窄，致病菌種類不在檢測范圍內(nèi)，后期實(shí)驗(yàn)中可擴(kuò)大菌群檢測范圍，以便更大程度上明確菌種。該試驗(yàn)中單一RT-PCR完成6種致病菌檢測所用時間為6～9 h，而多重RT-PCR僅需2～3 h即可完成。且單一RT-PCR需對同一樣本反復(fù)檢測，不但工作量大幅增加，檢測周期延長，同時增加了失誤概率及樣本污染、樣品生物危害等風(fēng)險，對檢測結(jié)果的可靠性亦有影響［14］。多重RT-PCR雖在時效性及操作簡便等方面有明顯優(yōu)勢，但其要求多個不同靶基因片段同時擴(kuò)增，因而在引物設(shè)計、反應(yīng)條件的優(yōu)化、反應(yīng)體系的配置等環(huán)節(jié)均需反復(fù)試驗(yàn)，建立最佳反應(yīng)條件，以期最大程度上避免非特異性擴(kuò)增及片段間的競爭性擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)高效靈敏、特異性強(qiáng)的擴(kuò)增反應(yīng)，具有一定難度。

與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，RT-PCR技術(shù)鑒定病原菌具有較高的靈敏度，且檢測周期明顯縮短。多重RT-PCR因可同時檢測多種致病菌，比單一RT-PCR檢測更迅速、簡便，且更節(jié)約成本；在PDAP細(xì)菌鑒定中有一定的臨床應(yīng)用價值，有望與傳統(tǒng)培養(yǎng)相結(jié)合成為全面、客觀認(rèn)識PDAP致病菌的新途徑。

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Application analysis ofmultiplex real-time PCR assays for detection of pathogenic bacterium in peritoneal dialysis-associated peritonitis

Yan Wenwen1，Shen Jilu2，Li Xiaofeng1，et al
（1Dept of Nephrology，2Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To estimate the clinical value of bacterial detection in peritoneal dialysis-associated peritonitis（PDAP）by multiplex real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）.Methods Seventy peritoneal dialysate specimenswere collected，conventional bacterial culture and SYBR Green RT-PCR detection of the bacterial universal primerswere used respectively.According to references and the bacterial culture results of these 70 specimens，six common bacteria of PDAP were selected in this assay，multiplex and monoplex RT-PCR were used respectively to exam the positive specimens by SYBR Green RT-PCR detection.Results The positive rate of traditional culture among the 70 caseswas65.71%.The SYBR Green RT-PCR detection results showed that70 specimens total positive rate was 81.43%，and there was statistical difference between the twomethods（P＜0.05）.In the detection of these 6 common pathogenic bacteria，both multiplex and monoplex RT-PCR assays found 38 cases of positive samples among the 57 specimens detected by SYBRGreen RT-PCR.The results of the twomethodswerecompletely identical.One of the positive samples examined by RT-PCR was different form classical bacterial culture，and the remaining 19 cases failed to clear strains of pathogenic bacteria.SYBRGreen PCR for detecting pathogenic bacteria could show results in 4～6 hours，and in the experiments of the 6 common bacteria，monoplex RTPCR could be finished in 6～9 hours，butmultiplex RT-PCR just needed atmost3 hours.Conclusion Compared with the traditional culturemethod，all of the three RT-PCR assays are sensitive，specific，and more rapidly.The multiplex RT-PCR can detect several kinds of bacteria simultaneously，bemore practical，convenient and economical than that of themonoplex RT-PCR.

peritoneal dialysis-associated peritonitis；pathogenic bacteria；real-time polymerase chain reaction；bacteria cultures

R 459.51；R 372

A

1000-1492（2016）05-0712-06

2016-02-22接收

安徽省自然科學(xué)基金資助（編號：1408085MH183）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，合肥 230022

燕雯雯，女，碩士研究生；

吳永貴，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wuyonggui@medmail.com.cn