多粘類芽孢桿菌GA1產(chǎn)絮凝劑的培養(yǎng)基和分段培養(yǎng)工藝

趙丹丹

微生物絮凝劑是近年來的一種新型水處理劑，是由產(chǎn)絮凝劑微生物在其生長的過程中素分泌出來的一種天然的高分子物質(zhì)，其具有較強的清除污漬、褪色的能力，能夠應用的范圍十分廣泛。與傳統(tǒng)的無機絮凝劑與高分子合成的絮凝劑，其降解的速度較慢，同時還會釋放一定的毒素，容易造成環(huán)境的二次污染。但是微生物絮凝劑具有無毒易降解的特點，使用時不會對環(huán)境造成二次污染。

就目前而言，關于微生物絮凝劑的相關分析與研究大多都是通過實驗來進行驗證的，并沒有投入到實際的工業(yè)化生產(chǎn)階段。由于微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本較好且產(chǎn)量較低，進而其價格較高，在大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中難以推廣。聽此，降低微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本及提高其生產(chǎn)的產(chǎn)量就是微生物絮凝劑近期內(nèi)發(fā)展的方向，也是開展大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵。據(jù)此，本研究就針對1株產(chǎn)絮凝劑微生物多粘類芽孢桿菌GAI的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)的工藝方面入手，運用分段培養(yǎng)法來進行培養(yǎng)并觀察，看其能否有效地提升絮凝劑產(chǎn)量及縮短生產(chǎn)的周期。

多粘類芽孢桿菌GA1產(chǎn)絮凝劑的培養(yǎng)基和分段培養(yǎng)工藝試驗

材料與方法。（1）試驗菌種：本試驗所采用的菌種為實驗室中常用的常規(guī)細菌分離發(fā)從土壤中提取的1株高效產(chǎn)絮 凝劑微生物，其編號為GAI。（2）菌種鑒定：①形態(tài)學鑒定，即將菌株GAI使用革蘭氏染色和芽孢染色，并通過在顯微鏡下觀察其菌落、菌體的形態(tài)所發(fā)生的變化。②生理生化鑒定，即對菌株GAI的生理生化指標進行檢測，并將其結(jié)果與《伯杰細菌分類手冊》中的相關標準進行對比與鑒定。③16S r DNA 序列相似性分析鑒定。該鑒定就是將GAI放置到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，對其進行24小時的培養(yǎng)，而后再挑取少許的菌落置于500 mL的蒸餾水中，并使用DNA試劑來提取相關性狀。（3）種子培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)液：種子培養(yǎng)基中包含蛋白胨30 g/L、牛肉膏 5 g/L、NaC1 7 g/L，同時其p H 值為7，并進行0.1Mpa下的30分鐘的殺菌處理。同時在GA1培養(yǎng)面上選取一些菌落，并將其裝到由種子培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)。在溫度為30攝氏度、速度為200 r/min的搖床中進行24小時的培養(yǎng)，則其中細菌的濃度將會達到 1.0×10 CFU/m L.進而就形成了 GA1產(chǎn)絮凝劑的種子培養(yǎng)液。（4）產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基及培養(yǎng)過程：產(chǎn)絮凝劑的培養(yǎng)基中包含40g/L葡萄糖、K2HPO4 10 g/L、KH2PO4 4.0 g/L、NaC10.4 g/L、（NH4）2SO4 0.3 g/L、脲0.6 g/L、酵母浸膏0.2 g/L、Mg SO4 0.1 g/L，與此同時，培養(yǎng)基的p H值為8，并進行0.07Mpa的40min滅菌處理。除此之外，還要在溫度為30攝氏度、搖床的速度為250 r/min的條件下，在所制成的種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時。（5）絮凝劑的提取方法：通常情況下，菌株 GA1產(chǎn)絮凝劑的水平由絮凝劑的產(chǎn)量來進行衡量的。因此，將菌株 GA1的培養(yǎng)液在5000 r/min下進行離心轉(zhuǎn)30min，并收集上層的清液，而后加入到體積比為2：1的預冷無水丙酮中。并放置在6℃的冰箱中進行沉淀，其過程需要24h，能夠使產(chǎn)生的沉淀穩(wěn)定下來。帶沉淀穩(wěn)定下后，使用離心率為6000r/min，對其進行收集，并使4℃的無水乙醇對其進行數(shù)次的脫水。同時在脫水的過程中需要將相關的沉淀進行碾磨，使其成為粉碎狀。再對其進行真空與干燥的處理，就會得到絮凝劑的粗產(chǎn)品，其呈現(xiàn)黃色粉末狀。這種絮凝劑的絮凝活性非常高，當添加的量達到 0.4 g/L時，其懸浮液絮凝率可以達到 94%以上。（6）菌體生長的測定：對于菌體生長情況的測定，可以通過對細胞的干重進行測量，來判斷菌體的生長情況。因此，就需要在速度為5000r/min中將培養(yǎng)液進行30分鐘的離心培養(yǎng)，而后將其沉淀物用蒸餾水清洗，再進行離心。重復這項工作至少2次，最后再在100℃下烘干至恒重。

結(jié)果與討論。（1）菌種鑒定：①形態(tài)學特征。該菌株在牛肉膏蛋白胨固體瓊脂培養(yǎng)基上，其菌落沒有呈現(xiàn)規(guī)則狀擴散形態(tài)，同時在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上，其菌落呈現(xiàn)半透明、隆起、粘稠的形態(tài)。②生理生化鑒定。該菌株為化能異養(yǎng)，能夠利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生酸、氣，接觸酶呈現(xiàn)陽性，進行淀粉水解，VP試驗也顯示為陽性，同時也不產(chǎn)生吲哚。這些現(xiàn)象依照《伯杰氏細菌鑒定手冊》的相關標準對照，可以初步斷定其為芽孢桿菌屬。③16S r DNA 序列相似性分析。通過使用通用引物 27F和 1495R 對提取到的GA1菌株的DNA樣品進行檢測，能夠得到16S r DNA 的測序結(jié)果為：通過Blastn同源性檢索，其結(jié)果為該菌株的16S r DNA 與 Paenibacillus polymyxa的16S r DNA 最為相似，可以達到99%的相似度。因此可以認為菌株 GA1為多粘類芽孢桿菌。（2）碳源和氮源對GA1產(chǎn)絮凝劑的影響：在GAI產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基與其他條件都相同的情況之下，用不同的碳源與氮源來對培養(yǎng)基中的相關培養(yǎng)成分進行替換，其絮凝劑的產(chǎn)量與菌體生長的產(chǎn)量也是不同的。如圖1、2所示。

由圖1可知，GA1能夠利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等來完成絮凝劑的制作，并且由圖可知采用蔗糖來制作的效果是最好的。由圖2可以看出，GAI在有酵母浸膏、牛肉膏復雜有機氮源時，其絮凝劑的產(chǎn)量是最高的。而在硫酸銨、硝酸鉀等無機氮源以及簡單有機氮源的條件下，其菌體的生長情況是最好的。因此，我們可以得出，蔗糖是產(chǎn)絮凝劑的最好碳源，酵母浸膏是最好的氮源。（3）分段培養(yǎng)工藝：綜合GAI菌體最佳的生長環(huán)境和最佳產(chǎn)絮凝劑的條件，可以將整個培養(yǎng)的過程分為兩個部分，培養(yǎng)初期的24h內(nèi)以及培養(yǎng)后期的48h。在剛開始培養(yǎng)的24小時內(nèi)的環(huán)境是菌體生長的最好條件環(huán)境，而在培養(yǎng)最后的48小時的環(huán)境是菌體產(chǎn)絮凝劑的最佳培養(yǎng)條件。下圖3為：在不同的培養(yǎng)方式條件下，GAI菌體產(chǎn)絮凝劑和菌體生長的相關示意圖。

據(jù)圖3所示，在30攝氏度的溫度中，速度為 150 r/min搖床的條件下，菌體達到了最快的生長，但是與此同時，菌體在生長時消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，因而其絮凝劑的產(chǎn)量比較低。在25℃，搖床速度為100 r/min的條件下，絮凝劑的產(chǎn)量最高，但同時其絮凝劑生產(chǎn)的周期卻比較長。因此，使用分段培養(yǎng)的方法能夠有效地解決菌體生長與產(chǎn)量之間的問題，盡可能的保證絮凝劑與培養(yǎng)周期之間的平衡。

結(jié)論

以蔗糖作為碳源、酵母浸膏作為氮源時，是多粘類芽孢桿菌GA1產(chǎn)絮凝劑的最佳情況。

采用分段培養(yǎng)工藝，將整個培養(yǎng)過程分為2段。在培養(yǎng)的初期24h內(nèi)，在30攝氏度、150 r/min的搖床速度。以及在培養(yǎng)后期溫度為25攝氏度，搖床速度為100 r/min的48小時內(nèi)。初次之外，使用分段培養(yǎng)法能制造出盡可能多的絮凝劑，使其產(chǎn)量得以最大的保障。

（作者單位：馬鞍山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所）