烏梅丸治療潰瘍性結(jié)腸炎方證相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

盧賀起，張 玲，岳廣欣，劉麗梅，王瑞海，陳 琳

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

中醫(yī)研究中的方證相應(yīng)研究，特別是動(dòng)物中的實(shí)驗(yàn)研究一直是中醫(yī)基礎(chǔ)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，如何認(rèn)識(shí)、研究都是亟待探索的領(lǐng)域之一［1］。本實(shí)驗(yàn)選擇中醫(yī)臨床中治療潰瘍性結(jié)腸炎療效明確的經(jīng)典名方烏梅丸及加味方做對(duì)象，觀察實(shí)驗(yàn)性大鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、化學(xué)性刺激模型和免疫化學(xué)性復(fù)合模型中，研究對(duì)象對(duì)炎癥相關(guān)因子IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子 TNFα和 PGE2因子及細(xì)胞間黏附因子(ICAM-1)的影響，初步探討其治療效果中中醫(yī)方證相應(yīng)的內(nèi)涵或依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康SD清潔級(jí)大鼠120只，均為雄性，體重250g±20g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)所清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物

烏梅丸按《傷寒論》、七味白術(shù)散按《小兒藥證直訣》、芍藥湯按《素問病機(jī)氣宜保命集》組成藥味。藥液制備按常規(guī)煎煮去渣，煎液濃縮制成含生藥2g/ml的水煎液;中藥番瀉葉同法制成0.4g/ml濃度的水煎液。柳氮磺胺吡啶(SASP)為上海三維長(zhǎng)江生化制藥廠產(chǎn)品，批號(hào)20080907。

1.3 試劑和試劑盒

麻醉劑戊巴比妥鈉配1% 濃度(批號(hào)020919，德國(guó)進(jìn)口分裝);軟皂液:0.5% 濃度(撫順化工一廠，批號(hào)920605);乙酸配8%濃度。脫毛劑:取BaS.10g加100ml蒸餾水，用適量面粉調(diào)成糊狀，(BaS:面粉 =1∶2)。致敏劑Ⅰ:2.4-二硝基氯苯(DNCB天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，化學(xué)純)1g加100ml丙酮;致敏劑Ⅱ:2.4-二硝基氯苯(DNCB)1g加100ml95%乙醇。IL-6、IL-10、TNFα、PGE2的檢測(cè)試劑盒為美國(guó) SUNBIO公司產(chǎn)品，批號(hào)090108、0901081、0903021、0903607 等。

1.4 主要儀器

電子天平，AR2130梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司制造;酶標(biāo)儀，MK3型 Thermo(上海)儀器有限公司;洗板機(jī)4MK2型，熱電(上海)儀器有限公司;離心機(jī) LXJ-ⅡB型，上海安亭科學(xué)儀器廠;MPT電泳和MTB轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，BioRAD公司產(chǎn)品等。

2 方法

2.1 大鼠潰瘍性結(jié)腸炎化學(xué)性刺激模型的制備

2.1.1 模型制備 將SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥對(duì)照組、烏梅丸組、烏梅丸加七味白術(shù)散組、芍藥湯組共6組。在實(shí)驗(yàn)第2天正常組給水，其他組給番瀉葉1ml/100g灌服，連續(xù)3d。在第3天所有組腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉(25mg/kg)，之前24h禁食給水，再用0.5%軟皂液2.5ml/只洗腸，1h后以直徑3mm導(dǎo)尿管經(jīng)肛門插入結(jié)腸8cm處，正常組注入生理鹽水，其他組肛門注入8%乙酸1ml/只，倒置30s均不沖洗放回籠中。每天觀察大鼠大便性狀、飲食、毛發(fā)、活動(dòng)狀態(tài)等，可以看到大鼠逐漸產(chǎn)生典型UC活動(dòng)期癥狀。給藥方法:各中藥組每組每只大鼠分別用以上配制的烏梅丸液、烏梅合七味白術(shù)散液、芍藥湯1ml/100g灌胃;SASP組:每只大鼠用SASP混懸液0.9ml/100g灌胃;模型組、正常組:每只大鼠均以蒸餾水1ml/100g灌胃，以上均每天1次，連續(xù)給藥7d。

2.1.2 樣品采集與檢測(cè) 采樣當(dāng)天分別斷頭處死全部動(dòng)物，在冰浴下取整段結(jié)腸(6cm～8cm)縱向剪開，距肛門6cm處取0.5cm長(zhǎng)的結(jié)腸，制成0.1g/ml生理鹽水組織勻漿液，以4℃、12500r/min離心15min，取上清液置于－78℃冰箱凍存待測(cè)。測(cè)定 IL-6、IL-10、TNFα 和 PGE2，均采用 ELISA 試劑盒檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒使用說明進(jìn)行。

2.2 大鼠潰瘍性結(jié)腸炎免疫化學(xué)性復(fù)合模型的制備

2.2.1 動(dòng)物分組同上。將大鼠頸背部用脫毛液脫毛后，以1%DNCB丙酮液0.25ml滴背，1次/d，連續(xù)14d。在第15天正常組給水，其他各組給番瀉葉灌胃，1ml/100g連續(xù)3d，在第18天所有組禁食給水24h后麻醉，洗腸同上。正常組注入95%乙醇，其他組注入1%DNCB乙醇0.25ml/只，1h后注入8%乙酸1ml/只，倒置30s均不沖洗放回籠中。再飼養(yǎng)15d，每天觀察大鼠大便性狀、飲食、毛發(fā)、活動(dòng)狀態(tài)等，待到大鼠逐漸產(chǎn)生典型明顯的UC活動(dòng)期癥狀。給藥方法同上，連續(xù)給藥15d。

2.2.2 樣品采集與檢測(cè) 樣品采集和檢測(cè)方法同上。

2.2.3 細(xì)胞間黏附因子(ICAM-1)的檢測(cè)方法

于采樣時(shí)在冰浴下剪開同一結(jié)腸組織取約0.5g后，將其至于冰浴上剪碎，放于1ml裂解液中，進(jìn)行組織研磨，呈乳狀后統(tǒng)一離心。條件:4℃ 20min 12500r/min。每個(gè)樣品取0.5ml上清液4℃冰箱放置。樣品蛋白定量，步驟按試劑盒要求進(jìn)行，統(tǒng)一調(diào)整蛋白濃度。電泳分離、轉(zhuǎn)印和檢測(cè)樣品:選Actin為內(nèi)參，采用化學(xué)發(fā)光法成像，再通過成像儀計(jì)算各組的成像素，用像素值的高低反映ICAM-1表達(dá)的強(qiáng)弱。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0版軟件處理其數(shù)據(jù)資料，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析結(jié)合q檢驗(yàn)，如是計(jì)數(shù)資料應(yīng)用 RIDITER法檢驗(yàn)并分析各組數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 烏梅丸及加味方對(duì)大鼠化學(xué)性刺激引起UC的影響

3.1.1 烏梅丸及加味方對(duì)細(xì)胞因子IL-6、IL-10的影響 表1顯示，模型組與正常組比較，IL-6濃度有上升并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，IL-10濃度有下降趨勢(shì)(P<0.05)，符合UC發(fā)作期炎癥的發(fā)生特點(diǎn)。給藥各組與模型組的IL-6值比較，有顯著性差異(P<0.01);而IL-10中藥各組有升高的趨勢(shì)，說明各藥物均在機(jī)體內(nèi)發(fā)生了抗炎調(diào)節(jié)作用，烏梅丸作用較強(qiáng)。

表1 烏梅丸及加味方對(duì)細(xì)胞因子IL-6、IL-10的影響 pg/ml

3.1.2 烏梅丸及加味方對(duì)腫瘤壞死因子TNFα及PGE2因子的影響 表2顯示，模型組與正常組比較，TNFα、PGE2濃度都有上升趨勢(shì)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，符合UC發(fā)作期炎癥的發(fā)生特點(diǎn)。烏梅丸組與模型組的TNFα值比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算有顯著性差異(P<0.05)，其他中藥各組也有降低趨勢(shì)。PGE2指標(biāo)各中藥組都有降低趨勢(shì)(與模型組比較)，但相互間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。總之，各藥物均在機(jī)體內(nèi)發(fā)生了抗炎調(diào)節(jié)作用，但中藥組間差別不明顯。

表2 烏梅丸及加味方對(duì)腫瘤壞死因子TNFα及PGE2因子的影響 pg/ml

3.2 烏梅丸及加味方對(duì)大鼠免疫化學(xué)性引起的UC影響

3.2.1 對(duì)免疫化學(xué)性引起的大鼠UC細(xì)胞因子IL-6、IL-10的影響 表3顯示，模型組與正常組對(duì)比IL-6濃度有升高趨勢(shì)，而給藥各組有降低作用，烏梅丸及烏梅加味組具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;且中藥各組與模型組比較都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以烏梅丸效果最強(qiáng)。IL-10指標(biāo)表明，模型組表現(xiàn)出降低，而給藥各組與模型比有升高，烏梅丸組與模型組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且與芍藥湯組間有作用強(qiáng)弱的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 免疫化學(xué)性引起的UC大鼠細(xì)胞因子IL-6、IL-10 的變化(pg/ml)

3.2.2 對(duì)免疫化學(xué)性引起的大鼠UC腫瘤壞死因子 TNFα、PGE2的影響 表4顯示，模型組TNFα值與正常組對(duì)比有顯著性升高，其他給藥各組都有下降的作用或趨勢(shì)，烏梅丸組作用最強(qiáng)，而芍藥湯組最弱，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PGE2指標(biāo)說明:模型組表現(xiàn)出降低現(xiàn)象，而給藥各組均有上升趨勢(shì)(與模型組比)，烏梅加味組、烏梅丸組與模型組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且接近正常組值。

綜合評(píng)價(jià):各中藥復(fù)方均在機(jī)體內(nèi)發(fā)生了降低IL-6，升高 IL-10，對(duì)抗 TNFα的作用，調(diào)節(jié) PGE2的效果，表現(xiàn)出抗炎的藥效作用。而中藥各組間，烏梅丸組作用較強(qiáng)，與烏梅加味組作用強(qiáng)度無明顯區(qū)別，而芍藥湯組較弱，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2.3 細(xì)胞間黏附因子(ICAM-1)的檢測(cè)結(jié)果以正常組的ICAM-1像素為1，計(jì)算各組與其的像素比值，然后做圖進(jìn)行比較(見下圖)。

分析表明，模型組的ICAM-1表達(dá)較正常組明顯升高，烏梅丸組最低有抑制其表達(dá)的作用，西藥組、烏梅加白組次之，而芍藥湯組未觀察到明確作用。

4 結(jié)論

通過研究表明，應(yīng)用番瀉葉灌服致瀉、乙酸的化學(xué)性損傷可以引起大鼠UC發(fā)作期的病理表現(xiàn);而增加2，4-二硝基氯苯引起大鼠的免疫過敏反應(yīng)因素，使所造成的大鼠腹瀉更具有臨床 UC特點(diǎn)［2、3］，基本符合本研究觀察大鼠UC病理改變的需要。

實(shí)驗(yàn)表明，在化學(xué)性刺激引起大鼠UC的實(shí)驗(yàn)中，烏梅丸及加味方與對(duì)照藥芍藥湯，均具有抗炎的藥效作用，但其之間無明確的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，僅有一點(diǎn)趨勢(shì)。而在免疫化學(xué)性引起的大鼠UC中烏梅丸的抗炎藥效優(yōu)勢(shì)明顯，可降低IL-6，升高 IL-10，對(duì)抗TNFα的作用和調(diào)節(jié) PGE2的效果;減輕 UC時(shí)ICAM-1的表達(dá)程度，并與芍藥湯之間有明確差異，證明了該方的抗炎藥效及影響ICAM-1表達(dá)，部分闡明了臨床治療UC的機(jī)理。

本研究的目的是想找到烏梅丸及加味方臨床治療UC的中醫(yī)方證相應(yīng)變化的依據(jù)。臨床上該方確能治療UC疾病，其加味七味白術(shù)復(fù)方也有作用［4］。但實(shí)驗(yàn)證明，兩者在抗炎藥效指標(biāo)上無明顯的量效區(qū)別，不如臨床明確，特別是在單純化學(xué)性刺激下，這可能與動(dòng)物研究無法完全反應(yīng)人體的狀況有關(guān)。而烏梅丸作用明顯優(yōu)于芍藥湯的作用，在一定程度上說明了兩方雖然在臨床上都可治療UC這單一疾病［5］，但依照中醫(yī)臨床辨證兩方存在適應(yīng)證候的不同，在一定程度上達(dá)到了本項(xiàng)研究的目標(biāo)。

中醫(yī)方證相應(yīng)的研究是一項(xiàng)非常復(fù)雜的研究領(lǐng)域，如何科學(xué)、合理的進(jìn)行研究，才能具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值，在目前仍是無明確答案，本項(xiàng)研究?jī)H是一個(gè)摸索，是否合理仍應(yīng)加以深入探討。

［1］張?zhí)m鳳，王階，王永炎.方證對(duì)應(yīng)研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2005，20(1):8-10.

［2］李楊.潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的建立方法［J］.中藥新藥與臨床藥理，1999，10(2):120-122.

［3］范恒，邱明義.潰瘍性結(jié)腸炎大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c評(píng)價(jià)［J］.中醫(yī)藥學(xué)，2004，22(5):865-867.

［4］熊俊，董文軍，宋俊生，商鐵剛，袁安，徐陽.烏梅丸及其加減方治療潰瘍性結(jié)腸炎臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)［J］.吉林中醫(yī)藥，2008，28(4):296-299.

［5］胡響當(dāng)，何永恒.芍藥湯合痛瀉要方治療濕熱內(nèi)蘊(yùn)型潰瘍性結(jié)腸炎35 例［J］.中醫(yī)雜志，2009，50(3):235-236.