經(jīng)穴注射骨髓間充質(zhì)干細胞對缺血大鼠促血管生長相關因子的影響

董建勛，朱朝軍，路廣林，李 健，張美吉，王樂平，羅 玲

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010;2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

本文采用免疫組織化學法分析了經(jīng)穴注射BMMSCs治療21 d后大鼠后肢缺血骨骼肌VEGF標記的毛細血管密度、平滑肌肌動蛋白(α-SMA)標記的小動脈密度以及TNF-α和TGF-β1蛋白的表達量，嘗試探索VEGF、TNF-α和TGF-β1在血管新生和動脈生成之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)大鼠BM-MSC:SD大鼠BM-MSCs、SD大鼠BM-MSCs完全培養(yǎng)液均購自 Cyagen Biosciences(Guangzhou)Inc。實驗動物:SD大鼠24只，體質(zhì)量200g±20g，雌雄不限，購自北京市維通利華公司，動物許可證號SCXK(京)2007-0001;(2)主要實驗設備:MC0175CO:細胞培養(yǎng)箱(SANYO公司)，OLYMPUSix-71倒置顯微鏡，Nikon C-SHG1圖像分析系統(tǒng);(3)主要試劑:血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)移生長因子-β(TGF-β1)一抗及兔SP Kit一抗為兔來源的免疫組化試劑盒，均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。α-SMA一抗購于美國Abcam公司。

1.2 動物及分組

選擇健康SD大鼠24只，適應性喂養(yǎng)3d，稱重后隨機分對照組、模型組、經(jīng)穴注射BM-MSC治療組(經(jīng)穴組)和肌肉注射BM-MSC治療組(肌注組)4組。于造模前、后自由進食、飲水，同等條件下飼養(yǎng)。

1.3 動物模型制備

［1］的方法，在無菌操作下麻醉大鼠后(腹腔注射10%水合氯醛，3.5 ml/kg)仰臥固定于鼠板上。自其左腹股溝韌帶至膝關節(jié)上行一縱行切口，分離股動脈及分支。然后用5-0絲線在近左髂總動脈、腘動脈兩處結(jié)扎股動脈及分支，從兩處結(jié)扎的絲線中間離斷股動脈及其分支，造成下肢缺血模型，隨后縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后不做抗感染處理。

1.4 治療方法

經(jīng)穴組在手術(shù)左側(cè)后肢選取“三陰交”、“后三里”、“照?！?、“環(huán)跳”、“陽陵泉”5個穴位注射 BMMSCs。按照華興邦等［2］大鼠穴位圖譜研制一文中經(jīng)穴的定位取穴。肌注組在左側(cè)后肢缺血大腿內(nèi)側(cè)從上至下選取非穴位5點注射BM-MSCs。模型組選取的注射部位同肌注組，注射磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對照。術(shù)后立即用微量注射器行BMMSC單次注射，注射深度1cm，注射后不做任何手法處理。經(jīng)穴組、肌注組每只大鼠注射BM-MSC 5×106個，每穴/點注射0.2ml細胞混懸液，含BM-MSC 1×106個，只注射1次。模型組大鼠左側(cè)后肢注射等量的PBS。經(jīng)穴組、肌注組、模型組3組大鼠右肢體不做任何處理，作為正常對照?？瞻讓φ战M大鼠不做任何處理。

1.5 α-SMA表達陽性小動脈密度的計算

經(jīng)穴注射BM-MSCs 21d后，麻醉大鼠后取大鼠后肢內(nèi)收肌、腓腸肌，甲醛固定標本，石蠟包埋，按肌肉橫斷面切片厚約5μm(在北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院組胚教研室進行)。用抗平滑肌肌動蛋白免疫組織化學染色標記血管壁上的平滑肌，認為α-SMA表達陽性的部位是小動脈所在。使用Nikon CSHG1圖像分析系統(tǒng)(北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院組胚教研室提供)隨機選10個視野，在高倍鏡(10×40)下計算小動脈的密度，為減少誤差用鏡下小動脈數(shù)/肌束數(shù)(小動脈密度)來表示，取其平均值。

1.6 VEGF陽性表達血管的計算

按照博奧森即用型免疫組化試劑盒說明書染色，鏡檢有棕黃色顆粒為陽性。免疫組織化學VEGF染色，血管內(nèi)皮細胞胞漿染色呈棕黃色者為陽性細胞，該毛細血管即為VEGF陽性表達的血管。隨機選取10個視野，在高倍鏡(10×40)下觀察計數(shù)VEGF陽性表達的血管數(shù)，取其平均值。

1.7 TGF-β1和 TNF-α 表達測定

按照博奧森即用型免疫組化試劑盒說明書染色，鏡檢有棕黃色顆粒為陽性。同時設不加一抗的非特異性對照。采用尼康圖像分析儀對免疫組化顯色結(jié)果進行分析。每組選10個高倍視野(10×40)圖片，計算視野中陽性表達的面積(AREA)×平均光密度(MOD)值，取其平均值。

1.8 統(tǒng)計學處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。計量資料用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用LSD進行多重比較，多元相關分析采用Pearson檢驗，以α=0.05作為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 小動脈密度及VEGF陽性表達血管數(shù)的比較

表1和圖1、2顯示，正常骨骼肌中，α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體陽性細胞只能在小血管的平滑肌細胞中觀察到。結(jié)果表明，與對照組比較，肌注組和經(jīng)穴組小動脈密度指數(shù)及VEGF陽性表達的血管數(shù)都顯著升高 (P<0.01);與模型組比較，經(jīng)穴組及肌注組小動脈密度指數(shù)VEGF陽性表達的血管數(shù)均顯著升高(P<0.01);與肌注組比較，經(jīng)穴組小動脈密度指數(shù)及VEGF陽性表達的血管數(shù)均顯著升高(P<0.01)。

表1 各組大鼠缺血后肢骨骼肌橫切小動脈密度及VEGF陽性表達血管數(shù)(±s)

表1 各組大鼠缺血后肢骨骼肌橫切小動脈密度及VEGF陽性表達血管數(shù)(±s)

注:與對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，▲▲ P<0.01;與肌注組比較，△P<0.05，△△P<0.01

組 別 n 小動脈密度指數(shù) VEGF 陽性表達血管數(shù)對照組6 0.85±0.06 9.375±1.19模型組 6 0.90±0.09 10.50 ±1.20肌注組 6 1.40±0.11**▲▲ 17.00 ±2.62**▲▲經(jīng)穴組 6 1.80±0.07**▲▲△△ 19.875±2.59**▲▲△△

圖1 抗α平滑肌肌動蛋白標記的小動脈

圖2VEGF標記的毛細血管

2.2 免疫組化學TGF-β1和TNF-α表達量測定

表2、圖3、4顯示，免疫組織化學法對各組大鼠骨骼肌切片染色，并比較了TGF-β1和TNF-α等蛋白的表達量。結(jié)果表明，與模型組比較，經(jīng)穴組及肌注組 TGF-β1和 TNF-α表達量均顯著升高(P<0.01);與肌注組比較，經(jīng)穴組 TGF-β1和 TNF-α 表達量均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表2 各組大鼠缺血骨骼肌橫切免疫組化TGF-β1和TNF-α表達量測定結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠缺血骨骼肌橫切免疫組化TGF-β1和TNF-α表達量測定結(jié)果(±s)

注:與對照組比較:**P<0.01;與模型組比較:▲▲P<0.01;與肌注組比較:△P<0.05△△P<0.01;面積(AREA)×平均光密度(MOD)值

組 別 n TGF-β1 TNF-α對照組6 11.67±1.98 1.98±0.42模型組 6 11.99±4.89 2.55±0.79肌注組 6 20.80±5.03**▲▲ 7.05±2.34**▲▲經(jīng)穴組 6 25.63±3.23**▲▲△ 11.18±1.78**▲▲△△

圖3 各組大鼠缺血骨骼肌橫切TGF-β1的表達(免疫組織化學染色，10×40)

圖4 各組大鼠缺血骨骼肌橫切TNF-α的表達(免疫組織化學染色，10×40)

3 討論

胚胎發(fā)生后，成人的新生血管形成主要有兩種機制，一是血管新生，通過局部毛細血管的增生而增加局部的血流量;二是動脈生成，已存在的高阻力側(cè)支血管擴增來減少血流阻力而增加缺血區(qū)域的血流量［3］。在血管新生及動脈生成的過程中 VEGF、bFGF、TGF-β1和 TNF-α［4］等血管生長因子發(fā)揮重要作用。本研究證實，經(jīng)穴組a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)表達陽性的小動脈密度和VEGF陽性表達毛細血管密度顯著高于肌注組。所以我們認為，經(jīng)穴注射BM-MSCs改善大鼠后肢血流的過程中，既存在血管新生又存在著肌性動脈形成的動脈生成。

3.1 TGF-β1、TNF-α 與新生血管新成

TNF-a是一種強有力的促血管生成因子，TNF-a通過間接和直接作用促進血管新生。間接作用是通過上調(diào) VEGF、VEGF受體2和 bFGF［5］的表達來實現(xiàn)的，直接作用是通過與bFGF和VEGF共同作用，TNF-a和bFGF以及VEGF等共同誘導人體微血管內(nèi)皮細胞增生形成毛細血管樣管狀結(jié)構(gòu)，在此過程中TNF-a能上調(diào)促進形成毛細血管結(jié)構(gòu)所必須的尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑的形成［6］。

TGF-β是已知的促血管生長因子，在組織修復、血管形成中起重要作用。TGF-β1是TGF-β家族的主要成員，是調(diào)節(jié)正常細胞生長和其他各種功能的主要細胞因子。研究表明，TGFβ1可以刺激垂體前葉濾泡星形細胞自分泌和旁分泌堿性成纖維生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，而促進血管新生。更重要的是，TGFβ1對血清剝奪和低氧誘導MSCs的凋亡具有抑制作用，TGF-β還能促進BM-MSCs增殖并較長期保持其生物活性。故MSC分泌的TGFβ1既能減少MSC的凋亡又能促進其增殖，反過來MSC的存活率高又分泌更多的TGFβ1，二者形成良好的相互作用。經(jīng)穴注射BM-MSCs后，TGFβ1在缺血肌肉組織表達增加，能抑制血清剝奪和低氧誘導BM-MSCs的凋亡，并且促進BM-MSC增殖并較長期保持其生物活性，從而提高注射的BMMSCs存活率，使得更多的 BM-MSCs分泌 VEGF、bFGF和TGFβ1，發(fā)揮治療性血管生成的作用。

3.2 相關血管生長因子在新生血管形成中的相互作用

前期研究表明，經(jīng)穴注射BM-MSCs能顯著提高血漿和免疫組化VEGF、bFGF蛋白表達量。在血管新生過程中，VEGF與bFGF存在相互作用，統(tǒng)計學多元相關分析表明，VEGF(R=0.898，P<0.01)和bFGF(R=0.813，P<0.05)免疫組化蛋白表達量都與小動脈密度顯著相關，VEGF和bFGF免疫組化蛋白表達量也顯著相關(R=0.955，P<0.01)。有研究表明，VEGF是bFGF發(fā)揮作用的基礎，Seghezzi等用VEGF抗體中和VEGF就能抑制bFGF誘導的血管生成，他們還提出bFGF主要通過細胞的自分泌和旁分泌途徑上調(diào)VEGF在內(nèi)皮細胞中的表達，故本實驗血管生長過程中也存在bFGF與VEGF的協(xié)同作用。此外，TGF-β1和 TNF-α也都與 VEGF和bFGF之間存在相互作用。

TNF-α能與bFGF和VEGF通過直接或間接作用參與新生血管形成。而TGFβ1可以刺激成纖維生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌，還通過抑制 BM-MSCs的凋亡產(chǎn)生更多的bFGF和VEGF而促進血管新生。故經(jīng)穴注射BMMSCs能顯著增加后肢缺血大鼠小動脈密度和VEGF陽性表達毛細血管密度。

經(jīng)穴注射 BM-MSCs后，產(chǎn)生更多的 VEGF、bFGF、TGFβ1和 TNF-a，4 種血管生長因子協(xié)同作用，TGFβ1既能提高BM-MSCs的存活率，又能上調(diào)VEGF、bFGF的表達和注射 MSCs分泌的 VEGF、bFGF共同促進血管新生、動脈生成，所以經(jīng)穴注射BM-MSCs較肌內(nèi)注射BM-MSCs能顯著提高小動脈密度及VEGF陽性表達毛細血管密度。

總之，經(jīng)穴注射BM-MSC，調(diào)暢經(jīng)絡之氣血，濡養(yǎng)三陰、三陽之經(jīng)脈，滋養(yǎng)神經(jīng)組織，通過對軀體傷害性傳入的抑制效應達到鎮(zhèn)痛效果，從而使缺血肢體氣血調(diào)和、脈絡通暢，癥狀得以緩解。從現(xiàn)代醫(yī)學講，(1)經(jīng)穴注射BM-MSCs可以產(chǎn)生更多的VEGF、bFGF、TGFβ1和 TNF-α等多種血管生長因子，從而促進血管新生和動脈生成;(2)可以產(chǎn)生更多的TGFβ1抑制BM-MSCs的凋亡并且促進其增殖;(3)可以通過分泌的VEGF促進神經(jīng)突觸延伸，發(fā)揮神經(jīng)保護和神經(jīng)新生作用，減輕缺血缺氧對下肢周圍神經(jīng)的損害，從而減輕癥狀。簡而言之，經(jīng)穴注射BM-MSCs，可以產(chǎn)生更多的 VEGF、bFGF、TGFβ1和TNF-α等多種血管生長因子，更好地發(fā)揮BM-MSCs的新生血管形成作用。

參考文獻:

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［2］華興邦，李辭蓉，周浩良，等.大鼠穴位圖譜的研制.實驗動物與動物實驗，1991，1:1-5.

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［5］Tiina T.Tuomisto，Tuomas T.Rissanen，Ismo Vajanto.HIFVEGF-VEGFR-2，TNF-α and IGF pathways are upregulated in critical human skeletal muscle ischemia as studied with DNA array［J］.Atherosclerosis，2004，174:111 – 120.

［6］Enrico Giraudo，Luca Primo，Enrica Audero，ec al.Tumor Necrosis Factor-a Regulates Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 and of Its Co-receptor Neuropilin-1 in Human Vascular Endothelial Cells［J］.J Biol Chem，1998，273(34):22128–22135.