不同劑量伊桐苷灌胃對(duì)大鼠彌散性腦損傷的防治作用及其機(jī)制

姚瀚勛，唐樂劍，夏學(xué)巍，覃超，段震映，王文波

(1桂林醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541001；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

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不同劑量伊桐苷灌胃對(duì)大鼠彌散性腦損傷的防治作用及其機(jī)制

姚瀚勛1，唐樂劍2，夏學(xué)巍2，覃超1，段震映1，王文波2

(1桂林醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541001；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的觀察不同劑量伊桐苷對(duì)大鼠彌散性腦損傷(DBI)的防治作用，并探討其可能機(jī)制。方法50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，A、B、C、D組均制備DBI模型，E組僅做頭皮切口并暴露顱骨，不致腦損傷。A、B、C組另分別以40、80、160 g/kg伊桐苷灌胃，造模前7 d開始給藥，造模后繼續(xù)給藥14 d，1次/d；D、E組給予等量生理鹽水。采用感覺運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試方法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)生理功能的缺陷程度，HE染色法觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化，化學(xué)比色法測(cè)定腦組織谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果與E組比較，D組神經(jīng)功能評(píng)分降低，病理形態(tài)學(xué)變化明顯，腦組織MDA含量升高、GSH-PX活性減弱(P均<0.01)。與D組比較，A、B、C組神經(jīng)功能評(píng)分增加，病理形態(tài)學(xué)改變減輕，腦組織MDA含量降低、GSH-PX活性增強(qiáng)(P均<0.01)。結(jié)論伊桐苷能夠改善彌漫性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能，減輕腦組織的病理?yè)p害，尤以160 g/kg劑量的伊桐苷效果最好；其機(jī)制可能與伊桐苷能夠減少腦組織內(nèi)過氧化物的生成并增強(qiáng)抗氧化酶的活性有關(guān)。

伊桐苷；彌散性腦損傷；丙二醛；谷胱甘肽過氧化物酶

彌散性腦損傷(DBI)是神經(jīng)外科常見急癥，其發(fā)病率、病死率及致殘率較高。DBI致繼發(fā)性腦損傷與氧自由基(OFR)的大量產(chǎn)生密切相關(guān)，而近年來許多抗氧化劑及自由基清除劑被廣泛應(yīng)用于臨床。伊桐是大風(fēng)子科伊桐屬植物，常綠喬木，生長(zhǎng)于海拔500～1 600 m的山地常綠闊葉林中[1]。伊桐的根和樹皮在民間入藥，常用于風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、肝炎及貧血等癥的治療。研究證明，伊桐苷有抗氧化的作用。2014年9月～11月，我們觀察了不同劑量伊桐苷對(duì)大鼠DBI的防治作用，并探討其機(jī)制，旨在為伊桐苷的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑SPF級(jí)SD雌性大鼠50只，3月齡，由桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。微量移液器，Leica石蠟切片機(jī)，TU-1810SPC紫外可見分光光度計(jì)，勻漿儀，404-3型隔水式電熱恒溫箱，BCD-212D低溫冰箱，低溫高速離心機(jī)。丙二醛(MDA)測(cè)試試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測(cè)試試劑盒。

1.2伊桐水提液的制備取伊桐的皮和枝條洗凈，烘干，粉碎，精確稱取伊桐粉末1 000 g，加4 000 mL蒸餾水提取2 h，濾渣再加4 000 mL蒸餾水，再次提取2 h，合并兩次濾液后蒸發(fā)至濾液僅剩50 mL為止，相當(dāng)于20 g(生藥)/mL。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、DBI模型制備及伊桐苷用法50只大鼠隨機(jī)分為5組，A、B、C、D組制備DBI模型[2,3]，即參照Feeney′s自由落體撞擊傷方法，大鼠稱重后用2%戊巴比妥納50 mg/kg腹腔注射麻醉后，俯臥于海綿墊(海綿墊彈性系數(shù)己知)上，將大鼠頭部放置于略高出床體表面0.5 cm的部位，頭部用立體定位儀固定以保證打擊時(shí)撞擊面處于水平。矢狀中線切開頭皮后分離骨膜，暴露前囟、冠狀縫和矢狀縫及頂骨。參照臨床患者腦外傷的隨機(jī)性和不確定性，將自由落體裝置底座置于大鼠顱骨表面，以450 g砝碼自120 cm高沿套管下落撞擊大鼠顱骨頂部的不銹鋼圓形墊片。固定于大鼠顱頂部的不銹鋼圓形墊片用于保證作用力彌散分布于顱頂各處，也可避免顱骨骨折，然后根據(jù)所要觀測(cè)的時(shí)間點(diǎn)處死。大鼠在處死前8 h禁食、水。致傷大鼠出現(xiàn)以下體征表明模型成功，即大鼠可有不同程度的瞳孔改變及意識(shí)障礙，表現(xiàn)為頸尾強(qiáng)直、四肢抽搐及肌張力增高，除去未成模的大鼠[4,5]。E組僅做頭皮切口并暴露顱骨，不致腦損傷。A、B、C組另分別以40、80、160 g/kg伊桐苷灌胃，造模前7 d開始給藥，造模后繼續(xù)給藥14 d，1次/d；D、E組僅給予等量生理鹽水。

1.4大鼠神經(jīng)生理功能評(píng)價(jià)采用Rancan等[6]的感覺運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試方法，評(píng)價(jià)大鼠DBI制模后2、4、6、8、10、12、14 d神經(jīng)生理功能的缺陷程度，所有測(cè)試項(xiàng)目均正常則計(jì)24分。

1.5大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察腦損傷后14 d，每組取4只大鼠，以10%水合氯醛麻醉，采用胸部正中切口。鈍性分離出主動(dòng)脈并插管，依次用冰生理鹽水100 mL和4%多聚甲醛液300 mL灌注大鼠的心臟和腦。然后斷頭處理，取出大鼠全腦并立即用4%多聚甲醛溶液固定。待全部大鼠腦組織取材結(jié)束后，統(tǒng)一進(jìn)行脫水、浸蠟及石蠟包埋等處理。用切片機(jī)制成層厚6 mm的腦組織(冠狀位)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.6大鼠腦組織組織學(xué)評(píng)分上述切片分別在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行評(píng)分，若無損傷則計(jì)0分；若有少量神經(jīng)細(xì)胞受損，可見散在的神經(jīng)細(xì)胞皺縮則計(jì)1分；若有中度神經(jīng)細(xì)胞損害，可見腦梗塞灶則計(jì)2分；若有重度神經(jīng)細(xì)胞損傷，出現(xiàn)囊性梗塞灶和膠質(zhì)增生則計(jì)3分。上述評(píng)分由未參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的同事進(jìn)行[7]。

1.7大鼠腦組織GSH-PX、MDA測(cè)定腦損傷后14 d，每組取6只大鼠，將大鼠斷頭處理，迅速取腦并在頂葉挫裂傷灶附近的皮質(zhì)取一塊約250 mg的腦組織用于制備勻漿。于低溫環(huán)境下進(jìn)行活性測(cè)定，所取腦組織塊與預(yù)冷勻漿介質(zhì)按1∶9質(zhì)量比在組織研磨器中充分研磨，用低溫離心機(jī)以3 500 r/min離心10～15 min，取適量上清液。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各組蛋白含量，采用TBA法測(cè)定MDA[8,9]，采用比色法測(cè)定GSH-PX[10,11]，所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠制模后神經(jīng)生理功能評(píng)分比較大鼠制模后神經(jīng)生理功能評(píng)分比較見表1。

2.2各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)比較E組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元呈三角形或錐形，藍(lán)染；錐體形神經(jīng)元細(xì)胞可見突起；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞核深染，胞質(zhì)少(灌注時(shí)可能造成輕微損傷)。D組大鼠腦組織錐體細(xì)胞變圓，胞質(zhì)染色淺淡，尼氏體減少，核偏位，部分核固縮，細(xì)胞間隙邊界不清，血管周圍間隙增大；挫裂傷灶附近皮層神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)嗜伊紅染色增強(qiáng)，核仁不清，尼氏體溶解消失；部分小血管淤血擴(kuò)張。

表1　各組大鼠制模后神經(jīng)生理功能評(píng)分比較(分，±s)

注：與E組比較，*P<0.05；與D組比較，△P<0.05；與A組比較，﹟P<0.05；與B組比較，▲P<0.05。

與D組比較，C組大鼠腦組織的神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，核仁深染，可分辨；細(xì)胞周圍有較多空泡，但較D組有明顯改善；細(xì)胞核深染。與D組比較,B組大鼠腦組織挫裂傷灶及周圍水腫區(qū)可見較多凋亡的神經(jīng)細(xì)胞(細(xì)胞核固縮、深染、細(xì)胞膜完整)及許多液化壞死的神經(jīng)細(xì)胞(呈空泡狀)，同時(shí)可見有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，周圍的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，神經(jīng)元周圍空隙明顯，還可見細(xì)胞核濃縮、深染。與D組比較，A組無明顯差異。

2.3各組大鼠腦組織組織學(xué)評(píng)分比較A組2分者3例份，3分者5例份；B組1分者2例份，2分者5例份，3分者1例份；C組1分者6例份，2分者2例份；D組2分者1例份，3分者7例份；E組均為0分。

2.4各組大鼠腦組織MDA含量、GSH-PX活性比較大鼠腦組織MDA含量、GSH-PX活性比較見詳表2。

表2　各組大鼠腦組織MDA含量、GSH-PX活性比較

注：與E組比較，*P<0.05；與D組比較，△P<0.05；與A組比較，﹟P<0.05；與B組比較，▲P<0.05。

3　討論

DBI是神經(jīng)外科常見的疾病，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，其發(fā)病率、病死率及致殘率較高。DBI后神經(jīng)系統(tǒng)的完整性被破壞，體現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)大鼠不同程度的神經(jīng)生理功能改變，這反映出神經(jīng)系統(tǒng)的損傷程度[12]?；钚匝醮?ROS)是DBI的重要參與因子，而自由基是其中最關(guān)鍵的參與因子。DBI后，腦組織的水腫、缺血缺氧、再灌注及出血等可進(jìn)一步引起繼發(fā)性腦損傷，產(chǎn)生大量的OFR及超氧陰離子自由基，并觸發(fā)連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致病理性自由基反應(yīng)不斷生成、擴(kuò)大的“惡性循環(huán)”[13]。DBI時(shí)，在線粒體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基，這些自由基在超氧化物歧化酶的催化下生成H2O2并進(jìn)一步經(jīng)Haber Weiss反應(yīng)生成羥基自由基(·OH)[14]。細(xì)胞生物膜含有大量的膽固醇及多不飽和脂肪酸，多不飽和脂肪酸含有多個(gè)不飽和雙鍵，且氧在脂溶性物質(zhì)中的溶解度較水中高數(shù)倍，使生物膜極易遭受OFR攻擊并發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而過氧化脂質(zhì)本身就是一種自由基。因此，DBI后OFR的大量產(chǎn)生可以造成神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷[15,16]。

OFR能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，形成脂質(zhì)過氧化物，主要是MDA，其含量高低可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，進(jìn)而反映細(xì)胞損傷程度。同時(shí)機(jī)體內(nèi)還存在一系列抑制和清除自由基的抗氧化酶和非酶系統(tǒng)，其中GSH-PX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解酶，能特異催化還原型谷胱甘肽對(duì)過氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，其酶活性的高低間接反映了機(jī)體清除OFR能力的大小。大腦皮層具有感覺、運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)記憶等重要功能，與DBI后的神經(jīng)生理功能障礙密切相關(guān)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇腦組織中MDA和GSH-PX的變化作為測(cè)定與分析的指標(biāo)[17]。

單萜苷類化合物是許多常用中藥的有效成分，其結(jié)構(gòu)類型主要包括鏈狀、單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)單萜苷及環(huán)烯醚萜苷，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、保肝、降血糖等藥理作用，但目前對(duì)其藥理活性的研究主要集中于雙環(huán)單萜苷和環(huán)烯醚萜苷，且很多活性成分的作用機(jī)制尚不十分明確。天然來源的鏈狀單萜苷具有較強(qiáng)的抗OFR能力，且分子量小，能被人體迅速吸收，較易通過血腦屏障，對(duì)于治療腦血管疾病有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[18]。2008年，柴興云等從伊桐的皮和枝條中分離得到一個(gè)新的鏈狀單萜苷類成分，經(jīng)波譜方法鑒定為3，7-dimethyl-1，6-octadien-3，10-dihydroxyl-10-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，命名為伊桐苷0。

本研究顯示，D組大鼠有明顯的神經(jīng)生理功能障礙，腦組織病理形態(tài)改變及組織學(xué)評(píng)分變化明顯，腦組織MDA含量顯著升高，GSH-PX活性顯著降低，表明其OFR清除能力下降，OFR生成增加，脂質(zhì)過氧化程度加劇。本研究還顯示，A、B、C組大鼠神經(jīng)功能障礙及病理形態(tài)改善，腦組織MDA含量降低，GSH-PX活性增強(qiáng)；且伊桐苷劑量越大，效果越明顯。表明伊桐苷可通過清除自由基，對(duì)抗過氧化反應(yīng)，抑制腦缺血后梗死區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡以及縮小梗死面積，減輕腦水腫等有效防治DBI后的繼發(fā)性腦損傷，其具體機(jī)制可能包括：①增加前列環(huán)素的生成；②通過降低羥基自由基抑制花生四烯酸的脂氧合酶代謝；③抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；④通過抑制活性氧的活性保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損害。

總之，伊桐苷對(duì)于DBI引起的繼發(fā)性腦損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其減少自由基的產(chǎn)生及增強(qiáng)抗氧化酶的活性有關(guān)。

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Preventive and therapeutic effect of different doses of Itoside on rats with diffuse brain injury and its mechanism

YAO Hanxun1, TANG Lejian, XIA Xuewei, QIN Chao, DUAN Zhenying, WANG Wenbo

(1 Clinical College of Guilin Medical University, Guilin 541001, China)

ObjectiveTo observe the preventive and therapeutic effect of different doses of Itoside on rats with diffuse brain injury (DBI) and to investigate its mechanism.MethodsSD rats were randomly divided into 5 groups: groups A, B, C, D and E. DBI models were prepared in the groups A, B, C and D. Rats in the group E only received scalp incision and skull was exposed. Rats in the groups A, B and C were given Itoside (40, 80 and 160 g/kg) by gavage, respectively, starting from 7 days before modeling, and continuing for 14 days after modeling, once a day. Groups D and E received equal volume of saline. We used the sensory and motor function test to evaluate the nerve function′s defect degree after DBI, and observed morphological changes of the cerebral cortex of rats by HE staining. We determined the content of glutathione peroxidase (GSH-PX) and malondialdehyde (MDA) through the chemical colorimetric method. ResultsCompared with group E, neurological score was decreased, pathological changes were significant, the content of MDA in brain tissues was increased, and the activity of GSH-PX was decreased in the group D (all P<0.01). Compared with group D, neurological score was increased, pathological changes alleviated, the content of MDA in brain tissues was decreased, and the activity of GSH-PX was increased in the groups A, B and C (all P<0.01).ConclusionsItoside can improve the neural function of rats with DBI and alleviate the pathological damage of brain tissue with the best effect of 160 g/kg Itoside. The mechanism may be related to that Itoside can reduce the formation of oxidation products in the brain tissues and enhance the activity of antioxidant enzymes.

Itoside; traumatic brain injury; malondialdehyde; glutathione peroxidase

廣西教育廳科研立項(xiàng)項(xiàng)目(10JKT-111)；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(11SKT-66)。

姚瀚勛(1990-)，男，本科，住院醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)外科基礎(chǔ)與臨床。E-mail： yaohanxun@163.com

簡(jiǎn)介：王文波(1978-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟X缺血再灌注損傷的治療。E-mail： wwbgxgl@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.006

R651.1

A

1002-266X(2016)15-0019-04

2016-01-13)