Construction of a Cell Impedance Biosensor Based on Graphene Oxide/Polypyrrole-Indium Tin Oxide Micro-Electrode for Detecting Cell Adhesion and Proliferation*

LI Yuan，ZHANG Jing，LIAO Juan，WANG Tiaomin，LIU Beizhong*，YU Chao，ZHANG Linlin

（1.Central Laboratory of Yongchuan Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 402160，China；2.Institute of Life Science，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

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傳感器研究

Construction of a Cell Impedance Biosensor Based on Graphene Oxide/Polypyrrole-Indium Tin Oxide Micro-Electrode for Detecting Cell Adhesion and Proliferation*

LI Yuan1，2，ZHANG Jing1，LIAO Juan1，WANG Tiaomin1，LIU Beizhong1*，YU Chao2，ZHANG Linlin1

（1.Central Laboratory of Yongchuan Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 402160，China；2.Institute of Life Science，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Thispaperdescribesacellimpedancebiosensorbasedongrapheneoxide/polypyrrole-indium tinoxide（GO/ PPy-ITO）microelectrode for detecting cell adhesion and proliferation.The ITO microelectrode was firstly fabricated by etching the insulating layer of photosensitive dry film with lithography technology.Then GO/PPy nanocomposite was deposited on the surface of the ITO microelectrode by one-step electropolymerization to form the GO/PPy-ITO micro?electrode.Shape measuring laser microscope and scanning electron microscope were used to characterize the surface roughness and topology of the GO/PPy respectively.The electrochemical properties of the GO/PPy-ITO microelectrode were measured by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy.Human lung cancer cells A549 adhesion，spreading and proliferation experiments were used to characterize the biocompatibility of the GO/PPy.Used the GO/PPy-ITO microelectrode as sensing electrode，A549 cells adhesion and proliferation were detected by electro?chemical impedance spectroscopy.Results showed that the GO/PPy nanocomposite electrodeposited on the surface of the ITO microelectrode had a special structure of smooth surface and abundant micro-pore distribution.Compared with bare ITO microelectrode，GO/PPy-ITO microelectrode had a lower impedance and higher electrochemical activity. Meanwhile，A549cellsculturedonGO/PPy-ITOcouldattach，spreadandproliferatemorerapidlythanpurePPy.Final?ly，as the adhesion and proliferation of A549 cells on the surface of GO/PPy-ITO microelectrode would change the im?pedance spectrum characteristics of the electrode system，the information on the cell adhesion and proliferation could be obtained by fitting the impedance spectrum data with the equivalent circuit model.Therefore，as the excellent elec?trochemical properties and biocompatibility of the GO/PPy-ITO microelectrode，cell-based impedance biosensor basedonthistypeofmicroelectrodecouldbeusedinthefiledsuchascellularpathophysiologyanddrugscreening.

biosensor；electrochemical impedance detection；graphene oxide；polypyrrole；Indium tin oxide；cell proliferation

細(xì)胞阻抗生物傳感器是一類以活細(xì)胞作為敏感原件，以電化學(xué)阻抗譜技術(shù)作為活細(xì)胞響應(yīng)行為探測技術(shù)的新型生物傳感器［1］。由于電化學(xué)阻抗譜分析技術(shù)具有無侵襲性、定性與定量相結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，因此細(xì)胞阻抗生物傳感器能夠無標(biāo)記、定量地分析細(xì)胞粘附、增殖、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為［2-4］，廣泛用于藥物篩選［5］、毒物測試［6］及細(xì)胞生理參數(shù)分析［7］等研究領(lǐng)域。細(xì)胞阻抗生物傳感器檢測的基礎(chǔ)在于將活細(xì)胞固定或培養(yǎng)在金屬材質(zhì)傳感微電極表面，傳感電極制備材料包括金［8］、鉑［9］或銦錫氧化物［10］。盡管上述電極材料具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性，然而發(fā)展新型電極材料改善傳感電極的電化學(xué)性能和生物相容性以提高細(xì)胞阻抗生物傳感器的檢測性能仍是本領(lǐng)域研究熱點(diǎn)［11］。

氧化石墨烯GO（Graphene Oxide），作為石墨烯GN（Graphene）的氧化衍生物，除具備GN的特殊結(jié)構(gòu)、電化學(xué)性質(zhì)及催化活性等優(yōu)點(diǎn)，在GO的底面和邊緣還有豐富的含氧基團(tuán)，比如羥基，環(huán)氧化物，羰基，羧基等［12］，因此比GN具有更好的水溶性，從而為利用GO構(gòu)筑各種納米復(fù)合物提供了有利條件。重要的是，Chang等［13］采用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究了不同尺度GO對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示GO具有良好的細(xì)胞生物相容性；Zhang等［14］通過靜電組裝技術(shù)構(gòu)建了一種GO/poly-L-lysine復(fù)合物，該復(fù)合物可作為細(xì)胞固定界面，并通過電化學(xué)阻抗技術(shù)實(shí)現(xiàn)白血病K562細(xì)胞的數(shù)量檢測；Guo等［15］將含RGD多肽序列修飾在GO表面改善GO生物仿生能力，并證實(shí)其可作為活細(xì)胞小分子檢測的傳感界面。毫無疑問，發(fā)展基于GO納米復(fù)合物的傳感電極修飾材料是構(gòu)建新型細(xì)胞生物傳感器的重要方向。

另一方面，聚吡咯PPy（Polypyrrole），一種重要共軛性導(dǎo)電聚合物，具有本征導(dǎo)電、表面性質(zhì)可控、良好生物相容性及低電位聚合等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于構(gòu)建各類分子生物傳感器［16］和細(xì)胞生物傳感器［17］。為提高PPy機(jī)械性能和電學(xué)性質(zhì)，將納米材料，如金顆粒［18］、碳納米纖維［19］耦合進(jìn)PPy形成獨(dú)特的納米材料/PPy復(fù)合物是一個(gè)重要策略。鑒于GN和衍生物獨(dú)特性質(zhì)，有研究報(bào)道將GN或其衍生物與PPy相耦合形成GN/PPy納米復(fù)合物，構(gòu)建的納米復(fù)合物能夠充分體現(xiàn)PPy和GN兩種材料的協(xié)同效應(yīng)［20-22］。最近，Zhu等［23］通過在玻碳電極上一步法電沉積合成GO/PPy納米復(fù)合物用于制備更高效的電化學(xué)超級(jí)電容器。Lü等［24］在石墨氈電極上通過一步法電聚合技術(shù)修飾一層GO/PPy納米復(fù)合物，提高了微生物燃料電池陽極的穩(wěn)定性和發(fā)電效率。在上述研究中［23，24］，由于GO富含多種功能基團(tuán)，如-OH和-COOH，在水溶液中Zeta電位約為-50.7 mV，因此可作為吡咯電聚合過程中唯一外部摻雜陰離子并通過一步法電聚合原位合成GO/PPy納米復(fù)合物。一步法電聚合方法簡單，易于實(shí)施，制備的GO/PPy納米復(fù)合物能夠顯著提高PPy的電化學(xué)性能和機(jī)械穩(wěn)定性。然而，一步法電聚合制備的GO/PPy納米復(fù)合膜與細(xì)胞間的相互作用以及作為納米傳感界面用于細(xì)胞檢測的研究還未見報(bào)道。

為此，本文在ITO微電極表面通過一步法電聚合制備GO/PPy納米復(fù)合物，并發(fā)展了一種基于GO/ PPy-ITO微電極的細(xì)胞阻抗生物傳感器初步實(shí)現(xiàn)細(xì)胞粘附增殖生物學(xué)行為信息檢測。研究選擇ITO材料作為基底電極是由于其兼具導(dǎo)電性和透光性，一方面能夠?qū)崿F(xiàn)GO/PPy原位電聚合和電化學(xué)阻抗譜檢測，另一方面能夠通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞與GO/PPy納米復(fù)合膜的相互作用［25］。研究首先考察了GO/PPy-ITO微電極表面拓?fù)湫蚊?，電化學(xué)性質(zhì)及GO/PPy界面的細(xì)胞生物相容性。隨后以GO/PPy-ITO微電極為傳感電極，通過電化學(xué)阻抗譜技術(shù)和等效電路擬合技術(shù)對(duì)人肺癌上皮細(xì)胞A549在GO/ PPy-ITO電極表面的粘附增殖行為進(jìn)行檢測。

1　方法和材料

1.1ITO微電極加工及GO/PPy納米復(fù)合膜電聚合

ITO微電極的加工采用本課題組前期發(fā)展的感光干膜-ITO微電極工藝［26］，簡要加工流程為：將感光干膜（HQ-6100，長興化學(xué)工業(yè)股份有限公司）通過覆膜機(jī)（100℃）壓貼在ITO導(dǎo)電玻璃（珠海凱為光電科技有限公司）導(dǎo)電膜面，透過掩膜膠片對(duì)感光干膜進(jìn)行紫外光照射30 s，30℃下用1%Na2CO3溶液對(duì)感光干膜顯影5 min，使未經(jīng)紫外光照射區(qū)域的感光干膜溶解暴露出ITO微電極（電極直徑為1.0 mm），去離子水沖洗2次，60℃烘干，紫外照射60 s使感光膠完全固化。

電化學(xué)小池裝置制備參考文獻(xiàn)［26］，其示意圖和實(shí)物圖分別如圖1（a）、1（b）所示。ITO微電極和測量小池用塑料夾具固定，使ITO微電極置于測量小池底部，整個(gè)裝置含4個(gè)獨(dú)立測量小池，每個(gè)小池直徑為8 mm，體積約為500 μL。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在CS315電化學(xué)工作站（武漢科思特儀器有限公司）實(shí)施，實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)，其中ITO微電極為工作電極，Ag/AgCl絲為參比電極（直徑：0.5 mm，長度：10 mm），鉑絲為對(duì)電極（直徑：1.0 mm，長度：10 mm）。GO水溶液（南京吉倉納米科技有限公司，直徑為30 nm～50 nm）未經(jīng)任何處理直接用去離子水配置成濃度為2 mg/mL的GO水溶液，超聲處理15 min分散。在GO水溶液中加入吡咯單體（Sigma Aldrich），使吡咯濃度為0.5 mol/L，震蕩混勻獲得預(yù)聚合溶液。GO/PPy納米復(fù)合物的制備采用一步法電聚合技術(shù)，即在ITO微電極上施加+0.8 V（vs.Ag/AgCl）的極化電位，示意圖如圖1（c）所示。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聚合電荷為4 mC/cm2時(shí)可在ITO微電極表面形成均勻穩(wěn)定的復(fù)合物膜，其厚度通過理論公式計(jì)算約為1.05 μm［27］。隨后，GO/PPy納米復(fù)合物用去離子水沖洗，室溫干燥。作為對(duì)照，純PPy膜在含0.1 mol/L KCl和0.5 mol/L吡咯單體水溶液中電聚合形成PPy-ITO微電極，聚合參數(shù)同上。GO/PPy納米復(fù)合物的表面粗糙度和拓?fù)湫蚊卜謩e通過VK-V150形狀測量激光顯微鏡（基恩士，日本）和S4800掃描電子顯微鏡（日立，日本）進(jìn)行表征。

圖1　GO/PPy-ITO微電極的制備

1.2電化學(xué)性能表征

GO/PPy-ITO微電極電化學(xué)性能采用電化學(xué)阻抗譜（EIS）和循環(huán)伏安法（CV）進(jìn)行研究。電化學(xué)方法采用三電極體系，并在上述相同電化學(xué)小池裝置中進(jìn)行。其中，三電極系統(tǒng)以G0/Ppy-ITO微電極為工作電極，以Ag/AgCl絲為參比電極，鉑絲為對(duì)電極。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)以Ppy-ITO微電極和裸ITO微電極作為對(duì)照。EIS和CV測試均在0.01 mol L-1PBS溶液中進(jìn)行。EIS以幅值為10 mV正弦波作為激勵(lì)信號(hào)，掃描頻率范圍為1 Hz～100 000 Hz。CV測量掃描電壓從+0.5 V～-0.6 V（vs.Ag/AgCl），掃描速度為50 mV/s，掃描循環(huán)數(shù)設(shè)為10。

1.3細(xì)胞生物相容性研究

GO/PPy納米復(fù)合膜的細(xì)胞生物相容性通過細(xì)胞粘附、鋪展和增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。為便于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，首先按照上述相同聚合參數(shù)在直徑為6 mm的ITO電極上沉積相同厚度的GO/PPy（聚合電量為（150 mC/cm），70%乙醇浸泡5 min消毒，無菌去離子水沖洗，干燥待用。將100 μL A549細(xì)胞懸液（5.0×104cells/mL）接種含GO/PPy的測量小池內(nèi)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中靜止2 h，細(xì)胞粘附形態(tài)學(xué)通過IX71倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本）觀察，CCD進(jìn)行拍照。細(xì)胞接種在GO/PPy表面12 h待細(xì)胞完全鋪展，PBS沖洗1次后用3.7%甲醛溶液室溫固定10 min，用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（碧云天生物技術(shù)研究所）室溫孵化60 min對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色。細(xì)胞的鋪展形態(tài)學(xué)利用IX71倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。細(xì)胞粘附和鋪展實(shí)驗(yàn)以純PPy膜作為對(duì)照。

A549細(xì)胞在GO/PPy納米復(fù)合膜界面的增殖行為通過Cell Counting Kit（CCK-8試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所）實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。100 μL的A549細(xì)胞懸液（2.0×104cells/mL）分別接種在含GO/PPy、純PPy的測量小池內(nèi)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和48 h，隨后加入10 μL CCK-8分析液，輕搖混勻，37℃孵育2 h，分別取測量小池內(nèi)溶液100 μL，多功能酶標(biāo)儀（Varioskan，Thermo Scientific）測定溶液在450 nm的吸光度，溶液吸光值與細(xì)胞數(shù)量和活性成正比關(guān)系。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)96孔板聚苯乙烯基底作為對(duì)照。

1.4A549細(xì)胞粘附增殖電化學(xué)阻抗檢測

將100 μL A549細(xì)胞懸液（2.0×104cells/mL）加入含GO/PPy-ITO微電極的測量小池內(nèi)，室溫下靜止30 min使細(xì)胞均勻沉降到微電極表面后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）培養(yǎng)，分別在2 h、24 h、48 h和72 h后將測量小池取出，PBS沖洗電極去掉死細(xì)胞及未粘附細(xì)胞。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)以將100 μL A549細(xì)胞加載到含PPy-ITO微電極的測量小池作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，將不含A549細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液加載到含GO/PPy-ITO微電極的測量小池作為空白對(duì)照。隨后，在測量小池內(nèi)加入500 μL 0.01 mol/L PBS作為支持電解質(zhì)，將鉑絲對(duì)電極和Ag/AgCl參比電極插入測量小池進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜測量。電化學(xué)阻抗譜測量在開路電壓下對(duì)傳感電極施加幅值為10mV的正弦波交流檢測信號(hào)，檢測信號(hào)掃描頻率范圍為1 Hz～100 000 Hz，阻抗譜測量數(shù)據(jù)用ZView 2.0軟件NC，USA（Scribner Associates South?ern Pines）建立等效電路后進(jìn)行擬合分析。

2　結(jié)果和討論

2.1GO/PPy-ITO微電極的制備及形態(tài)學(xué)表征

采用感光干膜作為絕緣層加工出的ITO微電極如圖2（a）上所示，其中ITO微電極直徑為1 mm。本方法制備ITO微電極簡單，降低了加工成本，同時(shí)使微電極具有較低的接觸電阻［26］。以ITO微電極為工作電極，通過一步法電聚合技術(shù)成功在ITO微電極表面沉積一層均勻的黑灰色沉積物，如圖2（a）下所示。在本研究中，聚合溶液中只含GO和Py單體，攜帶負(fù)電荷功能基團(tuán)的GO作為吡咯電聚合過程中唯一的摻雜劑平衡PPy骨架上的正電荷，進(jìn)而形成GO/PPy納米復(fù)合物［23-24］。同時(shí)，研究提示GO和芳香族聚吡咯環(huán)間的π-π鍵作用及氫鍵結(jié)合在GO/PPy納米復(fù)合物形成中也扮演重要作用［23］。如果聚合溶液中只有Py單體，施加相同的聚合電壓沒有PPy膜形成（數(shù)據(jù)未給出），提示GO是Py電聚合過程中必須的唯一摻雜劑。

材料表面粗糙度是電極表面PPy涂層最重要的參數(shù)之一，同時(shí)影響著PPy涂層的細(xì)胞生物相容性［28］。大量研究實(shí)驗(yàn)顯示，電聚合PPy表面粗糙度由摻雜劑類型、Py單體濃度及電聚合參數(shù)等決定［27］。圖2（c）為GO/PPy納米復(fù)合膜表面三維拓?fù)湫蚊埠痛植诙?。結(jié)果顯示，GO/PPy納米復(fù)合物比純PPy膜具有更加平整的表面三維形貌，表面平均粗糙度為0.015 μm，遠(yuǎn)低于純PPy表面2.267 μm的表面平均粗糙度。GO/PPy納米復(fù)合膜和純PPy膜表面粗糙度的差異推測與電聚合過程中的Py成核和生長機(jī)制有關(guān)［29］。

GO/PPy納米復(fù)合物的表面形貌進(jìn)一步通過SEM進(jìn)行觀察。圖3為一步法電聚合制備的GO/ PPy納米復(fù)合物和純PPy膜的SEM圖像。相比純PPy（圖3（a）、3（b））典型的油菜花結(jié)構(gòu)特征，GO/PPy納米復(fù)合物（圖3（c）、3（d））呈現(xiàn)更為平整的表面，該結(jié)果與上述表面粗糙度測量結(jié)果相符。仔細(xì)觀察GO/PPy納米復(fù)合物表面（圖3（d））發(fā)現(xiàn)大量分布的微孔結(jié)構(gòu)。圖3（e）為GO/PPy納米復(fù)合物截面SEM圖像，該結(jié)構(gòu)與化學(xué)方法合成的GO/PPy納米復(fù)合物之間有顯著差異［30］，與文獻(xiàn)［23］報(bào)道的通過電聚合途徑制備的GO/PPy納米復(fù)合物高度疏松多孔的結(jié)構(gòu)特征相吻合。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)GO/PPy納米復(fù)合物的成功制備。

圖2　一步法電聚合制備的GO/PPy-ITO微電極

2.2GO/PPy-ITO微電極的電化學(xué)性能表征

圖4（a）為GO/PPy-ITO微電極、PPy-ITO微電極和裸ITO微電極的頻率阻抗曲線。結(jié)果顯示，在低頻段（1 Hz～4.8 kHz），電聚合PPy涂層顯著降低ITO微電極的阻抗值。其原因在于PPy涂層增加了電極表面粗糙度和表面積，提高了電極表面雙分子層電容，從而降低電極阻抗［31］。在本研究中，GO/PPy-ITO微電極和PPy-ITO微電極之間的頻率阻抗特性無明顯差異?？紤]到GO/PPy-ITO微電極和PPy-ITO微電極間表面拓?fù)湫蚊膊町惷黠@，因此其原因推測可能與GO和PPy兩者間相互協(xié)同結(jié)果有關(guān)。在當(dāng)前研究中，大多數(shù)細(xì)胞阻抗生物傳感器采用裸傳感電極，但由于傳感電極在低頻范圍區(qū)間（＜10 kHz）的阻抗值較高，因此細(xì)胞阻抗檢測時(shí)只能設(shè)定在高頻率區(qū)間（＞10 kHz），以此降低傳感電極本征阻抗值，從而提高傳感器檢測靈敏度。然而，電極表面上細(xì)胞作為頻率依賴性電學(xué)元件，不同的頻率范圍分布包含不同的細(xì)胞信息，如低頻率阻抗信號(hào)可用于細(xì)胞類型判斷［32］。因此，基于GO/PPy-ITO微電極的細(xì)胞阻抗傳感器具有在更寬頻率范圍內(nèi)獲取細(xì)胞信息的潛力。圖4（b）為GO/PPy-ITO微電極、PPy-ITO微電極和裸ITO微電極的頻率相位角曲線。結(jié)果可知，PPy涂層的修飾顯著降低了裸ITO微電極的相位角值，其原因在于PPy涂層內(nèi)包含大量空隙，電解質(zhì)滲入空隙內(nèi)使電極更呈電阻特性［31］。同時(shí)，GO/PPy-ITO微電極在高頻段（＞17 Hz）相位角低于PPy-ITO微電極相位角，在1kHz時(shí)相位角接近為0，其原因推測與GO/PPy納米復(fù)合物內(nèi)部分布的大量微孔有關(guān)。同時(shí)，該結(jié)果也提示GO/PPy納米復(fù)合物在高頻段（＞100 Hz）為電阻性材料，而在低頻段（＜100 Hz）趨向?yàn)殡娙菪圆牧稀?/p>

圖4　電化學(xué)性能表征

另一方面，作為細(xì)胞傳感電極，除具有低阻抗特性外，高電荷容量也是非常重要的參數(shù)。由于電化學(xué)循環(huán)伏安曲線下面積與電極的充電容量成正比，因此可用電化學(xué)循環(huán)伏安法對(duì)電極的充電容量進(jìn)行評(píng)估。圖4（c）為GO/PPy-ITO微電極、PPy-ITO微電極和裸ITO微電極在0.01 M PBS溶液中典型CV曲線。與裸ITO微電極相比，PPy修飾電極能夠顯著增加電極電荷容量。此外，隨著掃描循環(huán)數(shù)增加，PPy-ITO微電極的氧化峰電流值明顯降低且氧化電壓右移，10個(gè)循環(huán)后電容量為循環(huán)前的74%，提示PPy-ITO微電極的電活性和導(dǎo)電性降低。相反，GO/PPy-ITO微電極的電荷容量在10循環(huán)數(shù)后為循環(huán)前的95%，提示GO/PPy具有良好的電化學(xué)穩(wěn)定性，其原因推測于GO與PPy骨架緊密耦合形成的特殊結(jié)構(gòu)、電化學(xué)機(jī)械性能有關(guān)［23］。在第10個(gè)循環(huán)時(shí)，GO/PPy-ITO微電極的電容容量為287.12 mC/cm-2，大于PPy-ITO微電極的196.32 mC/cm-2的電容容量。其原因推測可歸結(jié)于兩個(gè)方面，一方面為GO摻雜進(jìn)PPy內(nèi)增加了涂層內(nèi)部表面積提高了電荷容量，另一方面GO與PPy間的π-π堆疊有利于加速電荷轉(zhuǎn)移［24］。

2.3GO/PPy納米復(fù)合膜的生物相容性表征

GO/PPy納米復(fù)合膜與細(xì)胞相互作用通過細(xì)胞粘附、鋪展和增殖來表征。圖5為A549細(xì)胞在GO/PPy膜和PPy膜表面接種2 h時(shí)的粘附相差圖像和接種12 h時(shí)鋪展細(xì)胞骨架熒光圖像。

圖5　A549細(xì)胞粘附和鋪展（標(biāo)尺為20 μm）

細(xì)胞粘附圖像（圖5（a）和5（b））顯示接種在GO/PPy膜和PPy膜上的A549細(xì)胞均開始伸出偽足和粘附，提示電聚合的PPy膜能夠支持A549細(xì)胞的粘附，其原因在于PPy膜能夠吸附溶液中的蛋白并促進(jìn)細(xì)胞的粘附［33］。同時(shí)，仔細(xì)觀察圖5（a）、5（b），發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞在GO/PPy膜上的鋪展比例高于PPy膜，其原因推測與兩者表面的物理化學(xué)性質(zhì)存在差異有關(guān)，如表面粗糙度、親水性等。為進(jìn)一步證實(shí)GO/PPy和PPy膜對(duì)A549細(xì)胞鋪展的影響，對(duì)接種在GO/PPy和PPy膜上12 h的A549細(xì)胞熒光染色細(xì)胞骨架進(jìn)行觀察，如圖5（c）（D）所示。結(jié)果顯示A549細(xì)胞在GO/PPy膜的數(shù)量和鋪展?fàn)顟B(tài)優(yōu)于在PPy膜上的鋪展。上述結(jié)果提示了一步法電聚合制備的GO/PPy膜能夠支持A549細(xì)胞的粘附和鋪展，為細(xì)胞增殖提供良好的生物相容性界面。

A549細(xì)胞在GO/PPy膜、PPy膜和聚苯乙烯基底上分別接種24 h和48 h時(shí)的細(xì)胞相對(duì)增殖活性通過WST-8比色法進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果可見，A549細(xì)胞在GO/PPy膜上的相對(duì)細(xì)胞增殖活性高于聚苯乙烯和PPy，提示GO/PPy膜對(duì)A549細(xì)胞增殖具有優(yōu)秀的細(xì)胞相容性。另外，A549細(xì)胞在PPy膜的相對(duì)細(xì)胞增殖率最低，其原因在于培養(yǎng)過程中PPy膜內(nèi)摻雜的Cl離子溢出抑制了A549細(xì)胞增殖［33］。該結(jié)果說明一步法電聚合制備的GO/PPy納米復(fù)合膜對(duì)A549細(xì)胞增殖具有優(yōu)良的細(xì)胞生物相容性。

2.4GO/PPy-ITO微電極上A549細(xì)胞粘附增殖行為電化學(xué)阻抗譜檢測

GO/PPy-ITO微電極上A549細(xì)胞的粘附增殖行為采用了電子細(xì)胞基底阻抗傳感技術(shù)ECIS（Electric Cell-Substrate Impedance Sensing）原理進(jìn)行檢測。ECIS技術(shù)最早由Giaever和Keesed等［1，34］報(bào)道，采用平面金微電極作為檢測電極，其基本原理為：當(dāng)貼壁性細(xì)胞在金微電極表面粘附和增殖時(shí)，細(xì)胞作為一個(gè)不良導(dǎo)體元件阻礙電流從微電極流進(jìn)電解質(zhì)，使整個(gè)電極系統(tǒng)阻抗增大。當(dāng)進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜檢測時(shí)，部分高頻區(qū)域的交流電壓檢測信號(hào)能夠與細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生電容性耦合使電流直接穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入電解質(zhì)；對(duì)于大部分低頻檢測信號(hào)，電極電流主要通過細(xì)胞-電極間的狹窄通道和細(xì)胞-細(xì)胞間的間隙進(jìn)入電解質(zhì)。由于不同檢測頻率對(duì)應(yīng)不同的電流路徑，而不同電流路徑反應(yīng)不同的阻抗信息，因此通過對(duì)測量的電化學(xué)阻抗譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析可分離并量化不同電路路徑對(duì)應(yīng)的阻抗信息，從而間接獲取傳感電極表面細(xì)胞生物學(xué)行為信息。在本研究中，以制備的GO/PPy-ITO微電極代替金微電極作為檢測電極，A549細(xì)胞接種0、2 h、24 h、48 h和72 h時(shí)電極系統(tǒng)典型的電化學(xué)阻抗譜復(fù)平面圖如圖7（A）左所示，結(jié)果顯示隨著接種時(shí)間延長，電極系統(tǒng)阻抗譜特征發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)在高頻區(qū)傳荷過程控制的特征半圓直徑增大。該結(jié)果說明A549細(xì)胞的粘附增殖行為導(dǎo)致電極界面上離子電荷轉(zhuǎn)移速度減慢和電子轉(zhuǎn)移阻抗增大，其原因與細(xì)胞質(zhì)膜電容特征和離子導(dǎo)通性有關(guān)［35］。同時(shí)，空白對(duì)照GO/PPy-ITO微電極的阻抗譜特征在培養(yǎng)液中孵育不同時(shí)間后未出現(xiàn)傳荷控制特征半圓，如圖7（A）右所示，說明GO/PPy在培養(yǎng)液環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性，同時(shí)提示圖7（a）左的阻抗譜特征改變是由細(xì)胞粘附增殖引起。圖7（b）為接種A549細(xì)胞不同時(shí)間后相對(duì)于接種細(xì)胞前電極系統(tǒng)的頻率阻抗變化曲線和頻率相位角變化曲線。頻率阻抗變化曲線顯示，在低頻區(qū)域（1 Hz～10 000 Hz），細(xì)胞的粘附和增殖導(dǎo)致電極系統(tǒng)阻抗值增大，而高頻區(qū)域（10 kHz～100 kHz）電極系統(tǒng)阻抗值變化與檢測頻率相關(guān)，且隨著檢測頻率值增大阻抗值變化減少。此外，頻率相位角變化曲線顯示細(xì)胞在高頻區(qū)域（10 kHz～100 kHz）出現(xiàn)一個(gè)明顯的時(shí)間常數(shù)。根據(jù)ECIS原理可知，電化學(xué)阻抗譜低頻區(qū)域主要反應(yīng)細(xì)胞-電極間和細(xì)胞-細(xì)胞間的信息，高頻區(qū)域則反應(yīng)細(xì)胞質(zhì)膜信息，因此根據(jù)電極系統(tǒng)電化學(xué)阻抗譜特征變化實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞粘附增殖過程進(jìn)行初步分析。

A549細(xì)胞在電極表面粘附增殖行為采用等效電路模型進(jìn)行量化分析。GO/PPy-ITO微電極可由含Warburg電阻元件的Randles`電路的等效電路進(jìn)行良好擬合，電極系統(tǒng)初始值見圖7（c）。另外，根據(jù)細(xì)胞接種前后電極系統(tǒng)的阻抗譜特征變化，細(xì)胞可等效為一個(gè)RC并聯(lián)電路和一個(gè)R元件串聯(lián)組成［32］。因此，接種細(xì)胞后電極系統(tǒng)的等效電路模型由GO/PPy-ITO微電極等效電路和細(xì)胞等效電路模型串聯(lián)而成，如圖7（c）示。其中，細(xì)胞等效電路中R`s解釋為細(xì)胞-電極的間隙電阻，Rcell解釋為細(xì)胞-細(xì)胞間電阻，Ccell解釋為細(xì)胞質(zhì)膜的電容效應(yīng)。采用非線性最小二乘法曲線擬合技術(shù)對(duì)電化學(xué)阻抗譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到接種不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞等效電路各元件擬合結(jié)果，如圖7（d）所示。結(jié)果顯示，隨著A549細(xì)胞在GO/PPy-ITO微電極表面的粘附和增殖，Ccell在2 h～24 h迅速降低，細(xì)胞完全鋪展至形成生長形成細(xì)胞單層（24 h～72 h），Ccell穩(wěn)定在5.8 nF～6.5 nF，低于A549細(xì)胞在PPy-ITO微電極表面的10.2 nF～10.6 nF。該值變化與細(xì)胞粘附增殖過程中細(xì)胞厚度降低、鋪展面積增大、細(xì)胞離子通道數(shù)量和開閉有關(guān)［36］。A549細(xì)胞在GO/PPy-ITO表面增殖中的Rcell值持續(xù)增大，72 h時(shí)Rcell值達(dá)到最大，約為1864 Ω，而在PPy-ITO表面在48 h達(dá)到最大，約為1 068 Ω。由于Rcell值持續(xù)增加反應(yīng)細(xì)胞-細(xì)胞間的間隙縮小，細(xì)胞融合度增加［37］，因此說明A549細(xì)胞在GO/PPy表面增殖活性優(yōu)于PPy表面，該結(jié)果與WST-8比色法分析吻合。此外，A549細(xì)胞在GO/PPy-ITO表面R`s值在接種48 h后達(dá)到最大，約為221 Ω，在72 h時(shí)降低為192.5 Ω。R`s值的變化提示在48 h時(shí)細(xì)胞與GO/PPy-ITO電極間間隙最小，細(xì)胞粘附強(qiáng)度最強(qiáng)，細(xì)胞的進(jìn)一步增殖導(dǎo)致細(xì)胞與GO/PPy-ITO電極間隙增大，細(xì)胞開始脫落［37］。此外，結(jié)果還顯示A549細(xì)胞在PPy-ITO表面接種48 h后R`s值達(dá)到160 Ω最大值，低于GO/PPy-ITO測量值，提示A549細(xì)胞與GO/PPy表面粘附強(qiáng)度高于PPy。

3　結(jié)論

本研究發(fā)展一種基于GO/PPy-ITO微電極的細(xì)胞阻抗生物傳感器，并通過對(duì)A549細(xì)胞粘附增殖檢測對(duì)構(gòu)建的細(xì)胞阻抗傳感器進(jìn)行原理性驗(yàn)證。GO/PPy-ITO微電極采用一步法電聚合技術(shù)在ITO微電極表面原位沉積GO/PPy納米復(fù)合物制備而成；通過對(duì)GO/PPy-ITO微電極的表面粗糙度、拓?fù)湫蚊?、電化學(xué)性能及細(xì)胞生物相容性進(jìn)行詳細(xì)表征，顯示GO/PPy-ITO微電極具有平整的表面形貌、疏松多孔結(jié)構(gòu)特征、優(yōu)良的電化學(xué)活性和穩(wěn)定性及良好的細(xì)胞生物相容性；在此基礎(chǔ)上，以制備的GO/PPy-ITO微電極作為傳感電極，利用電化學(xué)阻抗譜技術(shù)和等效電路擬合技術(shù)成功對(duì)微電極表面上的A549細(xì)胞粘附增殖行為學(xué)信息進(jìn)行檢測；本研究不但證實(shí)了通過簡單的一步法電聚合制備的GO/PPy納米復(fù)合物能夠作為細(xì)胞傳感器潛在的納米傳感界面，而且證實(shí)了基于GO/PPy-ITO微電極構(gòu)建的細(xì)胞阻抗傳感器能夠成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞粘附增殖行為學(xué)檢測，未來將廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞分析及藥物效應(yīng)研究中。

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李遠(yuǎn)（1985-），男，重慶醫(yī)科大學(xué)，博士研究生，主要研究方向?yàn)槲⒘骺匦酒凹?xì)胞生物傳感器，liyuan_1985999@ 163.com；

劉北忠（1970-），男，重慶醫(yī)科大學(xué)，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)微納米技術(shù)與系統(tǒng)、腫瘤分子診療靶點(diǎn)篩選等，lbzemail@163.com。

EEACC：7230J10.3969/j.issn.1004-1699.2016.06.001

基于氧化石墨烯/聚吡咯-銦錫氧化物微電極的細(xì)胞阻抗生物傳感器構(gòu)建及細(xì)胞粘附增殖行為檢測*

李遠(yuǎn)1，2，張晶1，廖娟1，王條敏1，劉北忠1*，于超2，張玲玲1
（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶402160；2.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶400016）

構(gòu)建一種基于氧化石墨烯/聚吡咯-銦錫氧化物GO/PPy-ITO（Graphene Oxide/Polypyrrole-Indium Tin Oxide）微電極的細(xì)胞阻抗生物傳感器并用于細(xì)胞粘附增殖行為學(xué)檢測。ITO微電極采用光刻技術(shù)對(duì)感光干膜絕緣層蝕刻而成，通過一步法電聚合技術(shù)在ITO微電極表面沉積GO/PPy納米復(fù)合膜制備GO/PPy-ITO微電極；形狀測量激光顯微鏡和掃描電子顯微鏡分別對(duì)GO/ PPy表面粗糙度和拓?fù)湫蚊策M(jìn)行表征；電化學(xué)循環(huán)伏安法及阻抗譜表征GO/PPy-ITO微電極的電化學(xué)性質(zhì)；人肺癌細(xì)胞株A549粘附、鋪展和增殖實(shí)驗(yàn)考察GO/PPy界面的生物相容性；以GO/PPy-ITO微電極作為傳感電極，利用電化學(xué)阻抗譜技術(shù)對(duì)A549細(xì)胞的粘附增殖行為進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，ITO微電極表面上電沉積的GO/PPy納米復(fù)合物表面平整，分布大量的微孔結(jié)構(gòu)；電化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GO/PPy-ITO微電極比裸ITO微電極具有更低的阻抗特征和更高的電化學(xué)活性；GO/PPy比純PPy膜更能促進(jìn)A549細(xì)胞粘附、鋪展和增殖；GO/PPy-ITO微電極表面A549細(xì)胞的粘附增殖行為改變電極系統(tǒng)的阻抗譜特征，通過對(duì)阻抗譜數(shù)據(jù)進(jìn)行等效電路擬合分析獲得細(xì)胞粘附增殖行為學(xué)信息。本文發(fā)展的GO/PPy-ITO微電極兼具優(yōu)良的電化學(xué)性質(zhì)和細(xì)胞生物相容性，基于該電極系統(tǒng)構(gòu)建的細(xì)胞阻抗生物傳感器可用于細(xì)胞病理生理學(xué)行為、藥物篩選等研究領(lǐng)域。

2015-12-07修改日期：2016-02-02

生物傳感器；電化學(xué)阻抗檢測；氧化石墨烯；聚吡咯；銦錫氧化物；細(xì)胞增殖

TP212.3

A

1004-1699（2016）06-0787-10

項(xiàng)目來源：重慶市科委自然科學(xué)基金計(jì)劃資助項(xiàng)目（CSTC2012JJA10046）；重慶市永川區(qū)創(chuàng)新能力建設(shè)平臺(tái)項(xiàng)目（YCSTC，2014bf5001）；重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院院級(jí)研究項(xiàng)目（YJZD201302，YJZQN201534）資助