YAP1和β-catenin在大腸癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

陳順華，尹　玉，曹立宇，張　聰，李玉潔

YAP1和β-catenin在大腸癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

陳順華1，2，尹玉1，2，曹立宇1，2，張聰1，2，李玉潔1，2

目的 探討Yes相關(guān)蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在大腸癌組織中的表達(dá)及其與腸癌患者臨床病理因素間的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)Envision二步法檢測(cè)YAP1和β-catenin在99例人大腸癌組織及30例正常腸黏膜組織中的表達(dá)狀況。結(jié)果

YAP1蛋白在大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為56.57%（56/ 99），顯著高于正常腸黏膜組織16.67%（5/30）（Χ2= 14.704，P＜0.01）；β-catenin蛋白在大腸癌組織中的異位（細(xì)胞質(zhì)/核）表達(dá)率為51.52%（51/99），明顯高于正常腸黏膜組織0%（0/30）（Χ2=25.559，P＜0.01）。YAP1蛋白的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Duke′s分期均無(wú)關(guān)；β-catenin蛋白的細(xì)胞核表達(dá)與大腸癌的分化程度及浸潤(rùn)深度相關(guān)（Χ2=6.641、4.229，P＜0.05）；β-catenin蛋白的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)水平與大腸癌的分化程度相關(guān)（Χ2=6.761，P＜0.05）；β-catenin蛋白的細(xì)胞膜表達(dá)水平與臨床病理因素均無(wú)關(guān)。β-catenin蛋白細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的表達(dá)與YAP1細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)呈正相關(guān)性（P＜0.05）；β-catenin蛋白細(xì)胞核表達(dá)與YAP1細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)呈正相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論 YAP1和β-catenin在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用，β-catenin細(xì)胞的核表達(dá)可能有助于大腸癌的預(yù)后判斷。

大腸癌；YAP1；β-catenin；免疫組織化學(xué)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.034.html

大腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展與個(gè)體因素及環(huán)境因素有關(guān)，在這一過(guò)程中有一系列與信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)的基因參與［1］。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路控制細(xì)胞的增殖、分化和形態(tài)形成，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）作為Wnt信號(hào)通路的重要成員，介導(dǎo)Wnt信號(hào)通路的異常激活，與大腸癌的發(fā)生關(guān)系密切［2］。Hippo信號(hào)通路最初在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路。Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）是YAP1基因的編碼產(chǎn)物，因此YAP也被稱為YAP1。YAP1（Yes-associated protein 1）是Hippo通路的下游信號(hào)分子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡的作用。Hippo通路中的其它因子可通過(guò)磷酸化負(fù)性調(diào)控YAP，而該通路的異常調(diào)節(jié)可促進(jìn)YAP的過(guò)表達(dá)，見于多個(gè)人類腫瘤包括結(jié)腸癌［3-4］。國(guó)外最新研究［5］提示YAP過(guò)表達(dá)可協(xié)同β-catenin促進(jìn)腸道干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的增殖。該實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)YAP1和β-catenin在大腸癌中的表達(dá)，探討Hippo及Wnt信號(hào)通路在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用、相互關(guān)系及臨床意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2010年7月～2013年12月間大腸癌手術(shù)切除標(biāo)本99例，所有病例術(shù)前未接受放療、化療及其它針對(duì)腫瘤的特殊治療，術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)。另取30例距大腸癌灶邊緣5 cm以上的正常大腸黏膜組織作為對(duì)照。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，常規(guī)4 μm連續(xù)切片，分別作HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.1.2主要試劑 兔抗人YAP1多克隆抗體和兔抗人β-catenin多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；免疫組織化學(xué)Envision二步法染色試劑盒及檸檬酸修復(fù)液（pH 6.0）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 免疫組織化學(xué)染色（Envision二步法）參照試劑盒說(shuō)明書操作，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定 YAP1免疫組化染色表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin可定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞呈黃/棕黃色顆粒。采用半定量方法［6］判斷結(jié)果：①按細(xì)胞染色強(qiáng)弱評(píng)分：0分，不著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色；②選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比：0分，＜10%；1分，10%～25%；2分，25%～50%；3分，50%～75%；4分，＞75%。按①、②乘積判斷結(jié)果：0～4為陰性，5～12為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用采用Χ2檢驗(yàn)方法及Fisher精確概率法比較各組間的差異，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1YAP1和β-catenin蛋白在大腸癌組織和正常大腸黏膜組織中的表達(dá) 在大腸癌組織中，YAP1可定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，其陽(yáng)性表達(dá)率為56.57%（56/99），其中細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)/核同時(shí)表達(dá)的陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.57%（56/99）、44.44%（44/99）、44.44%（44/99）；在大腸癌組織中，β-catenin可定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，其異位（細(xì)胞質(zhì)/核）表達(dá)率為51.52%（51/99），其中細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及核質(zhì)同時(shí)表達(dá)的陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.53%（52/99）、32.32%（32/99）、37.37%（37/99）、18.18%（18/99）。YAP1和βcatenin蛋白在30例正常大腸黏膜組織中的表達(dá)率分別為16.67%（5/30）、0%（0/30）。YAP1蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常大腸黏膜組織（Χ2=14.704，P＜0.01），β-catenin蛋白在大腸癌組織中的異位表達(dá)顯著高于正常大腸黏膜組織（Χ2= 25.559，P＜0.01）。見圖1～2。

2.2大腸癌中YAP1和β-catenin蛋白表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系 YAP1蛋白表達(dá)水平與臨床病理因素均無(wú)關(guān)（表1）。β-catenin蛋白的細(xì)胞核表達(dá)水平與大腸癌的分化程度及浸潤(rùn)深度相關(guān)（Χ2= 6.641、4.229，P＜0.05），與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Duke′s分期均無(wú)關(guān)；β-catenin蛋白的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)水平與大腸癌的分化程度相關(guān)（Χ2= 6.761，P＜0.05），與其它臨床病理因素?zé)o關(guān)；βcatenin蛋白的細(xì)胞膜表達(dá)水平與臨床病理因素均無(wú)關(guān)，見表2。

2.3YAP1和β-catenin蛋白在大腸癌組織中表達(dá)之間的關(guān)系 YAP1和β-catenin蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)經(jīng)Pearson等級(jí)相關(guān)分析處理后顯示：βcatenin細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)與YAP1細(xì)胞核及YAP1細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)呈正相關(guān)性（r=0.208，P=0.039；r= 0.208，P=0.039）；β-catenin細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)與YAP1細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.126，P=0.213）。βcatenin細(xì)胞核的表達(dá)與YAP1細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)均呈正相關(guān)性（r=0.214，P=0.034；r=0.317，P=0.001；r=0.317，P=0.001）。β-catenin細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)和YAP1細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)均無(wú)相關(guān)性（r=0.096，P=0.344；r= 0.158，P=0.118；r=0.096，P=0.344）。見表3。

圖1　YAP1在大腸正常組織和大腸癌組織中的表達(dá) ×200A：大腸正常組織；B：高分化腸癌組織；C：中分化腸癌組織；D：低分化腸癌組織

圖2　β-catenin在大腸正常組織和大腸癌組織中的表達(dá) ×200A：大腸正常組織；B：高分化腸癌組織；C：中分化腸癌組織；D：低分化腸癌組織

表1　大腸癌組織中YAP1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系（n）

表2　大腸癌組織中β-catenin的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系（n）

3　討論

Wnt信號(hào)通路是控制細(xì)胞增殖、分化和形態(tài)形成最重要的通路之一。β-catenin最早作為一種黏附因子被發(fā)現(xiàn)，主要由CTNNB1基因編碼。β-catenin可存在于細(xì)胞的不同部位：①和E-cadherin相互作用，定位于細(xì)胞膜；②定位于細(xì)胞質(zhì)；③定位于細(xì)胞核。β-catenin是Wnt信號(hào)通路最重要的效應(yīng)因子，其穩(wěn)定性受糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）、結(jié)直腸腺瘤息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）以及軸蛋白（andaxin）組成的蛋白復(fù)合體即APC復(fù)合體的調(diào)節(jié)。在WNT受體失活的情況下，β-catenin定位于細(xì)胞膜，APC復(fù)合體中的激酶會(huì)磷酸化胞質(zhì)中的β-catenin從而使其迅速降解。相反，WNT與Frizzled和LRP共受體結(jié)合，可抑制APC復(fù)合體活性，使β-catenin聚集于細(xì)胞質(zhì)進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）形成復(fù)合體，刺激下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。該信號(hào)通路參與干細(xì)胞和祖細(xì)胞的自我更新，其異常調(diào)節(jié)會(huì)與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)，見于惡性黑色素瘤、肝癌、甲狀腺癌、卵巢癌及結(jié)直腸癌等［7-8］。多種惡性腫瘤中β-catenin蛋白的異常改變主要表現(xiàn)為β-catenin在細(xì)胞質(zhì)/核的異常累積以及β-catenin膜表達(dá)的缺失。據(jù)研究［2］，90%以上的大腸癌中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子都發(fā)生了突變，主要發(fā)生在APC或者β-catenin，從而引起該通路的激活，80%以上的大腸癌Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致β-catenin表達(dá)于細(xì)胞核。本研究結(jié)果顯示β-catenin在大腸癌中的異位（細(xì)胞質(zhì)/核）表達(dá)率為51.52%（51/99），顯著高于正常腸黏膜0%（0/30），提示β-catenin在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。本研究中βcatenin的異位表達(dá)與腫瘤分化存在相關(guān)關(guān)系，提示β-catenin異常表達(dá)與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化聯(lián)系緊密，βcatenin細(xì)胞核的表達(dá)與腸癌的浸潤(rùn)深度相關(guān)，提示β-catenin異常表達(dá)與疾病進(jìn)展聯(lián)系緊密。

表3　大腸癌組織中YAP1和β-catenin蛋白表達(dá)之間的關(guān)系（n）

YAP1是Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白，其在細(xì)胞內(nèi)的定位主要取決于是否磷酸化。當(dāng)Hippo通路激活，會(huì)使YAP磷酸化，磷酸化的YAP與胞質(zhì)中的14-3-3蛋白相互作用并聚集在胞質(zhì)中。一旦Hippo通路失活，YAP就會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與TEAD結(jié)合，促進(jìn)生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）及表皮生長(zhǎng)因子家族成員之一的雙調(diào)蛋白（AREG）等［4］，提示Hippo信號(hào)通路通過(guò)磷酸化負(fù)調(diào)控YAP，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，使其聚集在胞質(zhì)，不能轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并促進(jìn)靶基因的表達(dá)。在人類多種腫瘤中，如食道癌、胃癌、卵巢癌、結(jié)腸癌中均可見YAP過(guò)表達(dá)及核定位表達(dá)，YAP在細(xì)胞核的高表達(dá)可作為評(píng)判預(yù)后的指標(biāo)［3，9-11］。本研究結(jié)果顯示YAP1在大腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為56.57%（56/99），顯著高于正常黏膜16.67%（5/30），提示YAP1在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。Wang et al［12］應(yīng)用免疫組化法發(fā)現(xiàn)YAP在腸癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期存在顯著相關(guān)性。而本研究中YAP1的表達(dá)與臨床病理因素間均無(wú)相關(guān)性，可能是由于選取病例數(shù)量有限，需通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

有文獻(xiàn)［13］報(bào)道，Hippo信號(hào)通路的下調(diào)和βcatenin信號(hào)通路的上調(diào)有關(guān)，可見于大腸癌。這一相關(guān)關(guān)系主要是因?yàn)榱姿峄腨AP可與胞質(zhì)中的β-catenin結(jié)合從而阻止β-catenin的核轉(zhuǎn)移。有報(bào)道［14］顯示YAP誘導(dǎo)的腸的發(fā)育異?？纱偈功?catenin核定位的增加，暗示著Wnt通路的激活。研究［15］顯示人類大腸癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)異?？纱龠M(jìn)YAP的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示YAP1和β-catenin呈正相關(guān)性，主要體現(xiàn)在β-catenin細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)與YAP1細(xì)胞核及YAP1細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)呈正相關(guān)性；β-catenin細(xì)胞核的表達(dá)和YAP1細(xì)胞質(zhì)、YAP1細(xì)胞核及YAP1細(xì)胞質(zhì)/核的表達(dá)的表達(dá)呈正相關(guān)性。與上述報(bào)道的結(jié)果一致，提示YAP1和β-catenin在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在協(xié)同的作用，也暗示了Hippo信號(hào)通路與Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腸癌的發(fā)展過(guò)程中存在相互作用。但YAP1和β-catenin在大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中相互作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，YAP1和β-catenin的異常表達(dá)與大腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，為進(jìn)一步研究大腸癌發(fā)病的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

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Expression and relationship of YAP1 and β-catenin in colorectal carcinoma

Chen Shunhua1，2，Yin Yu1，2，Cao Liyu1，2，et al
（1Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Patholgoy，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the expression of Yes-associated protein 1（YAP1）and β-catenin in colorectal carcinoma tissues and their association with the clinicopathological features of colorectal carcinoma patients. Methods The expressions YAP1 and β-catenin in human colorectal carcinoma and colorectal normal tissue（99 cases of human colorectal carcinoma，30 cases of colorectal normal tissues）were detected by immunohistochemistry Envision two step method.Results The positive rate of YAP1 in CRC（56.57%）was higher than that in normal mucosa（16.67%）（Χ2=14.704，P＜0.01）.The abnormal positive rate of β-catenin in CRC（51.52%）was higher than that in normal mucosa（0%）（Χ2=25.559，P＜0.01）.The expression of YAP1 showed no significant correlation with sex，age，differentiation，infiltration，lymph node metastasis and Duke′s period.The nuclear β-catenin expression was correlated with the differentiation degree and depth of invasion（Χ2=6.641，4.229，P＜0.05）.The cytoplasmic β-catenin expression was correlated with the differentiation degree（Χ2=6.761，P＜0.05）.The membranal β-catenin expression showed no significant correlation with clinicopathological parameters.The cytoplasmic β-catenin expression and nuclear β-catenin expression was postively correlated with the nuclear YAP1 expression and cytoplasmic/nuclear YAP1 expression（P＜0.05）.The nuclear β-catenin expression was postively correlated with the cytoplasmic YAP1 expression（P＜0.05）.Conclusion YAP1 and β-catenin proteins play important roles together in the carcinogehesis of CRC.The nuclear β-catenin expression may contribute to colorectal carcinoma prognosis judgement.

colorectal carcinoma；YAP1；β-catenin；immunohistochemistry

R 735.34

A

1000-1492（2016）06-0836-05

2016-03-23接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81201536）；安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2013A150）

1安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 2300322安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，合肥 230022

陳順華，女，碩士研究生；尹 玉，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aydyinyu@aliyun.com；曹立宇，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：caoliyuhf@163.com