改進(jìn)的流式細(xì)胞積分對(duì)骨髓增生異常綜合征診斷價(jià)值的研究

郭進(jìn)京，王會(huì)平，熊術(shù)道，孫　磊，翟志敏

改進(jìn)的流式細(xì)胞積分對(duì)骨髓增生異常綜合征診斷價(jià)值的研究

郭進(jìn)京1，2，3，王會(huì)平1，2，熊術(shù)道1，2，孫磊1，2，翟志敏1，2

篩選94例患者評(píng)價(jià)改進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)（FCM）積分在骨髓增生異常綜合征（MDS）中的診斷效能。用抗體組合CD34/CD19/CD33/CD45分析四參數(shù)流式積分，通過(guò)CD19和CD33將B系和髓系前體細(xì)胞分離。對(duì)疑為MDS的患者行流式積分，評(píng)價(jià)兩種方法的診斷參數(shù)。改進(jìn)的積分有更高的診斷參數(shù)。11例通過(guò)改進(jìn)的方案改變積分，其中5例因積分改變獲得正確診斷。改進(jìn)積分實(shí)用方便，更好地分離B系和髓系前體細(xì)胞。

骨髓增生異常綜合征；流式細(xì)胞術(shù)；免疫表型

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：11 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.066.html

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一組克隆性源于造血干細(xì)胞的髓樣腫瘤［1］。有較高的風(fēng)險(xiǎn)演變?yōu)榧毙运柘蛋籽。?］。其年發(fā)病率每10萬(wàn)人口約為5例，60歲后年發(fā)病率增至每10萬(wàn)人口約20～50例［3］。MDS診斷主要依靠骨髓形態(tài)學(xué)檢測(cè)病態(tài)造血和細(xì)胞遺傳學(xué)克隆性改變及其他的異常，如骨髓鐵染色環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞≥15%［4］，但低危MDS患者半數(shù)初診時(shí)無(wú)上述異常。流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析細(xì)胞免疫表型的異?？蓮浹a(bǔ)形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)的不足，多個(gè)研究［5］組織標(biāo)準(zhǔn)化操作流程用FCM對(duì)MDS進(jìn)行診斷，表明FCM檢測(cè)細(xì)胞發(fā)育不良比形態(tài)學(xué)更敏感。Della Porta et al［6］整合多中心實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)制定了FCM積分四參數(shù)評(píng)分MDS，具有很高的診斷效能。該研究通過(guò)一組抗體組合，改進(jìn)設(shè)門(mén)方案來(lái)評(píng)估FCM積分四參數(shù)，并評(píng)估改進(jìn)方案的臨床診斷效能。

1　材料與方法

1.1病例資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科因外周血一系或多系減少而就診的患者108例，行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色體以及鐵染色等檢查，同時(shí)行FCM積分方案分析。參照維也納最低診斷標(biāo)準(zhǔn)和2008年WHO分型［4，7］對(duì)疑為MDS的患者進(jìn)行診斷和分類。首次檢測(cè)47例符合MDS確定標(biāo)準(zhǔn)，30例為非克隆性血細(xì)胞減少，31例為意義未明的特發(fā)性血細(xì)胞減少癥（idiopathic cytopenia of uncertain significance，ICUS）。31例ICUS患者隨訪6個(gè)月，其中7例診斷為MDS；10例失訪；11例為非MDS，其中1例因CD34+細(xì)胞過(guò)少而剔除；3例為慢性單核細(xì)胞白血病。最終確診54例MDS患者和40例非MDS患者，并納入研究，其中MDS患者男33例，女21例；年齡20～86歲，中位年齡66歲。非MDS患者男25例，女15例；年齡22～81歲，中位年齡64歲。MDS和非MDS組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.557，P=0.123）。診斷資料見(jiàn)表1。

1.2FCM積分方案的流式分析

1.2.1樣本制備 抽取新鮮骨髓，肝素抗凝，加入抗體組合，避光孵育，氯化銨溶血，上機(jī)測(cè)試。所用的抗體組合為CD34-FITC、CD19-PE、CD33-APC、CD45-PC7，所有抗體購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，使用FC500 MPL流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）進(jìn)行分析，分析軟件為EXPO 32 Multi-Comp software（美國(guó)Beckman Coulter公司）。每測(cè)試管至少計(jì)數(shù)105個(gè)有核細(xì)胞和500個(gè)CD34+細(xì)胞。

1.2.2設(shè)門(mén)策略 用上述抗體組合進(jìn)行分析，設(shè)門(mén)。如圖1所示：①在FSC和SSC散點(diǎn)圖上，設(shè)P1門(mén)去除細(xì)胞碎片，代表全部有核細(xì)胞。在P1門(mén)中選擇SSC較小的細(xì)胞群設(shè)為P2門(mén)；②P2門(mén)中的細(xì)胞表達(dá)在CD34和CD45的散點(diǎn)圖上，設(shè)置CD34+CD45dim的細(xì)胞為P3門(mén)，代表原始細(xì)胞群；③P3門(mén)中的細(xì)胞表達(dá)在CD19和CD33的散點(diǎn)圖上，CD33+CD34+CD45dim代表髓系前體細(xì)胞：D門(mén)，CD19+CD34+CD45dim代表B系前體細(xì)胞：C門(mén)，此為本研究改進(jìn)的設(shè)門(mén)方案；④P3門(mén)中的細(xì)胞表達(dá)在CD45和SSC的散點(diǎn)圖上，其中表達(dá)更低的SSC和CD45的細(xì)胞群為B系前體細(xì)胞：P5門(mén)，剩余的細(xì)胞為P4門(mén)為髓系前體細(xì)胞，此為參考文獻(xiàn)的方法分離B系和髓系前體細(xì)胞；⑤P1門(mén)中的全部有核細(xì)胞表達(dá)在CD45和SSC的散點(diǎn)圖上，P6代表淋巴細(xì)胞，P7代表粒細(xì)胞；⑥淋巴細(xì)胞CD45的平均熒光強(qiáng)度；⑦髓系前體細(xì)胞CD45的平均熒光強(qiáng)度；⑧粒細(xì)胞SSC的峰值強(qiáng)度；⑨淋巴細(xì)胞SSC的峰值強(qiáng)度。

1.3評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)文獻(xiàn)［6］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：髓系前體細(xì)胞和有核細(xì)胞的比值≥2%（參數(shù)1）；B系前體細(xì)胞和CD34+細(xì)胞的比值≤5%（參數(shù)2）；淋巴細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞CD45平均熒光強(qiáng)度的比值≤4或≥7.5（參數(shù)3）；粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞SSC峰值的比值≤6（參數(shù)4）。每個(gè)參數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分為1分，不符合為0分，總積分≥2診斷為MDS。

圖1　抗體組合CD34/CD19/CD33/CD45分析FCM積分四參數(shù)A：全部有核細(xì)胞P1和低SSC表達(dá)的P2；B：P2在CD34和CD45中的表達(dá)，CD34+CD45dim為P3；C：P3在CD19和CD33中的表達(dá)，此為改進(jìn)方案分離髓系和B系前體細(xì)胞；D：P3在CD45和SSC中的表達(dá)，此為文獻(xiàn)方案分離髓系和B系前體細(xì)胞；E：P1在CD45和SSC中的表達(dá)，P6為淋巴細(xì)胞，P7為粒細(xì)胞；F：淋巴細(xì)胞CD45的平均熒光強(qiáng)度；G：髓系前體細(xì)胞CD45的平均熒光強(qiáng)度；H：粒細(xì)胞SSC的峰值強(qiáng)度；I：淋巴細(xì)胞SSC的峰值強(qiáng)度

表1　患者診斷結(jié)果（n）

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。如參數(shù)為正態(tài)分布，兩組均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的差異比較采用Z檢驗(yàn)。使用配對(duì)四格表Χ2檢驗(yàn)比較兩種方案診斷94例患者資料的差異。

2　結(jié)果

2.1MDS組和非MDS組人口資料和四參數(shù)分析

MDS組中位積分和中位參數(shù)1明顯高于非MDS組，而中位參數(shù)2和中位參數(shù)4均明顯低于非MDS組，兩組中位參數(shù)3差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但統(tǒng)計(jì)顯示MDS組中位參數(shù)3結(jié)果不符合高斯分布，正態(tài)性檢驗(yàn)P=0.033，而非MDS組為高斯分布，正態(tài)性檢驗(yàn)P=0.791。見(jiàn)表2。

表2　MDS組和非MDS組患者人口資料和四參數(shù)分析

2.2改進(jìn)的FCM積分和文獻(xiàn)FCM積分診斷效能的比較

2.2.1改進(jìn)的FCM積分診斷MDS的效能 以≥2分診斷為MDS，54例MDS中有52例診斷正確，敏感性為96.3（49/54），40例非MDS中有5例≥2分，特異性為87.5%（35/40）。診斷符合率為92.6%［（52+35）/（54+40）］。陽(yáng)性似然比和陰性似然比分別為7.7［敏感性/（1-特異性）］和0.04［（1-敏感性）/特異性］。

2.2.2參考FCM積分診斷MDS的效能 按參考方法進(jìn)行評(píng)分，54例MDS中49例診斷符合，敏感性為90.7%，40例非MDS中7例≥2分，特異性為82.5%，診斷符合率為87.2%，陽(yáng)性似然比和陰性似然比分別為5.2和0.1。

2.2.3配對(duì)四格表比較兩種FCM積分的診斷效能兩種方案分別對(duì)94例患者進(jìn)行評(píng)分，以≥2分為界，診斷為MDS，采用配對(duì)設(shè)計(jì)四個(gè)表的Χ2檢驗(yàn)比較兩種積分的診斷效能是否有差異。兩種積分方案診斷MDS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ2=74.343，P= 1.000），且兩種方案有很強(qiáng)的診斷吻合度（k= 0.889，P=0.000）。見(jiàn)表3。

表3　改進(jìn)的流式積分和參考流式積分在診斷MDS中的比較（n）

3　討論

因MDS異質(zhì)性的特點(diǎn)，臨床診斷較為困難。形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)是確診MDS的主要檢查，而形態(tài)學(xué)的檢測(cè)易受骨髓采集、制片水平、染色因素的影響，且異質(zhì)性使細(xì)胞分化成熟障礙，在判斷分化階段上易受操作者主觀判斷［8］，遺傳學(xué)有明確的染色體檢出可確診MDS，但近一半的患者無(wú)異常染色體核型［9］。FCM檢測(cè)骨髓標(biāo)本質(zhì)量?jī)?yōu)劣對(duì)免疫表型分析的影響不如對(duì)形態(tài)學(xué)那么明顯［10］，故很多研究機(jī)構(gòu)制訂了診斷MDS的積分系統(tǒng)，但大多需要標(biāo)記多個(gè)抗體組合，分析復(fù)雜，不易被臨床醫(yī)師解讀，也加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。Della Porta et al［6］制定的四參數(shù)FCM積分有很高的診斷參數(shù)，尤其實(shí)用于低危MDS患者的診斷。本研究證實(shí)了該方法的臨床實(shí)用性，同時(shí)本研究改進(jìn)了設(shè)門(mén)方案，僅需4個(gè)抗體，一個(gè)組合就能分析該四參數(shù)積分，四色的流式分析儀就可以做到，用CD19和CD33在CD34+的細(xì)胞群中的表達(dá)代替文獻(xiàn)中用SSC和CD45表達(dá)的強(qiáng)度把B系前體細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞分離，文獻(xiàn)方案僅憑更弱表達(dá)的SSC和CD45分離B系前體細(xì)胞，易受操作者主觀判斷，本改進(jìn)方案杜絕了操作者主觀的因素。在臨床資料研究中，改進(jìn)的FCM積分似乎有更高的靈敏度和特異性以及診斷符合率，11例因方法學(xué)的改變而改變了FCM積分，11例中有5例因積分的改變而得到正確的診斷，其中MDS組有3例用改進(jìn)的FCM積分糾正了參考方案的診斷，非MDS組有2例糾正了參考方案的診斷。Χ2檢驗(yàn)比較改進(jìn)的FCM積分和參考FCM積分診斷MDS無(wú)差異性，說(shuō)明改進(jìn)的流式方案能勝任文獻(xiàn)中FCM積分的分析。

本改進(jìn)方案僅代表本院的臨床資料，尚需更多實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證這種簡(jiǎn)潔方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、高診斷參數(shù)、易于推廣的篩查MDS的FCM積分方案。

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On the value of improved flow cytometry score in MDS diagnosis

Guo Jinjing1，2，3，Wang Huipin1，2，Xiong Shudao1，2，et al
（1Dept of Hematology，The Second Hospital of Anhui Medical University，2Hematology Research Center，Anhui Medical University，Hefei 230061；3Dept of Laboratory Medicine，F(xiàn)uyang Affiliated Hospital of Anhui Medical University，F(xiàn)uyang People's Hospital，F(xiàn)uyang 236400）

Screening 94 patients to evaluate the diagnostic effectiveness of an improved FCM-score in MDS.A set of antibody combination：CD34/CD19/CD33/CD45 was used to analyze the four parameters FCM-score，and through CD19 and CD33 to separate progenitor B-cell blasts and myeloblasts.Analysis of the FCM-score in patients with suspected MDS，and the diagnostic parameters of the two methods were evaluated.The improved FCM-score had higher diagnosis parameters.11 patients with improved method changed the integral，5 of 11 cases changed classification and got correct diagnosis.The improved FCM-score is simple and easy，and can better separate of progenitor B-cell blasts and myeloblasts.

myelodysplastic syndromes；flow cytometry；immunophenotype

R 551.3

A

1000-1492（2016）06-0903-04

2016-03-08接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81141104）；安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2014Z017）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 2306012安徽醫(yī)科大學(xué)血液病研究中心，合肥 2300613安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，阜陽(yáng)230601

郭進(jìn)京，男，碩士研究生；翟志敏，女，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zzzm889@163.com