人參炔醇抑制胰腺癌干細胞的增殖及自我更新

黃文斯　王穎　朱麗　宋廉　劉嫣方　張禮榮　周月鵬　王冬青　朱海濤

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人參炔醇抑制胰腺癌干細胞的增殖及自我更新

黃文斯王穎朱麗宋廉劉嫣方張禮榮周月鵬王冬青朱海濤

目的探討人參炔醇對胰腺癌干細胞增殖及自我更新的影響。方法胰腺癌PANC1細胞在干細胞體系培養(yǎng)液中培養(yǎng)成干細胞，用流式細胞術(shù)檢測胰腺癌干細胞的CD133+細胞比例。以72、144、287 nmol/L人參炔醇處理干細胞12、24、48 h，采用CCK8法檢測細胞成活率；通過克隆形成實驗觀察287 nmol/L人參炔醇處理胰腺癌干細胞48 h后的集落數(shù)量；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞增殖相關(guān)蛋白Ki67、PCNA及自我更新相關(guān)蛋白β-catenin的表達。結(jié)果經(jīng)干細胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)的胰腺癌PANC1細胞的CD133+細胞比例為(9.70±0.59)%，顯著高于常規(guī)培養(yǎng)對照組的(2.11±0.25)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。人參炔醇呈濃度及時間依賴性減少胰腺癌干細胞的存活率，對照組及72、144、287 nmol/L人參炔醇處理48 h組細胞的存活率分別為100%、(63.32±2.37)%、(49.91±2.13)%、(41.37±2.01)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；對照組及287 nmol/L人參炔醇處理48 h組細胞的集落形成數(shù)分別為(611±25)、(280±16)個，人參炔醇處理組集落形成數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；對照組細胞Ki67、PCNA、β-catenin表達量分別為0.376±0.012、0.772±0.026、0.219±0.018，人參炔醇處理組分別為0.183±0.010、0.453±0.009、0.148±0.006，處理組的蛋白表達量均較對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)。結(jié)論人參炔醇可抑制胰腺癌PANC1干細胞的增殖及自我更新，其機制可能與下調(diào)Ki67、PCNA表達，阻斷Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

胰腺腫瘤；干細胞；人參炔醇；細胞增殖

Fund program：National Natural Science Foundations of China(81502663)；Social Development Projects of Jiangsu Province(BE2015668)；Natural Science Foundations of the Higher Education Institutions of Jiangsu Province(14KJD310001)；Jiangsu University Clinical Key Special Funds(JDLCZX005)；Zhenjiang Social Development Projects(SH2014053)

胰腺癌是消化道惡性腫瘤之一，其預(yù)后差，且易復(fù)發(fā)，因此成為當今醫(yī)學上治療較棘手的疾病[1-4]。盡管現(xiàn)在放、化療都在普遍應(yīng)用，但胰腺癌患者的5年生存率仍低于5%，平均生存期也只有4～6個月[5-7]，因此尋找胰腺癌的致病因素并予以解決至關(guān)重要。有研究表明，干細胞與胰腺癌的發(fā)生、預(yù)后及治療的抵抗性密切相關(guān)[8]。故針對胰腺癌干細胞的治療或許能成為治療胰腺癌的切入點。人參炔醇具有細胞毒性，通過對細胞周期的阻滯從而達到抗腫瘤作用[9]。本研究觀察人參炔醇對胰腺癌干細胞的增殖及自我更新能力的影響，探討其成為新的治療胰腺癌藥物的可能性。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1購自中科院上海細胞研究所。人參炔醇(純度>98%)購自上海億林生物科技有限公司，CCK8試劑盒購于南京諾維贊生物技術(shù)公司，結(jié)晶紫由江蘇大學實驗室友情提供，F(xiàn)BS、B27、EGF、bFGF均購自GIBCO公司，抗Ki67、PCNA、β-catenin、β-actin抗體及二抗均購于武漢博士德生物工程有限公司。

二、方法

1．干細胞培養(yǎng)及鑒定：PANC1細胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將有血清培養(yǎng)液換為無血清DMEM-F12培養(yǎng)液，待細胞貼壁后換為含B27(與培養(yǎng)液容積比為1∶50)、10 nmol/ml EGF、20 nmol/ml bFGF無血清培養(yǎng)液，每隔3 d換1次，7 d傳代1次。此為干細胞組。

CD133為干細胞的表面標志物，故檢測CD133+細胞以鑒定干細胞。取培養(yǎng)3周的胰腺癌干細胞用胰酶消化，用含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液中和后1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌兩遍，細胞懸浮于200 μl PBS，加入2 μl CD133抗體，4℃避光孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌后上流式細胞儀檢測CD133+的胰腺癌干細胞比例，以常規(guī)培養(yǎng)的PANC1細胞作為對照組。

2．細胞增殖檢測：收集干細胞組細胞，接種于96孔板，每孔5×103個細胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后分別加入72、144、287 nmol/L的人參炔醇，以未加人參炔醇處理的干細胞作為對照組，分別培養(yǎng)0、12、24、48 h，每組每時間點設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)到時間點時各孔加入1/10培養(yǎng)液容積的CCK8，混合后置37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱避光孵育1 h，上酶標儀測各孔在波長450 nm的吸光度值(A450值)。以對照組細胞成活率為100%，計算人參炔醇處理組的細胞成活率。

3．克隆形成實驗：收集干細胞組細胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加入287 nmol/L人參炔醇2 ml繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞，再以每孔1 000個細胞接種于6孔板中培養(yǎng)2周，以未加人參炔醇處理的干細胞作為對照組。培養(yǎng)結(jié)束后用PBS洗滌2次，結(jié)晶紫染色5 min，再用PBS洗滌2次，肉眼直接計數(shù)。

4．Ki67、PCNA、β-catenin蛋白表達檢測： 取經(jīng)287 nmol/L人參炔醇處理48 h的胰腺癌干細胞及未處理的對照組干細胞，應(yīng)用細胞裂解液裂解提取細胞蛋白，定量后取40 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞Ki67、PCNA、β-catenin蛋白表達，以β-actin作為內(nèi)參。抗Ki67、PCNA、β-catenin抗體工作濃度1∶1 000，稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗工作濃度1∶2 000。最后用ECL化學發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。采用WB灰度掃描軟件獲取條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié)　　果

一、胰腺癌干細胞的比例

貼壁的胰腺癌PANC1細胞在干細胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)后，逐漸形成類球形懸浮的胰腺癌干細胞團(圖1)。干細胞組、對照組胰腺癌PANC1細胞中CD133+干細胞比例分別為(9.70±0.59)%、(2.11±0.25)%，干細胞組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=-20.557，P<0.001，圖2)。

圖1　對照組(1A)、干細胞組(1B)培養(yǎng)3周的細胞

圖2　對照組(2A)、干細胞組(2B)CD133+細胞(流式細胞術(shù))

二、人參炔醇對胰腺癌干細胞增殖的影響

人參炔醇呈濃度及時間依賴性抑制PANC1干細胞的增殖，以287 nmol/L人參炔醇處理48 h的增殖抑制作用最顯著(表1)。

表1　不同濃度人參炔醇處理后干細胞的生存率±s)

注：與對照組比較，aP<0.05

三、人參炔醇對胰腺癌干細胞集落形成的影響

對照組、人參炔醇處理組細胞集落形成數(shù)分別為(611±25)、(280±16)個。人參炔醇處理后集落形成數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.640，P<0.001，圖3)。

圖3　對照組(3A)、人參炔醇處理組(3B)的細胞集落

四、人參炔醇對細胞Ki67、PCNA、β-catenin蛋白表達的影響

對照組細胞增殖及自我更新相關(guān)蛋白Ki67、PCNA、β-catenin表達量分別為0.376±0.012、0.772±0.026、0.219±0.018，人參炔醇處理組分別為0.183±0.010、0.453±0.009、0.148±0.006，處理組的蛋白表達均較對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為20.682、17.061、5.881，P值分別為<0.001、<0.001、<0.01，圖4)。

圖4對照組(1)、干細胞組(2)Ki67、PCNA、β-catenin蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)

討　　論

腫瘤干細胞占腫瘤細胞總數(shù)的0.01%～2.00%，其具有多分化潛能、自我更新和高致瘤等特性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)中起關(guān)鍵作用[10]。由于腫瘤干細胞對化療及放療有抵抗性，所以針對腫瘤干細胞的治療可能是臨床上治療腫瘤的一個切入點[11]。胰腺癌干細胞被認為可能是胰腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的決定因素，誘導(dǎo)胰腺癌干細胞失去自我更新能力有可能預(yù)防胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展[12]。CD133+細胞具有高成瘤性、自我更新和多向分化的干細胞特性，故CD133+細胞提示為胰腺癌干細胞[13]。

人參炔醇是聚乙炔醇類化合物的一種[14]，具有抗癌、抗菌和神經(jīng)保護作用，其對惡性細胞的親和性較正常細胞更強，所以對惡性細胞的生長抑制作用更強[15]。

本研究應(yīng)用人參炔醇處理胰腺癌干細胞，結(jié)果顯示人參炔醇呈濃度及時間依賴性抑制胰腺癌干細胞的增殖，細胞克隆形成數(shù)量顯著減少，提示人參炔醇能顯著抑制腫瘤干細胞的增殖及自我更新能力。

Ki67及PCNA蛋白是評判腫瘤分級與預(yù)后的參考物，也是腫瘤增殖的有效標志物[16-18]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵蛋白，而Wnt/β-catenin信號通路在干細胞的自我更新過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，人參炔醇處理后胰腺癌干細胞Ki67、PCNA及β-catenin表達量顯著降低，進一步證實人參炔醇對胰腺癌干細胞的增殖及自我更新具有抑制作用。

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(本文編輯：屠振興)

Panaxynol inhibited the proliferation and self-renewal of stem cells in pancreatic cancer

HuangWensi,WangYing,ZhuLi,SongLian,LiuYanfang,ZhangLirong,ZhouYuepeng,WangDongqing,ZhuHaitao.

DepartmentofRadiology，AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212000,China

Correspondingauthor:ZhuHaitao,Email:zhht25@163.com

ObjectiveTo investigate the influence of panaxynol on pancreatic cancer stem cells′ proliferation and self-renewal. MethodsPANC1 cells were cultured in stem cell culture system to induce the formation of stem cells, and the proportion of CD133+pancreatic cancer stem cells was detected by FCM. Cultured pancreatic stem cells were treated with panaxynol at different concentrations of 0, 72, 144, 287 nmol/L for 0, 12, 24, 48 h. CCK8 kit was used to detect the cell survival. The colony formation experiment detected the number of colonies after being cultured with 287 nmol/L panaxynol for 48 h. Western blot was used to detect the expression of proliferation-related protein Ki67, PCNA and self-renewal related protein β-catenin. ResultsThe CD133+proportion of pancreatic cancer stem cells was (9.70±0.59)%, which was statistically higher than that [(2.11±0.25)%] in the control group (P<0.001). Panaxynol can decrease the survival rates of pancreatic cancer stem cells in a dosage and time dependent manner. The survival rate of stem cells in control, 72,144, 287 nmol/L panaxynol group was 100%, (63.32±2.37)%，(49.91±2.13)% and (41.37±2.01)% after cultured for 48 h, which had statistically significant difference among different groups (P<0.001). The number of colonies in the control and 287 nmol/L panaxynol group was(611±25) and(280±16). Colonies in panaxynol group were fewer than those in the control group with statistically difference(P<0.001). The expression of Ki67, PCNA and β-catenin were 0.376±0.012, 0.772±0.026 and 0.219±0.018 in the control group and were 0.183±0.010, 0.453±0.009 and 0.148±0.006 in panaxynol group, respectively. The results indicated that Ki67, PCNA and β-catenin were down-regulated by panaxynol treatment and the differences were statistically significant (P<0.01). ConclusionsPanaxynol can inhibit the proliferation and self-renewal of pancreatic cancer stem cells. These effects may be related to downregulating Ki67, PCNA and blocking Wnt/β-catenin signaling pathway.

Pancreatic neoplasms;Stem cells;Panaxynol;Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.04.002

212000江蘇鎮(zhèn)江，江蘇大學附屬醫(yī)院影像科(黃文斯、王穎、朱麗、宋廉、張禮榮、周月鵬、王冬青、朱海濤)；鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院檢驗科(劉嫣方)

朱海濤，Email: zhht25@163.com

國家自然基金(81502663)；江蘇省社會發(fā)展項目(BE2015668)；江蘇省高校自然基金(14KJD310001)；江蘇大學臨床重點專項基金(JDLCZX005)；鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項目(SH2014053)

2015-06-11)