雙斑東方鲀親魚、受精卵、胚胎及仔稚幼魚毒性研究

李雷斌,鐘建興，蘇　捷，劉　波

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

LI Leibin，ZHONG Jianxing，SU Jie，LIU Bo

(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，F(xiàn)isheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

?

雙斑東方鲀親魚、受精卵、胚胎及仔稚幼魚毒性研究

李雷斌,鐘建興，蘇捷，劉波

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

采用福建省水產(chǎn)研究所研制的“河豚毒素半定量快速檢測試劑盒”，在雙斑東方鲀?nèi)斯し敝臣懊绶N培育過程中，對不同繁殖群體親種，不同繁殖群體交配所得受精卵、胚胎及仔稚幼魚的河豚毒素進(jìn)行跟蹤檢測。結(jié)果表明：不同繁殖群體親魚組織器官毒性差異大，親魚眼珠、精巢為陰性，皮膚、肌肉、肝臟、卵巢呈現(xiàn)不同陽性檢出率，分別為5.4%、16.2%、40.5%、40.5%；養(yǎng)殖繁殖群體親魚皮膚、肝臟為陽性，野生繁殖群體親魚肝臟和雌性性腺河豚毒性陽性檢出率比養(yǎng)殖繁殖群體親魚高；野生群體雌性親魚與野生群體雄性親魚、養(yǎng)殖群體雄性親魚交配組受精卵河豚毒素均為陽性，早期胚胎為陽性，后期胚胎為陰性；養(yǎng)殖群體雌性親魚與野生群體雄性親魚、養(yǎng)殖群體雄性親魚交配組受精卵、胚胎河豚毒素皆為陰性；野生群體雌性親魚與野生群體雄性親魚交配組仔稚魚河豚毒素為陽性，早期幼魚為陽性，后期幼魚為陰性；野生群體雌性親魚與養(yǎng)殖群體雄性親魚交配組仔魚河豚毒素為陰性，稚魚、早期幼魚為陽性，后期幼魚為陰性；養(yǎng)殖群體雌性親魚與野生群體雄性親魚、養(yǎng)殖群體雄性親魚交配組仔稚魚河豚毒素皆為陰性。

雙斑東方鲀；河豚毒素；親魚；受精卵；胚胎；仔稚幼魚

雙斑東方鲀(Fugu bimaculatus)，屬鲀形目、鲀科、東方鲀屬，其肉質(zhì)細(xì)嫩，含有較高的蛋白含量和較低的脂肪，肉味鮮美，因全人工養(yǎng)殖的商品魚中的河豚毒素(TTX)含量較低，可以安全食用(江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T543-2013“無公害家化暗紋東方鲀安全加工操作規(guī)范”規(guī)定該品種的肌肉TTX含量不應(yīng)超過10MU/g，而其余部位包括卵巢、肝臟、脾、腎、血液、眼球、膽、胃、腸、心臟、腮均作為有毒廢棄物處理)，現(xiàn)已在福建沿海池塘大量養(yǎng)殖。目前，有關(guān)雙斑東方鲀的研究主要集中在生物學(xué)特性[1]、人工繁殖和育種[2-6]、放流[7]及養(yǎng)殖模式[8-10]上。國內(nèi)對幾種河豚魚的毒性含量進(jìn)行了研究[11-13]，而對雙斑東方鲀河豚毒素的含量情況尚未見報(bào)道。河豚毒素作為一種天然毒素，是典型的鈉離子通道阻斷劑，其能選擇性與肌肉、神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的鈉離子通道受體結(jié)合，阻斷電壓依賴性鈉離子通道，造成肌肉和神經(jīng)的麻痹，這使得河豚毒素具有鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常、局麻、戒毒及抑瘤的醫(yī)療功效。為了認(rèn)識雙斑東方鲀河豚毒素的分布情況，本文采用福建省水產(chǎn)研究所研制的“河豚毒素半定量快速檢測試劑盒”對福建兩個海域的野生雙斑東方鲀及池塘養(yǎng)殖的雙斑東方鲀的親種、受精卵、胚胎及仔稚幼魚的河豚毒素進(jìn)行了跟蹤監(jiān)測，以期為雙斑東方鲀養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供理論支持。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)地點(diǎn)及主要設(shè)施

試驗(yàn)在福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地實(shí)施。主要設(shè)施：蓄水池12 000m2，沙濾池100m2，水塔400m3；生物餌料培育池12口，950m2；室內(nèi)育苗池40口，3 150m2，生態(tài)培育池塘9口，22 000m2；規(guī)范實(shí)驗(yàn)室3間，100m2。

1.2雙斑東方鲀繁殖群體

根據(jù)來源不同，雙斑東方鲀性成熟親魚分為A、B、C、D4個繁殖群體。

A群體：來自福建泉州灣天然海域，2014年3月1日包裝運(yùn)輸至福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地，共13尾，♀∶♂=8∶5，體重0.65～1.22kg。

B群體：來自福建佛曇灣天然海域，2014年3月5日包裝運(yùn)輸至福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地，共7尾，♀∶♂=5∶2，體重0.53～1.16kg。

C群體：來自福建漳浦縣佛曇鎮(zhèn)個體戶養(yǎng)殖池塘，2014年3月3日包裝運(yùn)輸至福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地，共9尾，♀∶♂=5∶4，體重0.45～0.75kg。

D群體：來自福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地養(yǎng)殖池塘，2014年3月6日捕獲，共 8尾，♀∶♂=5∶3，體重0.50～0.85kg。

1.3雙斑東方鲀?nèi)斯し敝臣懊绶N培育受精卵、胚胎及仔稚幼魚的獲取

4個不同養(yǎng)殖群體親魚，分別放養(yǎng)于福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地室內(nèi)水泥池進(jìn)行強(qiáng)化培育；注射地歐酮(DOM)、促黃體釋放激素類似物(LRH)及絨毛膜促性腺激素(HCG)，人工授精；受精卵集中置于0.5m3孵化桶中人工孵化；仔魚期和稚魚前期在室內(nèi)水泥池中培育，稚魚后期和幼魚期在室外池塘中培育。仔魚期1～20d，稚魚期20～50d，幼魚期50～150d。

1.4河豚毒素的檢測

采用福建省水產(chǎn)研究所自行研制的“河豚毒素半定量快速檢測試劑盒”進(jìn)行檢測。該試劑盒采用膠體金免疫層析法原理制備，對河豚毒素提取液中河豚毒素的最低檢出限為1MU/mL(0.22μg)。使用方法：取0.5g絞碎后的雙斑東方鲀組織于提取管中，沸水浴提取河豚毒素10min，冷卻到室溫，用配備的一次性吸管吸取待檢樣品提取液，滴加3滴于加樣孔中，10min后讀取結(jié)果，出現(xiàn)2條紅線為無毒樣品(河豚毒素<10MU/g)，為陰性，陰性結(jié)果記為“-”；若對照線區(qū)呈紅色，檢測線區(qū)無紅色線條出現(xiàn)，則為有毒樣品(河豚毒素>10MU/g)，為陽性，陽性結(jié)果記為“+”。

1.5雙斑東方鲀檢測樣品

雙斑東方鲀親魚取眼珠、皮膚、肌肉、肝臟、性腺共5種組織器官；雙斑東方鲀受精卵和胚胎取一定數(shù)量，每日取樣檢測；雙斑東方鲀150日齡前仔、稚、幼魚個體較小，難以分別剪取不同的組織，采用全魚絞碎的方式進(jìn)行取樣檢測，分別在1、5、10、30、60、90、120、150日齡取樣檢測。

2　結(jié)果

2.1不同雙斑東方鲀繁殖群體親魚河豚毒素檢測結(jié)果

4個不同來源繁殖群體親魚眼珠、皮膚、肌肉、肝臟、性腺檢測結(jié)果如表1。4個雙斑東方鲀繁殖群體親魚眼珠皆為陰性；B群體、C群體、D群體親魚皮膚為陰性，A群體親魚皮膚部分呈現(xiàn)陽性，陽性檢出率5.4%；A群體親魚肌肉為陰性，B群體、C群體、D群體親魚肌肉部分呈現(xiàn)陽性，陽性檢出率16.2%；C群體、D群體親魚肝臟為陰性，A群體、B群體親魚肝臟大部分呈現(xiàn)陽性，陽性檢出率40.5%；4個繁殖群體親魚精巢皆為陰性，4個繁殖群體親魚卵巢部分呈現(xiàn)陽性，性腺陽性檢出率40.5%。野生繁殖群體親魚肝臟和雌性性腺河豚毒性陽性檢出率比養(yǎng)殖繁殖群體親魚高。

表1　不同雙斑東方鲀繁殖群體親魚組織器官河豚毒素檢測結(jié)果

續(xù)表1

2.2雙斑東方鲀受精卵及胚胎河豚毒素檢測結(jié)果

不同雙斑東方鲀繁殖群體交配組所得受精卵及不同發(fā)育時(shí)間胚胎河豚毒素檢測結(jié)果如表2。群體A♀×群體A♂組合受精卵及胚胎為陽性；群體B♀×群體B♂組合受精卵和整個發(fā)育期胚胎皆陽性；群體B♀×群體D♂組合受精卵及1日齡、2日齡胚胎為陽性，3～6日齡胚胎陰性；群體C♀×群體C♂、群體D♀×群體D♂、群體C♀×群體A♂3個交配組受精卵及胚胎皆為陰性。野生群體雌性親魚與野生群體雄性親魚、養(yǎng)殖群體雄性親魚交配組受精卵河豚毒素為陽性，胚胎發(fā)育早期為陽性、后期為陰性；養(yǎng)殖群體雌性親魚與野生群體雄性親魚、養(yǎng)殖群體雄性親魚交配組受精卵、胚胎河豚毒素皆為陰性。

表2　不同雙斑東方鲀交配組受精卵及胚胎河豚毒素檢測結(jié)果

2.3雙斑東方鲀仔稚幼魚河豚毒素檢測結(jié)果

不同雙斑東方鲀繁殖群體交配組所得仔稚幼魚河豚毒素檢測結(jié)果如表3。群體A♀×群體A♂、群體B♀×群體B♂2個交配組仔稚幼魚1～60日齡為陽性，90～150日齡幼魚為陰性；群體D♀×群體D♂、群體C♀×群體A♂、群體B♀×群體D♂3個交配組仔稚幼魚1～150日齡為陰性。野生群體雌性親魚與野生群體雄性親魚交配組仔稚魚河豚毒素為陽性，早期幼魚為陽性、后期為陰性；野生群體雌性親魚與養(yǎng)殖群體雄性親魚交配組仔魚河豚毒素為陰性，稚魚、早期幼魚為陽性，后期幼魚為陰性；養(yǎng)殖群體雌性親魚與野生群體雄性親魚、養(yǎng)殖群體雄性親魚交配組仔稚魚河豚毒素皆為陰性。

表3　不同雙斑東方鲀交配組仔稚幼魚河豚毒素檢測結(jié)果

3　討論

國內(nèi)外學(xué)者對河豚毒素的來源進(jìn)行較多的研究[14-18]，河豚魚類體內(nèi)的河豚毒素來源主要是通過攝食含有河豚毒素的餌料或產(chǎn)生河豚毒素的細(xì)菌逐步富集而成。華元渝等[19]在1994—2001年進(jìn)行了暗紋東方鲀?nèi)斯し敝?、苗種培育、商品魚養(yǎng)殖全過程的控毒技術(shù)研究。在養(yǎng)殖全過程中，通過運(yùn)行生態(tài)型再生式水循環(huán)養(yǎng)魚系統(tǒng)來改善水體生態(tài)環(huán)境，通過投喂自繁淡水輪蟲和自制無毒配合飼料等措施，從食物鏈環(huán)節(jié)控制河豚毒素的來源，可達(dá)到控毒的目的。對經(jīng)控毒的家化暗紋東方鲀親本，采用高效液相色譜儀和熒光分光光度計(jì)聯(lián)合法隨機(jī)抽樣檢驗(yàn)，結(jié)果表明，其體內(nèi)4種組織器官中的河豚毒素平均含量低于2μg/g，屬基本無毒。這說明在一定的人工條件下養(yǎng)殖的東方鲀可以實(shí)現(xiàn)河豚毒素含量極低，達(dá)到人們食用的無毒程度，這也對雙斑東方鲀的無毒養(yǎng)殖提供了參考依據(jù)。

本文通過定性檢測4種不同來源的雙斑東方鲀親魚的幾個部位，發(fā)現(xiàn)除了眼珠和所有雄性雙斑東方鲀的性腺的河豚毒素檢測結(jié)果是陰性外，其余部位的檢測均有不同百分率的河豚毒素檢出，而在常被認(rèn)為帶有河豚毒素的肝臟和卵巢中，野生雙斑東方鲀的肝臟和雌性性腺的河豚毒性陽性檢出率比養(yǎng)殖的雙斑東方鲀的要高。由于養(yǎng)殖的雙斑東方鲀投喂的是海捕小雜魚以及部分對蝦配合飼料，而野生的雙斑東方鲀靠海區(qū)覓食生長，受到餌料影響較多，因此魚體的不同部位河豚毒素的檢測結(jié)果也不相同。雄性雙斑東方鲀的性腺基本不含河豚毒素，受精卵和胚胎的毒素應(yīng)該全部來源于雌性親魚，在雙斑東方鲀的胚胎發(fā)育期間和仔稚幼魚的培育期間，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，河豚毒素檢測有逐步呈陰性的趨勢，推測是隨著仔稚幼魚的魚體不斷長大，每尾魚體來源于親本的河豚毒素在總含量不變的情況下，平均每g組織中的河豚毒素在不斷的下降，直至檢測不出。由于本文采用的河豚毒素半定量快速檢測試劑盒不能對河豚毒素做到定量檢測，至于河豚毒素在親子代間的具體情況，還需要進(jìn)一步的研究。

[1]鐘建興.雙斑東方鲀生物學(xué)特性及繁養(yǎng)殖技術(shù)[J].海洋科學(xué)，2003，27(9)：8-12.

[2]鐘建興，許鼎盛，陳有銘，等.雙斑東方鲀?nèi)斯し敝臣坝缂夹g(shù)[J].臺灣海峽，2002，2l(3)：305-309.

[3]陳國年，秦彩姣，王家邦，等.雙斑東方鲀?nèi)斯し敝臣夹g(shù)的研究[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2002，29(6)：246-247.

[4]鄭美芬.雙斑東方鲀?nèi)斯び缂夹g(shù)[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2002，(4)：13-14.

[5]林秀春，鐘建興 ，黃朝祥，等.雙斑東方鲀?nèi)斯び缂夹g(shù)的探討[J].莆田高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2001，8(4)：26-29.

[6]鐘建興.雙斑東方鲀?nèi)斯び缂夹g(shù)研究[J].海洋科學(xué)，2002，26(8)：23-26.

[7]方民杰，杜琦.雙斑東方鲀標(biāo)志放流的初步研究[J].臺灣海峽，2008，27(3)：325-328.

[8]鄭惠東.雙斑東方鲀網(wǎng)箱養(yǎng)殖試驗(yàn)[J].福建水產(chǎn)，2002，(4)：46-49.

[9]陳啟春.雙斑東方鲀不同放養(yǎng)模式養(yǎng)成試驗(yàn)初報(bào)[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2003，30(2)：75-78.

[10]陳啟春，李金秋，袁定清，等.雙斑東方鲀與蝦蟹混養(yǎng)初報(bào)[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2004，(4)：34-35.

[11]劉智禹.南海常見河豚魚品種及其毒素含量的研究[J].福建水產(chǎn)，2011，33(1)：325-329.

[12]鐘建興，朱金勇，許玉德.三種鲀的毒性及其與種的相關(guān)性研究[J].臺灣海峽，2003，(2)：261-265.

[13]蘇捷，劉智禹，黃枝梅.河豚毒素的分離純化研究[J].福建水產(chǎn)，2010，(4)：321-324.

[14]MatsumuraK.Amonoclonalantibodyagainsttetrodotoxinthatreactstotheactivegroupforthetoxicity[J]．EnvionmentalToxicologyandPharmacology，1995，293(293)：41-45．

[15]NagashimaY，ToyodaM，HasobeM，eta1.Invitroaccumulationoftetrodotoxininpufferfishlivertissueslices[J].Toxicon，2003，41(5)：569-574.

[16]崔建洲，申雪艷，官慶禮，等．高效液相色譜-紫外/炭光檢測方法測定河豚毒素[J]．色譜，2006，24(3)：317.

[17]TamaoN，OsamuA，TomohiroT，eta1．TTXaccumulationinpufferfish[J]．ComparativeBiochemistryandPhysiology，2006，1(1)：145-152.

[18]YasumotoT，NagaiH，YasumuraD，eta1．Interspeciesdistributionandpossibleoriginoftetrodotoxin[J].Ann.NewYorkAcad.Sci.，1986，479：44-51.

[19]華元渝，顧志峰，周昕，等．暗紋東方鲀控毒養(yǎng)殖技術(shù)的研究[J]．淡水漁業(yè)，2002，32(5)：20-23.

The research on the toxicity of parent fishes，fertilized eggs，embryo and juveniles of Fugu bimaculatus

In our paper the semi quantitative rapid detection kits of tetrodotoxin which developed at the Fisheries Research Institute of Fujian were applied in the artificial breeding ofFugubimaculatus.We detected the tetrodotoxin of parent fishes，fertilized eggs，embryo and juveniles ofFugubimaculatusin different breeding groups.The results showed the tetrodotoxin of tissue and organ with parent fishes was significant different from each other in different breeding groups.The tetrodotoxin of eye ball and testis in parent fishes were negative in detection，but on the other hand，the skin，muscle，liver and ovaries were positive with different detection rate which were 5.4%，16.2%，40.5% and 40.5%，respectively.Our experimental data had indicated that the skin and liver of parent fishes were positive in artificial breeding groups，and the positive detection rates of the liver and ovaries of parent fishes in wild groups were higher than artificial breeding groups.The fertilized eggs with female parent in wild groups were both positive in tetrodotoxin detection，and the embryo was positive in earlier state but negative in later state.The fertilized eggs and embryo with female parent in artificial breeding groups were both negative in tetrodotoxin detection.The juveniles with female parent in wild groups were positive in earlier state but negative in later state.The juveniles with female parent in artificial breeding groups were negative in tetrodotoxin detection.

Fugubimaculatus；tetrodotoxin；parent fishes；fertilized eggs；embryo；juveniles

LI Leibin，ZHONG Jianxing，SU Jie，LIU Bo

(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，F(xiàn)isheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

2016-06-06

廈門南方海洋研究中心項(xiàng)目(廈海漁合〔2014〕119號)；福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2015R1003-3)；閩臺重要海洋生物資源高值化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(2014FJPT01)；福建重要海洋經(jīng)濟(jì)生物種質(zhì)庫與資源高效開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(14PZY017NF17).

李雷斌(1976-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：水產(chǎn)動物遺傳育種和繁殖.E-mail：haidalibin@126.com

S917.4

A

1006-5601(2016)04-0295-07

李雷斌,鐘建興，蘇捷，等.雙斑東方鲀親魚、受精卵、胚胎及仔稚幼魚毒性研究[J].漁業(yè)研究，2016，38(4)：295-301.