外源性綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活MAPK信號(hào)通路的分析

孫曉林，杜方原，劉淑英，2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

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外源性綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活MAPK信號(hào)通路的分析

孫曉林1，杜方原1，劉淑英1，2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

旨在深入探究外源性綿羊肺腺瘤病毒(exJSRV)囊膜蛋白(Env)的致病機(jī)制，通過(guò)組織病理學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)病肺的病理特征以及Env、EGFR和MAPK信號(hào)通路中p-Erk1/2和p-p38的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)，通過(guò)Western blot檢測(cè)Erk1/2和p38在病肺中的磷酸化水平。轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA 4/myc-His /exJSRV-env到A549細(xì)胞中，通過(guò)Western blot檢測(cè)Erk1/2和p38的磷酸化水平。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒的A549細(xì)胞的增殖活力。免疫組化結(jié)果顯示：JSRV Env蛋白主要表達(dá)于病肺組織的肺泡上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，EGFR在病肺組織中過(guò)表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞，脫落的腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中，而在健康綿羊肺中只是少量表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中，p-Erk1/2和p-p38在病肺組織中主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，EGFR、p-Erk1/2和p-p38的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)均與Env蛋白的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)一致。Western blot結(jié)果顯示：病肺中p-Erk1/2和p-p38的磷酸化水平均極顯著高于健康肺組織，轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env的A549細(xì)胞中p-Erk1/2和p-p38的表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，說(shuō)明exJSRV-env確實(shí)激活了A549細(xì)胞的MAPK通路。而CCK8結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env的A549細(xì)胞增殖活力顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，說(shuō)明exJSRV-env可能是通過(guò)激活的EGFR/MAPK通路促進(jìn)A549細(xì)胞的惡性增殖，進(jìn)而促使腫瘤的發(fā)生。本研究為進(jìn)一步探索綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

外源性綿羊肺腺瘤病毒；囊膜蛋白；MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；細(xì)胞增殖

綿羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)是綿羊肺腺瘤病(OPA)的病原，OPA是一種傳染性綿羊肺癌[1]。由于組織培養(yǎng)體系的缺乏，JSRV/OPA的研究一直在病毒培養(yǎng)方面受到阻礙。就以往的研究來(lái)看，感染JSRV的綿羊病料(肺液)是傳染性O(shè)PA的唯一來(lái)源[2]。顯而易見(jiàn)，對(duì)于JSRV/OPA體系的研究只能建立在OPA病例的基礎(chǔ)上[3]。該病的特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量分泌物導(dǎo)致肺部積聚肺液，OPA腫瘤起源于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞或Clara細(xì)胞[4-5]。

之前已經(jīng)有研究表明，JSRV的腫瘤形成機(jī)制是由腫瘤的Env蛋白激活涉及轉(zhuǎn)染的信號(hào)通路蛋白激酶[6-7]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)與腫瘤有著密切的關(guān)系，常常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，伴隨著EGFR調(diào)控的異常，如EGFR的過(guò)表達(dá)或EGFR的突變等。有研究者發(fā)現(xiàn)，有50%～70%的肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等上皮細(xì)胞癌都有EGFR的過(guò)度激活。通過(guò)抑制EGFR、磷酸化EGFR及其下游的信號(hào)通路，往往可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移等[8]。而EGF及其受體是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要啟動(dòng)者。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EGFR主要激活兩條MAPK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：MAPK/ERK和MAPK/JNK通路[9]，MAPK/ERK、MAPK/JNK和MAPK/p38是MAPK重要的三種類(lèi)型[6]。ERK1/2在腫瘤中起到的作用主要是通過(guò)活化的p-ERK1/2與其他信號(hào)途徑中的效應(yīng)分子或核轉(zhuǎn)錄因子相互作用后，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化[11]。有大量的研究表明，p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖起著綜合作用，而p38 MAPK蛋白激酶的抑制劑可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)凋亡[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路的活性，會(huì)導(dǎo)致A549細(xì)胞的浸潤(rùn)和表達(dá)受到抑制，提示p38 MAPK可以促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[10]。而N.Maeda等[13]發(fā)現(xiàn)，p38抑制劑會(huì)增強(qiáng)JSRV Env的轉(zhuǎn)化作用，并推測(cè)p38可能是通過(guò)活化PP1/2A，使MEK1/2去磷酸化，繼而降低ERK1/2的活性，來(lái)抑制H/N-Ras-MEK-MAPK通路的活性。

基于以上研究基礎(chǔ)，筆者通過(guò)組織病理學(xué)觀察檢測(cè)病肺的病理特征，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)病肺組織中Env、EGFR、以及p-Erk1/2和p-p38的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)，通過(guò)觀察各自的陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)區(qū)來(lái)定位蛋白發(fā)揮效應(yīng)的靶細(xì)胞，并通過(guò)Western blot檢測(cè)p-Erk1/2和p-p38在病肺中的磷酸化水平，以及將重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env轉(zhuǎn)入人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞中，檢測(cè)p-Erk1/2和p-p38的表達(dá)量，判斷是否A549細(xì)胞受到Env的誘導(dǎo)，激活了MAPK通路，最后通過(guò)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，推測(cè)細(xì)胞增殖活力的改變是否受到MAPK通路激活的影響，為進(jìn)一步探索綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品的采集

自然感染綿羊肺腺瘤病料于內(nèi)蒙古四子王旗采集，健康綿羊肺由內(nèi)蒙古呼和浩特市屠宰場(chǎng)提供。

1.2主要試劑

A549細(xì)胞(國(guó)家細(xì)胞資源共享平臺(tái)購(gòu)買(mǎi))；pcDNA4/myc-His真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)有限責(zé)任公司)；Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo公司)；LipofectamineTMLTX & PLUS 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)；限制性?xún)?nèi)切酶NotⅠ和BamHⅠ，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)；RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限責(zé)任公司]；去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提純化試劑盒(Promega公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(FBS)和Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；兔抗Env51-394多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備；兔抗His，Anti-EGFR antibody ab2430(Abcam公司)；β-Actin(13E5) Rabbit mAb，p44/42 MAPK(Erk1/2)(137F5)，Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(D13.14.4E)XP?Rabbit mAb，p38 MAPK Antibody，Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(D3F9)XP?Rabbit mAb(Cell Signaling公司)，Pierce?Goat Anti-Rabbit IgG，(H+L)，Peroxidase Conjugated(Thermo公司)，ECL STAR特超敏顯色試劑盒(北京碧云天公司)。

1.3肺組織病理切片制備及觀察

將肺組織置10%福爾馬林溶液中固定12 h后，沖洗12 h，依照常規(guī)操作進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烘片以及HE染色和免疫組化，中性樹(shù)膠封片后，烤片12 h，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片。

1.4肺組織信號(hào)通路免疫組化檢測(cè)

同上制片，選擇相應(yīng)試劑進(jìn)行免疫組化染色，中性樹(shù)膠封片后，烤片12 h，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片。

1.5肺組織信號(hào)通路Western blot檢測(cè)

將病料從-80 ℃取出，放在液氮中研磨，加入組織裂解液后超聲波破碎，提取總蛋白質(zhì)，取蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白質(zhì)上樣量為每孔30 μg，并通過(guò)半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上，將膜放入Western blot封閉液中，于搖床上封閉2 h。之后用TBST清洗5次，每次5 min，一抗4 ℃過(guò)夜孵育，TBST清洗5次，每次5 min，二抗于搖床上室溫孵育1 h。TBST清洗5次，每次5 min，ECL 孵育1 min，曝光1 min后觀察結(jié)果。

1.6最佳轉(zhuǎn)染效率測(cè)定

轉(zhuǎn)染前24h將A549細(xì)胞傳代至60mm皿中，加入含10%FBS無(wú)雙抗的完全培養(yǎng)基3mL，于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至80% 時(shí)按照LipofectamineTMLTX&PLUS轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env。分組試驗(yàn)梯度為500ng組質(zhì)粒添加LTX2、3、4、5、6、8和10μL，轉(zhuǎn)染48h后分別做RT-PCR和Westernblot檢測(cè)最佳轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR引物為本試驗(yàn)根據(jù)exJSRV的全基因序列(No.AF105220)，利用PrimerPrimer5.0軟件，在env基因區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)exJSRV-env的引物(預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小1 848bp)。引物上下游分別加入NotⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。上游引物(env-F)：5′-CGCGGATCCACACCATGGCGAAGCGCCG-3′，下游引物(env-R)：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCGGGTCGTCCCCCGC-3′，引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.7pcDNA4/myc-His/exJSRV-env瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞

根據(jù)測(cè)定的最佳轉(zhuǎn)染條件分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env和pcDNA4/myc-His空質(zhì)粒到A549細(xì)胞，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.8細(xì)胞轉(zhuǎn)染后exJSRV-envmRNA轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)

收集各組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h的A549細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，利用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳在成像儀上檢測(cè)RNA的完整性，確定可用后將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。PCR引物及反應(yīng)條件均與“1.6”相同。

1.9Western blot檢測(cè)Env蛋白A549細(xì)胞中的表達(dá)

提取各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，取蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白質(zhì)上樣量為每孔20 μg，并通過(guò)半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上，將膜放入Western blot封閉液中，于搖床上封閉2 h。之后用TBST清洗5次，每次5 min，一抗4 ℃過(guò)夜孵育。TBST清洗，二抗于搖床上室溫孵育1 h。TBST清洗5次，每次5 min，ECL 孵育1 min，曝光1 min后觀察結(jié)果。

1.10Western blot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá)

1.11CCK8法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖能力

將轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞鋪板于96孔板中，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加100μL完全培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，鋪5個(gè)板子。每天同一時(shí)間加入10μLCCK8，37 ℃孵育1h，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450nm處的吸光值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

2　結(jié)　果

2.1肺組織病理切片觀察與免疫組織化學(xué)檢測(cè)

取自然感染的綿羊病肺組織分別做HE染色以及免疫組化檢測(cè)，免疫組化檢測(cè)一抗采用本實(shí)驗(yàn)室制備的Env多克隆抗體，結(jié)果顯示，病肺肺泡壁增寬，有大量的肺泡上皮細(xì)胞腫瘤性增生，肺組織中充斥大量腺瘤灶及類(lèi)腺瘤區(qū)，腺瘤灶周?chē)写罅棵撀涞牧黾?xì)胞及巨噬細(xì)胞等典型的綿羊肺腺瘤病理特征(圖1A)。健康綿羊肺的肺泡壁較薄，多成圓形或卵圓形，未見(jiàn)腫瘤灶(圖1B)。FAN等[3]已經(jīng)證明JSRVEnv足夠引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且exJSRV-env的主要靶細(xì)胞為肺泡上皮細(xì)胞。因此作者做了病肺免疫組化的JSRVEnv檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中有大量的陽(yáng)性表達(dá)(圖1C)。驗(yàn)證了JSRVEnv的靶細(xì)胞為肺泡上皮細(xì)胞這一點(diǎn)。而健康綿羊肺組織則未見(jiàn)表達(dá)(圖1D)。

2.2肺組織信號(hào)通路免疫組化檢測(cè)

取自然感染的綿羊病肺組織，免疫組化檢測(cè)EGFR在病肺組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其過(guò)表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞，脫落的腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中(圖2A)，而在健康綿羊肺中只是少量表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞(圖2B)和支氣管上皮細(xì)胞中(未展示)，這與JSRVEnv的靶細(xì)胞一致，而JSRVEnv是引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化的主要因素，因此有可能是JSRVEnv激活了病肺細(xì)胞中EGFR的表達(dá)。而作為陰性對(duì)照，一抗用PBS代替的病肺組織(圖2C)，以及正常綿羊肺組織(圖2D)均未見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)的表達(dá)。接著檢測(cè)EGFR下游通路MAPK通路中兩個(gè)重要蛋白Erk1/2和p38的磷酸化水平，正常綿羊肺組織及一抗用PBS取代的病肺組織均為陰性對(duì)照。發(fā)現(xiàn)p-Erk在肺泡上皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中均有大量表達(dá)(圖3A、B)，而正常綿羊肺組織(圖3C、D)未檢測(cè)到表達(dá)。p-p38也大量表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞中(圖3E、F)，正常綿羊肺組織未檢測(cè)到表達(dá)(圖3G、H)，其中一抗用PBS代替的病肺組織(圖3I、J)，以及正常綿羊肺組織(圖3K、L)均未見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示：不同腫瘤結(jié)節(jié)間標(biāo)記的強(qiáng)度不同，當(dāng)用不同濃度的一抗時(shí)都保持不變，說(shuō)明這種變化與一抗的濃度無(wú)關(guān)，而是與p-Erk1/2、p-p38在不同腫瘤中的濃度有關(guān)。JSRV感染的肺組織中，IHC表明OPA-N肺組織中Env陽(yáng)性信號(hào)的細(xì)胞為肺泡上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，而p-Erk1/2、p-p38陽(yáng)性信號(hào)也主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，因此Env與p-Erk1/2和p-p38的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)一致，并且主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。而JSRVEnv是引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化的主要誘因，因此也有可能是JSRVEnv激活了病肺組織中p-Erk1/2和p-p38的表達(dá)。對(duì)于大部分結(jié)節(jié)來(lái)說(shuō)，p-Erk1/2、p-p38標(biāo)記的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞在同一視野的不同結(jié)節(jié)中陽(yáng)性信號(hào)的表達(dá)強(qiáng)度不同，在一些結(jié)節(jié)中，100%腫瘤細(xì)胞都有標(biāo)記。標(biāo)記的強(qiáng)度由弱到強(qiáng)變化。另外，有些陽(yáng)性信號(hào)標(biāo)記在支氣管區(qū)的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，和一些單獨(dú)的細(xì)支氣管上皮細(xì)胞(未展示)。少量的間質(zhì)細(xì)胞是p-Erk1/2、p-p38陽(yáng)性信號(hào)。總體來(lái)講，這些數(shù)據(jù)表明，JSRV感染的肺組織細(xì)胞表現(xiàn)出了EGFR的激活，以及其下游MAPK通路中p-Erk1/2、p-p38的活化。

2.3肺組織信號(hào)通路Westernblot檢測(cè)

經(jīng)Westernblot檢測(cè)，自然感染OPA的病肺和健康綿羊肺組織均有Erk1/2和p38的表達(dá)，而自然感染OPA病肺的p-Erk和p-p38的表達(dá)量都極顯著高于健康綿羊肺組織的表達(dá)量(圖4、圖5)。

2.4pcDNA4/myc-His/exJSRV-env最佳轉(zhuǎn)染效率測(cè)定

結(jié)果顯示，48h后加入不同LTX濃度的質(zhì)粒，JSRV-env均有mRNA水平的表達(dá)(圖6)，而JSRVEnv蛋白的表達(dá)差異極顯著，加入4μLLTX的蛋白表達(dá)量要極顯著高于其他試驗(yàn)組的蛋白表達(dá)量(圖7)，因此最終選取500ng的pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達(dá)質(zhì)粒中加入4μLLTX為最佳轉(zhuǎn)染濃度。

A.腫瘤肺組織HE染色，200×；B.健康肺組織HE染色，100 ×；C.腫瘤肺組織免疫組化染色，200×；D.健康肺組織免疫組化染色，200×A.Neoplastic lung tissue of sheep HE staining，200×；B.Normal lung tissue of sheep HE staining，100×；C.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining，200×；D.Normal lung tissue of immunostaining，200×圖1　病肺組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.1 Result of ovine pulmonary adenocarcinoma

A.腫瘤肺組織免疫組化檢測(cè)；B.健康肺組織免疫組化檢測(cè)；C.腫瘤肺組織免疫組化染色；D.健康肺組織免疫組化染色A.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining staining；B.Normal lung tissue of sheep immunostaining；C.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining，；D.Normal lung tissue of immunostaining圖2　EGFR在自然感染OPA病肺組織中的表達(dá)分布(200×)Fig.2　Neoplastic lung tissue of OPA-N sheep immunostaining for EGFR(200×)

A、E、I.腫瘤肺組織免疫組化，100×；B、F、J.腫瘤肺組織免疫組化，400×；C、G、K.正常綿羊肺組織免疫組化，100×；D、H、L.正常綿羊肺組織免疫組化，400×A，E，I.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining staining，100×；B，F(xiàn)，J.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining，400×；C，G，K.Normal lung tissue of sheep immunostaining，100×；D，H，L.Normal lung tissue of immunostaining，400×圖3　p-Erk1/2和p-p38在自然感染OPA病肺組織中的表達(dá)分布Fig.3　Neoplastic lung tissue of OPA-N sheep immunostaining For p-Erk and p-p38

1.健康綿羊肺組織；2.自然感染OPA病肺1.Normal sheep lung；2.OPA-N sheep lung圖4　Western blot檢測(cè)信號(hào)通路在肺中的蛋白表達(dá)Fig.4　Western blot analysis of protein expressions in the lung

Control.健康綿羊肺組織；OPA-N.自然感染OPA肺組織；**.P<0.01Control.Normal sheep lung；OPA-N.Natural infection OPA sheep lung；**.P<0.01圖5　肺中通路蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化Fig.5　Activation of p-Erk1/2 and p-p38 in sheep lung

2.5pcDNA4/myc-His/exJSRV-env轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后目的基因的檢測(cè)

轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞在2 000 bp下方均擴(kuò)增出目的條帶，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶(圖8)。

2.6Western blot檢測(cè)JSRV Env的表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA4/myc-His的細(xì)胞均有His標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)，而轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細(xì)胞有Env蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA4/myc-His的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)(圖9)。

M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～8.分別為pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 真核表達(dá)質(zhì)粒500 ng，加LTX 2、3、4、5、4、6、8、10 μLM.DL5000 DNA marker；1-8.A549 transfected with 500 ng pcDNA4/myc-His/exJSRV-env and LTX 2，3，4，5，4，6，8，10 μL圖6　RT-PCR檢測(cè)pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后mRNA轉(zhuǎn)錄Fig.6　Identification of exJSRV-env expressed in A549 cells after 48 h by RT-PCR

1～8.分別為pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 真核表達(dá)質(zhì)粒500 ng，加LTX 2、3、4、5、4、6、8、10 μL1-8.A549 transfected with 500 ng pcDNA4/myc-His/exJSRV-env and LTX 2，3，4，5，4，6，8，10 μL圖7　Western blot檢測(cè)pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.7　Identification of exJSRV-env expressed in A549 cells after 48 h by Western blot

M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞；2.轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His空質(zhì)粒的A549細(xì)胞；3.exJSRV-env 基因擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL5000 DNA marker；1.A549；2.A549 transfected with pcDNA4/myc-His；3.A549 transfected with pcDNA4/myc-His/exJSRV-env圖8　RT-PCR檢測(cè)exJSRV-env在A549細(xì)胞中的表達(dá)Fig.8　Identification of exJSRV-env expressed in A549 cells by RT-PCR

1.未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞；2.轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA4/myc-His的細(xì)胞；3.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 的細(xì)胞1.A549；2.A549 transfected with pcDNA4/myc-His；3.A549 transfected with pcDNA4/myc-His/exJSRV-env圖9　Western blot檢測(cè)exJSRV-env在A549細(xì)胞的表達(dá)Fig.9　Western blot analysis of exJSRV-env expression in A549

2.7信號(hào)通路蛋白表達(dá)量的檢測(cè)

經(jīng)Western blot檢測(cè)，轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均有Erk1/2和p38的表達(dá)，轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細(xì)胞的p-Erk1/2的表達(dá)量極顯著高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細(xì)胞的p-p38的表達(dá)量很高，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未檢測(cè)到表達(dá)(圖10、圖11)。

1.未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞；2.轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 的細(xì)胞1.A549；2.A549 transfected with pcDNA4/myc-His/exJSRV-env圖10　Western blot檢測(cè)信號(hào)通路在細(xì)胞中的蛋白表達(dá)Fig.10　Western blot analysis of exJSRV-env expression in A549 cells

Control.未轉(zhuǎn)染的空細(xì)胞對(duì)照組；exJSRV-env.轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 的細(xì)胞組；**.P<0.01Control.Normal sheep lung；OPA-N.Natural infection OPA sheep lung；**.P<0.01圖11 A549細(xì)胞中通路蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化Fig.11 Activation of p-Erk1/2 and p-p38 in A549 cells

2.8CCK8法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖能力

CCK8檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env的A549細(xì)胞的增殖活力顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)(圖12)。

*.P<0.05圖12　轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖曲線Fig.12　Cells growth curve after the transformation

3　討　論

最近的研究發(fā)現(xiàn)，自然感染OPA的腫瘤細(xì)胞和表達(dá)JSRV的肺模型中均相對(duì)于未感染的肺或肺模型有更高比例的Ki-67的表達(dá)[14]，而Ki-67作為標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的抗原，表明JSRV Env在自然感染的肺和肺模型中的表達(dá)均可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。盡管JSRV Env促進(jìn)轉(zhuǎn)染的具體機(jī)制還不十分明確，但是有學(xué)者[14-17]認(rèn)為它激活了一系列調(diào)控細(xì)胞增殖分化的信號(hào)通路。EGFR表達(dá)于正常上皮細(xì)胞表面，而在一些腫瘤細(xì)胞中常過(guò)表達(dá)，EGFR的下游信號(hào)通路為Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK和PI3K/Akt/ mTOR通路。N.M.Linnerth-petrik等[18]提出，Env誘導(dǎo)的腫瘤中有EGFR在Tyr1068位點(diǎn)的磷酸化，并激活了Akt，而Akt是抗凋亡因素中的關(guān)鍵激酶，因此，Env有可能通過(guò)這條通路來(lái)逃避凋亡。而MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝癌等很多腫瘤細(xì)胞[11]中均檢測(cè)到活化，MAPK信號(hào)通路可以通過(guò)影響動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，從而影響細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡，p38 MAPK和ERK/MAPK為其重要的兩條途徑，p38和Erk1/2也與細(xì)胞的分裂和增殖息息相關(guān)[19]。p38抑制劑會(huì)促進(jìn)ERK1/2的激活，甚至細(xì)胞的增殖活力都顯著升高[13，20]。

本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)EGFR在病肺組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其過(guò)表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞，脫落的腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中，這與JSRV Env蛋白的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)一致。這為進(jìn)一步研究MAPK通路在JSRV Env誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生中的作用奠定了基礎(chǔ)。而免疫組織化學(xué)檢測(cè)病肺中p-Erk1/2和p-p38兩個(gè)磷酸化蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，p-Erk1/2的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)也是Env和EGFR的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)，并且自然感染OPA的腫瘤與健康綿羊肺相比，p-Erk1/2和p-p38的表達(dá)水平均極顯著增高。通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達(dá)質(zhì)粒的A549細(xì)胞中Erk1/2和p38兩個(gè)蛋白的磷酸化水平均極顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，與組織中蛋白的表達(dá)一致，說(shuō)明在轉(zhuǎn)染了重組表達(dá)質(zhì)粒后激活了MAPK/ERK通路及MAPK/p38通路。采用CCK8法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的exJSRV-env的細(xì)胞增殖活性顯著高于正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞，說(shuō)明exJSRV-env具有一定促進(jìn)A549細(xì)胞增殖的能力。因此根據(jù)作者的試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，JSRV Env感染的細(xì)胞中，激活了EGFR/MAPK通路，其中MAPK/ERK通路的激活會(huì)抑制細(xì)胞的增殖，并抵抗細(xì)胞凋亡，而MAPK/p38的激活會(huì)抑制MAPK/ERK通路，p-p38的表達(dá)量較強(qiáng)又高于p-Erk1/2的表達(dá)量，因此在它們的綜合作用下，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化。而具體EGFR、p38、以及Erk1/2是怎樣在共同調(diào)控并交互作用的同時(shí)激活下游的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)綿羊肺腺瘤的發(fā)生發(fā)展我們還在繼續(xù)做進(jìn)一步研究。

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(編輯白永平)

Recombinant Plasmid pcDNA4/myc-His/exJSRV-env Transiently Transfect A549 Cells and Detect the Activation of MAPK Signal Transduction Pathway

SUN Xiao-lin1，DU Fang-yuan1，LIU Shu-ying1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Huhhot010018，China；2.KeyLaboratoryofClinicalDiagnosisandTreatmentTechnologyinAnimalDiseaseofMinistryofAgriculture，Huhhot010018，China)

In order to explore the pathogenesis of exJSRV Env，by the means of the pathology observation and immunohistochemistry，we detected the pathological characteristics and the positive regions of Env，EGFR，p-Erk1/2 and p-p38 in OPA (ovine pulmonary adenomatosis) sheep lung.Then we detected the relative expressions of p-Erk1/2 and p-p38 in sheep lung and in A549 cells after transiently transfecting recombinant plasmid pcDNA4/myc-His/exJSRV-env by Western blot.Finally we detected the proliferation activity of the cells with recombinant plasmid by CCK-8.Immunohistochemistry results revealed that infected lung cells expressed Env in alveolar epithelial cells and tumor cells；EGFR in alveolar epithelial cells，tumor cells slipping off and interstitial cells but less expressed in alveolar epithelial cells and bronchial epithelial cells in normal sheep lung；p-Erk1/2 and p-p38 in alveolar epithelial cells and tumor cells.Western blot results showed that the activation of p-Erk and p-p38 in OPA sheep lung were higher than normal sheep lung.The relative expressions of p-Erk and p-p38 in the A549 cells with recombinant plasmid were higher than control cells.And CCK8 showed that the proliferation activity of the cells with recombinant plasmid were higher than the control cells.We conclude that exJSRV Env activated EGFR/MAPK signal transduction pathway in A549 cells，and possibly promoted the malignant cell proliferation by this pathway and tumorigenesis.We provide a platform for the pathogenesis of JSRV Env.

exJSRV；envelope protein；MAPK signal transduction pathway；cell proliferation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.017

2016-03-28

國(guó)家自然基金(31360597)；內(nèi)蒙古科技廳應(yīng)用研究項(xiàng)目(201502070)；內(nèi)蒙古草原英才創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(20151031)

孫曉林(1989-)，女，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，博士生，主要從事動(dòng)物生殖內(nèi)分泌與病毒病理學(xué)的研究，E-mail：732121783@qq.com

劉淑英，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：liushuying_imau@126.com

S852.659.3

A

0366-6964(2016)08-1658-09