用RT-PCR檢測海蘭褐蛋雞禽戊型肝炎病毒

楊樹青，孫　嘉，孔祥偉，贠魯祥，孫淑紅

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271018)

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用RT-PCR檢測海蘭褐蛋雞禽戊型肝炎病毒

楊樹青，孫嘉，孔祥偉，贠魯祥，孫淑紅*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271018)

為證實(shí)我國蛋雞群中存在禽戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)，從患有大肝大脾病的某海蘭褐蛋雞群采集糞便樣品40份、血漿樣品10份。提取RNA后，進(jìn)行禽HEVORF2基因片段的RT-PCR(reverse transcription PCR)檢測，陽性樣品進(jìn)行克隆測序。同時(shí)采集疑似HEV感染雞的肝，在兩周齡SPF雞進(jìn)行了人工接種試驗(yàn)。結(jié)果表明，來自海蘭褐蛋雞群的40份糞便和10份血漿樣品中，27份糞便樣品和4份血漿樣品為禽HEV RNA陽性。隨機(jī)選取兩個(gè)陽性樣品的序列進(jìn)行分析，其與國內(nèi)外參考序列相似性為78.1%～98.3%。進(jìn)化樹分析顯示與中國、歐洲參考株在同一分支，屬于禽HEV基因3型。人工接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，接種后14 d的SPF雞肝中均鑒定出HEV RNA陽性(4/4)。我國蛋雞群存在基因3型禽HEV。本研究首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道國內(nèi)蛋雞存在禽HEV，這為進(jìn)一步了解禽HEV在我國雞群的流行狀況及其危害提供了依據(jù)。

禽戊型肝炎病毒(HEV)；海蘭褐蛋雞；大肝大脾病(BLS)；基因3型

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)屬于肝炎病毒屬，是一種無囊膜、單股正鏈RNA病毒。禽HEV分為4個(gè)基因型，其中，澳大利亞和韓國株為基因1型，美國原型株和無毒株為基因2型，歐洲和中國株為基因3型，中國臺灣株和匈牙利株為基因4型[1-4]。禽HEV是引起家禽大肝大脾病和肝脾腫大綜合征的主要病原[5-7]，主要感染30～72周齡的產(chǎn)蛋雞和肉種雞，造成產(chǎn)蛋率下降和死淘率升高，給生產(chǎn)效益造成損失。1997年楊德吉等證實(shí)了我國雞群中存在大肝大脾病病毒(big liver and spleen disease virus，BLSV)抗體[8]，2007年梁久紅等調(diào)查我國南方的雞群，發(fā)現(xiàn)禽HEV血清抗體陽性率為33%[7]，2008年張璐等對廣東、山東和黑龍江三個(gè)地區(qū)健康雞血清的禽HEV 抗體進(jìn)行調(diào)查，陽性率為28.3%，而表現(xiàn)肝脾、腫大雞的血清陽性率為43.3%[9]。2005年馬玉玲等利用RT-PCR方法從南京某雞場擴(kuò)增獲得了一小段BLSV的核酸序列[10]，但并沒有后續(xù)的相關(guān)報(bào)道。2010年趙欽等從肉種雞中分離到禽HEV，首次證實(shí)了我國肉種雞中存在禽HEV，并且證明為禽HEV基因3型[11]。在國外，已報(bào)道禽HEV感染蛋雞群并引起發(fā)病，并帶來較大經(jīng)濟(jì)損失[12-13]，但在國內(nèi)還未有蛋雞存在禽HEV的報(bào)道。為證實(shí)國內(nèi)蛋雞群是否存在禽HEV，作者對患有大肝大脾病的某海蘭褐蛋雞群采集了糞便、血液樣品等進(jìn)行了RT-PCR檢測，旨在鑒定禽HEV，并進(jìn)一步了解其在蛋雞群流行情況及危害提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1　材料方法

1.1主要儀器和試劑

RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒來自Biomiga公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒來自Abm公司，TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker、pMD18-T載體、感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2臨床病例與樣品采集

江蘇省某27周齡海蘭褐蛋雞群表現(xiàn)出患大肝大脾病的典型癥狀，食欲不振、精神萎靡，產(chǎn)蛋率下降及死淘率增加。對部分病雞進(jìn)行剖檢，觀察發(fā)現(xiàn)肝、脾嚴(yán)重腫大，少數(shù)發(fā)病雞出現(xiàn)黃疸，卵巢退化等病變。分別從兩個(gè)雞舍隨機(jī)采集40份糞便與10份血漿，并采集疑似HEV感染雞的肝。

1.3糞便和血漿樣品中禽HEV RNA的提取與RT-PCR的擴(kuò)增

1.3.1RNA提取及RT-PCR的擴(kuò)增按照RNA提取試劑盒說明書，對糞便、血漿樣品進(jìn)行RNA提取。按照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

根據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道，設(shè)計(jì)禽HEVORF2引物序列。外側(cè)引物序列為5′-TCGCCTGGTAATACAAATGC-3′和5′-GCGTTCCCGACAGGTCGG-CC-3′；內(nèi)側(cè)引物序列為5′-ACAAATGCTAGGG-TCACCCG-3′和5′-ATGTACTGACCACTGGCC-GC-3′。外側(cè)引物目的擴(kuò)增片段為278 bp，內(nèi)側(cè)引物目的擴(kuò)增片段為242 bp。

以cDNA為模板，使用外側(cè)引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、53 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，31個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以第一次PCR產(chǎn)物為模板，使用內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、57 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，31個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.3.2陽性樣品的克隆、測序隨機(jī)選取2個(gè)海蘭褐蛋雞糞便陽性樣品，用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。與pMD-18T載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆送博尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。1.3.3禽HEVORF2基因序列的同源性比較與基因型分析將獲得的HLHDJ1和HLHDJ2序列與8個(gè)國內(nèi)外經(jīng)典參考株(澳大利亞株AM943647、韓國株JN597006、美國原型株AY535004、美國無毒株EF206691、歐洲株AM943646、中國株GU954430、匈牙利株JN997392、中國臺灣株KF511797)進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹分析，鑒定其基因型。

1.4HEV RNA陽性樣品人工接種兩周齡SPF雞

取HEV RNA陽性雞的肝1 g與4 mL PBS緩沖液混合研磨并過濾，肝懸液采用翅靜脈注射的方式，按0.1 mL·只-1的劑量人工接種4只兩周齡SPF雞。飼養(yǎng)至14 d采集肝，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行HEV RNA的RT-PCR鑒定。

2　結(jié)　果

2.1RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

海蘭褐蛋雞的40份糞便樣品中，27個(gè)樣品擴(kuò)增出250 bp左右的目的條帶；10份血漿樣品中，4個(gè)樣品擴(kuò)增出250 bp左右的目的條帶。圖1顯示為部分樣品的電泳結(jié)果。

M.DL2000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～11.部分樣品；12.陰性對照；13.陽性對照M.DL2000 marker；1-11.Samples；12.Negative control；13.Positive control圖1　樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Amplification of HEV gene from samples by RT-PCR

2.2兩個(gè)禽HEVORF2基因序列的同源性比較

隨機(jī)挑取的兩個(gè)陽性樣品編號為HLHDJ1、HLHDJ2，測序結(jié)果顯示均為242 bp的禽HEVORF2基因片段，兩個(gè)樣品之間的序列相似性為99.6%。與其他8個(gè)國內(nèi)外經(jīng)典參考株的相似性為78.1%～98.3%，其中與歐洲參考株和中國參考株同源性最高，相似性在96.3%～98.3%。而與美國無毒株相比，相似性最低，僅為78.1%～78.5%(圖2)。

圖2　兩株禽HEV部分ORF2基因序列與國內(nèi)外參考株同源性比較Fig.2　Homology comparison of two avian HEV partial ORF2 sequence and reference strains

2.3兩個(gè)禽HEV ORF2基因序列的基因型分析

基因進(jìn)化樹顯示，HLHDJ1、HLHDJ2與中國參考株GU954430和歐洲參考株AM943646在同一分支(圖3)。該結(jié)果表明，2個(gè)來自國內(nèi)海蘭褐蛋雞群的禽HEV株屬于基因3型。

2.4人工接種兩周齡SPF雞的RT-PCR檢測

用禽戊型肝炎病毒陽性樣本接種4只SPF雞，飼養(yǎng)至14 d，無任何臨床癥狀。同時(shí)，采集4份肝樣品，RT-PCR方法均檢測到250 bp大小的目的條帶。該檢測結(jié)果表明，海蘭褐蛋雞樣品中禽HEV具有傳染性。

3　討　論

禽HEV主要感染30～72周齡的產(chǎn)蛋雞和肉種雞，造成產(chǎn)蛋率下降和死淘率升高。美國等已報(bào)道禽HEV感染蛋雞群并引起發(fā)病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失[12-13]，在我國，2010年趙欽等從我國飼養(yǎng)的肉種雞中鑒定出禽HEV，并證實(shí)了我國肉雞群中存在基因3型的禽HEV[11]。此前，梁久紅等僅完成了禽HEV抗體的檢測，證明了我國雞群禽HEV抗體陽性[7]。本研究證實(shí)了國內(nèi)海蘭褐蛋雞群存在禽HEV，這是首次發(fā)現(xiàn)國內(nèi)蛋雞群存在禽HEV并報(bào)道。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，來自海蘭褐蛋雞的2株禽HEV的序列相似性高達(dá)99.6%，并同為基因3型，與I.Bilic等提出的禽HEV基因型的地域性特點(diǎn)相符合[6]。

圖3　禽HEV部分ORF2基因序列構(gòu)建的基因進(jìn)化樹Fig.3　Genetic evolution tree based on partial ORF2 sequence of avian HEV strains

Z.F.Sun等使用美國禽HEV成功感染火雞，證實(shí)了禽HEV 可以被其他禽類感染，但是人工感染豬、恒河猴卻沒有成功[14]。周恩民等人檢測2 000多份健康鴨血清，發(fā)現(xiàn)抗禽HEV ORF2 抗體的陽性率約為20%[15]，同時(shí)，張紅霞等對7 000 多份健康青年血清進(jìn)行禽HEV 特異抗體檢測，發(fā)現(xiàn)28 份血清為禽HEV抗體陽性[16]。這些試驗(yàn)結(jié)果都表明，禽HEV具有跨物種傳播的可能性，同時(shí)不排除禽HEV具有人畜共患的可能性。

禽HEV通過翅靜脈接種SPF 雞，被接種雞所產(chǎn)雞蛋蛋清中可以檢測到禽HEV，并且含有禽HEV 的蛋清能夠再次成功感染SPF 雞[17]。感染禽HEV的蛋雞所生產(chǎn)的雞蛋中可能存在禽HEV，隨著雞蛋在不同地區(qū)的銷售、運(yùn)輸?shù)?，可能會?dǎo)致禽HEV的地域性擴(kuò)散。本研究用疑似HEV感染雞的肝制備懸液，采用翅靜脈注射的方式人工接種兩周齡SPF雞，并在接種后14 d的SPF雞肝中采用RT-PCR方法檢測到HEV RNA陽性。顯然，來自海蘭褐蛋雞的HEV RNA陽性樣本具有傳染性，如進(jìn)一步在我國蛋雞群中傳播，將可能給養(yǎng)禽業(yè)帶來新的風(fēng)險(xiǎn)。

4　結(jié)　論

發(fā)現(xiàn)海蘭褐蛋雞存在基因3型禽HEV，且來自海蘭褐蛋雞的HEV RNA陽性樣本具有傳染性，這為探明禽HEV在我國雞群中的傳播及其防控提供了一定的理論依據(jù)。

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(編輯白永平)

Detection of Avian Hepatitis E Virus in Hailan Brown Layer Chickens

YANG Shu-qing，SUN Jia，KONG Xiang-wei，YUN Lu-xiang，SUN Shu-hong*

(AnimalScienceandTechnologyCollege，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

We aimed to identify the existence of avian hepatitis E virus (HEV) in broiler breeders in China.In the current study，a total of 40 fecal and 10 serum samples were collected from Hailan brown laying hens suffered from the big liver and spleen disease to detect the avian HEVORF2 gene by reverse transcription PCR (RT-PCR).The positive PCR products were cloned and sequenced.Artificial inoculation experiment was carried out on two-week-old SPF chickens with the liver of suspected HEV infected chickens.As the result，27 of 40 fecal samples and 4 of 10 serum samples were detected positive for avian HEV RNA.Sequences analysis revealed that 2 HEV RNA positive samples shared 78.1%-98.3% nucleotide sequence identities to avian HEV strain reported in NCBI.Phylogenetic analysis showed that these avian HEVs related to China and Europe isolates belonged to avian HEV genotype 3.All of four SPF chickens were positive of avian HEV helicase gene RNA at 14 days after intravenous inoculation.These results confirmed the existence of avian HEV infection in laying hens in China，which provide experimental research basis of avian HEV.

avian hepatitis E virus(HEV)；Hailan Brown laying hens；big liver and spleen disease；genotype 3

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.012

2016-02-16

山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GNC110006)

楊樹青(1991-)，男，山東鄆城人，碩士生，主要從事禽病學(xué)研究， E-mail：601297639@qq.com；孫嘉(1990-)，男，山東青島人，碩士生，主要從事禽病學(xué)研究，E-mail：1137224981@qq.com，二人共為同等貢獻(xiàn)作者

孫淑紅，教授，主要從事家禽病毒病研究，E-mail: sunshuhong@sdau.edu.cn

S852.659.6

A

0366-6964(2016)08-1618-05