UV-分光光度計(jì)法和HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定健脾止瀉膠囊中多糖含量

祁　俊　韓曉珂　梁朝鋒安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖　241000

UV-分光光度計(jì)法和HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定健脾止瀉膠囊中多糖含量

祁俊韓曉珂梁朝鋒
安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖241000

目的 建立健脾止瀉膠囊多糖的含量測(cè)定方法。方法 以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量；采用1.5mol/L硫酸溶液水解多糖，通過(guò)堿中和、乙醇沉淀的方法得到單糖，用HPLC-ELSD方法測(cè)定其含量；色譜條件：色譜柱為Xbridge Amide column（4.6 mm×150mm，3.5μm）；流動(dòng)相為乙腈∶0.1%三乙胺（75∶25）；柱溫：30℃；流速為1.0mL/min；ELSD漂移管溫度為95℃；氣體流速為3.0 L/min。結(jié)果 苯酚-硫酸法中，葡萄糖在6.8～68.0μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系（r2=0.9995），平均回收率為96.1%。HPLC-ELSD法中，無(wú)水葡萄糖在0.0507～0.8110mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r2=0.9998），平均回收率為97.1%，RSD為1.4%。兩種測(cè)定方法測(cè)定多糖的平均含量分別為22.3%、15.2%。結(jié)論 該方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，可以作為健脾止瀉膠囊多糖的含量測(cè)定方法。

健脾止瀉膠囊；無(wú)水葡萄糖；苯酚-硫酸法；HPLC-ELSD法

健脾止瀉膠囊為蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院即將申報(bào)的院內(nèi)制劑品種，為名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方，本方由茯苓、薏苡仁、白芍、山藥、黨參、白術(shù)等藥味組成，具有補(bǔ)益脾胃，兼以滲濕止瀉。茯苓既能健脾，又能滲濕，與黨參、白術(shù)、山藥等配伍，對(duì)于脾虛運(yùn)化失常所致泄瀉、帶下，有標(biāo)本兼顧之效。茯苓的主要化學(xué)成分為茯苓糖，含量約為84.2%，其中β-茯苓聚糖為主要成分，即茯苓多糖［2］。在多糖測(cè)定時(shí)，一般常用硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法作為多糖的含量測(cè)定方法［3］。另外多糖的定性和定量組成可通過(guò)酸催化水解多糖成單糖或寡糖后再進(jìn)行分析［4］。甲醇分解、乙酰分解作用、甲醛分解作用、酶水解等方法也可用于多糖降解。本研究運(yùn)用了苯酚-硫酸法測(cè)定了多糖的含量，由于文獻(xiàn)報(bào)道苯酚-硫酸法穩(wěn)定性均較差，重現(xiàn)性也不理想，故本研究同時(shí)采用硫酸水解，通過(guò)中和、沉淀等處理后，利用HPLC-ELSD色譜技術(shù)對(duì)其成分含量進(jìn)行了檢測(cè)。

1　儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀；Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；D-無(wú)水葡萄糖（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：110833-200904）；XP205電子天平（瑞士梅特勒公司）；優(yōu)普醫(yī)療純水制造系統(tǒng)；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HHW-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠）；高純氮（安徽金鼎鍋爐股份有限公司，純度≥99.999%）；乙腈（HPLC/ Spectro，美國(guó)TEDIA公司）；硫酸、正丁醇、無(wú)水乙醇、甲醇、乙醚均為分析純。

2　UV-分光光度計(jì)法測(cè)定總糖含量

2.1對(duì)照品溶液的制備

取105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每毫升含40μg的溶液，即得［5-12］。

2.25%苯酚溶液的制備

取苯酚100 g，加鋁粉0.1 g，碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾收集182℃餾分，稱(chēng)取此餾分5 g，置100 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液2mL，精密加入5%苯酚水溶液1mL、濃硫酸7mL，混勻，于水浴中20min，取出，于冰浴中5 min。另以未加葡萄糖的溶液參比，分別于200～800 nm范圍內(nèi)掃描，最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。見(jiàn)圖1。

圖1　葡萄糖-苯酚硫酸法紫外掃描圖

2.4供試品溶液的制備

取樣品（批號(hào)140301）約0.4 g，精密稱(chēng)定，加入50mL無(wú)水乙醇加熱回流2 h，濾過(guò)，殘?jiān)鼡]至無(wú)醇味，將殘?jiān)蜑V紙置燒瓶中，加入50 mL水回流提取2次，每次2 h，趁熱過(guò)濾，殘?jiān)盁坑脽崴礈?，洗液與濾液合并，濃縮轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL至25 mL量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

分別精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，置于10mL的量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，配成系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取2mL，精密加入5%苯酚水溶液1mL、濃硫酸7mL，混勻，水浴加熱20min，取出，冰浴5min。以蒸餾水為空白，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.0136X-0.0069（r2=0.9995）。

2.6精密度試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)140301）約0.4 g，精密稱(chēng)定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量取2mL”起依法操作，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算吸光度RSD為0.78%。表明精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)140301）約0.4 g，精密稱(chēng)定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量取2 mL”起依法操作，測(cè)定吸光度，分別于0、1、2、4、6、8、10、24 h測(cè)定，計(jì)算吸光度RSD為1.27%，說(shuō)明在樣品顯色之后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)140301）約0.4 g，6份，精密稱(chēng)定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量取2mL”起依法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算其平均含量為22.3%，RSD為1.16%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)140301）約0.2 g，6份，精密稱(chēng)定，加入50mL無(wú)水乙醇加熱回流2 h，濾過(guò)，殘?jiān)鼡]至無(wú)醇味，將殘?jiān)蜑V紙置燒瓶中，精密加入葡萄糖對(duì)照品適量，加50 mL水回流提取2次，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量取2 mL”起依法操作，測(cè)定吸光度，結(jié)果表明加樣回收率符合要求。見(jiàn)表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)

2.10樣品含量測(cè)定

取3批樣品各約0.4 g，精密稱(chēng)定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量2 mL”起依法操作，測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　樣品含量測(cè)定

3　HPLC-ELSD法測(cè)定總糖含量

3.1色譜條件

色譜柱：Xbridge Amide column（4.6mm×150mm，3.5μm）；流動(dòng)相：乙腈∶0.1%三乙胺=75∶25；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度：95℃；氣體流速：3.0 L/min；理論塔板數(shù)按D-葡萄糖峰計(jì)算應(yīng)不低于3000［13-18］。

3.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取D-無(wú)水葡萄糖2份，分別加水制成每毫升含0.30mg和0.80mg的溶液，即得。

3.3供試品溶液的制備

取樣品約0.3 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加水飽和正丁醇25mL，超聲處理30min，放冷，4000 r/min離心10min，傾出上清液，沉淀加入配制好的1.5mol/L硫酸溶液25mL，沸水浴3 h，取出，冷卻至室溫，滴加30%KOH溶液中和至pH值6～7，加入無(wú)水乙醇使含醇量達(dá)到70%，靜置片刻，4000 r/min離心10 min，取上清液，減壓回收乙醇至適量，轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密吸取對(duì)照品液與供試品液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。HPLC-ELSD色譜圖見(jiàn)圖2～3。

圖2　D-無(wú)水葡萄糖HP LC-EL SD色譜圖

圖3　樣品HPLC-ELSD色譜圖

3.4線性試驗(yàn)

取D-無(wú)水葡萄糖適量，精密稱(chēng)定25.35 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。從上述對(duì)照品溶液中分別精密移取適量，配成0.0507、0.1014、0.2028、0.4055、0.6083、0.8110 mg/mL的系列濃度對(duì)照品溶液，搖勻，進(jìn)樣量為10μL。以峰面積的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)樣濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為Y=0.5252X-3.9398 （r2=0.9998），結(jié)果表明D-無(wú)水葡萄糖在0.0507～0.8110mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.5精密度試驗(yàn)

取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（0.4055 mg/mL）溶液，精密吸取10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積積分值，計(jì)算RSD為0.65%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品約0.3 g，精密稱(chēng)定，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，分別在第0、2、4、6、8、10小時(shí)進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積積分值，計(jì)算RSD為1.33%，說(shuō)明該方法穩(wěn)定性良好。

3.7重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品約0.3 g，精密稱(chēng)定，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，6份，測(cè)定，結(jié)果D-無(wú)水葡萄糖的平均含量為15.2%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.8加樣回收試驗(yàn)

取樣品約0.15 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，結(jié)果表明加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果符合要求。見(jiàn)表3。

表3　加樣回收率試驗(yàn)

3.9樣品含量測(cè)定

取3批樣品各約0.3 g，精密稱(chēng)定，按“3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　3批樣品含量測(cè)定結(jié)果

4　討論

苯酚-硫酸法測(cè)定原理是根據(jù)多糖在硫酸的作用下先分解成單糖分子，并迅速脫水生成糠醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物測(cè)定［19-21］，此方法專(zhuān)屬性較差，但穩(wěn)定性較好，彌補(bǔ)了HPLC-ELSD法測(cè)定中由于對(duì)照品單一而使結(jié)果偏小的缺點(diǎn)；HPLC-ELSD法是通過(guò)將多糖完全水解，通過(guò)測(cè)定葡萄糖來(lái)反映多糖的含量，克服了多糖含量測(cè)定中專(zhuān)屬性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，在以后的研究過(guò)程中，可以選用不同的單糖對(duì)照品來(lái)進(jìn)行測(cè)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加真實(shí)、可信，能更好地反映多糖的含量及各個(gè)單糖的比例。

在色譜條件的選擇上，考察了樣品在乙腈和水、乙腈和0.1%三乙胺、乙腈和0.2%三乙胺系統(tǒng)中的分離情況。結(jié)果乙腈和水比例在（81∶19）、（85∶15）、（89∶11）3個(gè)系統(tǒng)中，對(duì)照品葡萄糖均為兩個(gè)峰，而在乙腈和0.1%三乙胺系統(tǒng)中，對(duì)照品葡萄糖為單峰，說(shuō)明三乙胺能加速葡萄糖兩個(gè)構(gòu)型之間的轉(zhuǎn)化。乙腈和0.2%三乙胺系統(tǒng)與乙腈和0.1%三乙胺系統(tǒng)沒(méi)有明顯差異，故選擇乙腈和0.1%三乙胺系統(tǒng)。

在前處理的過(guò)程中，考察了甲醇、無(wú)水乙醇、正丁醇、水飽和正丁醇、乙醚處理后樣品中葡萄糖的含量，結(jié)果乙醚前處理后得到的葡萄糖含量最高，但考慮到樣品中含有苷類(lèi)成分，乙醚前處理不能有效地將其去除；甲醇、無(wú)水乙醇能有效地去除大量的苷類(lèi)成分，但小分子的葡萄糖也有可能被除去。綜合考慮之下，又對(duì)正丁醇和水飽和正丁醇去除苷類(lèi)能力進(jìn)行了進(jìn)一步的考察，結(jié)果水飽和正丁醇處理后樣品中芍藥苷的含量為0.05%（原2.8%），故選擇水飽和正丁醇作為前處理的試劑。

在樣品的處理過(guò)程中，對(duì)水解時(shí)間進(jìn)行了考察，選擇了1、2、3、4 h作為考察對(duì)象，結(jié)果在3 h時(shí)水解比較完全，所以選擇水解時(shí)間為3 h；對(duì)醇沉濃度進(jìn)行了考察，選擇了50%、60%、70%、80%作為考察對(duì)象，結(jié)果4個(gè)不同的醇沉濃度對(duì)結(jié)果影響不大，考慮到醇沉效果及盡量避免葡萄糖的損失，確定最終的醇沉濃度為70%。

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Determination of polysaccharide content in Jianpizhixie Capsules by UV-spectrophotometry and HPLC-ELSD method

QI JunHAN XiaokeLIANG Chaofeng
Preparation Room，Wuhu Hospital of TCM，Anhui Province，Wuhu241000，China

Objective To establish a determination method for polysaccharide in Jianpizhixie Capsules Methods Anhydrous glucose was used as

ubstance.Total sugar content was determined by phenol-sulfate acid method；1.5mol/L hydrolyzed polysaccharide sulfate solution was used，the method of alkali neutralization and ethanol precipitation was used to get simple sugars.The HPLC-ELSD method was used to determine its content.Chromatographic condition:chromatographic column was Xbridge Amide column（4.6mm×150mm，3.5μm）；Mobile phase was acetonitrile-0.1%triethylamine（75∶25），column temperature was 30℃，flow rate was 1.0 mL/min，temperature of ELSD was 95℃，gas flow rate was 3.0 L/min.Results Phenol-sulfate acid method of anhydrous glucose was linear in the ranges of 6.8-68.0μg/mL（r2=0.9995），the average recovery rate was 96.1%.HPLC-ELSD of anhydrous glucose was linear in the ranges of 0.0507-0.8110mg/mL（r2=0.9998），the average recovery was 97.1%，RSD=1.4%.The average contents of two kinds methods for determination of polysaccharide were 22.3%，15.2%.Conclusion The method is stable and feasible，has good repeatability and can be used as the polysaccharide content determination of Jianpizhixie Capsules.

Jianpizhixie Capsules；Anhydrous glucose；Phenol-sulfate acid method；HPLC-ELSD method

R927.2

A

1673-7210（2016）01（c）-0039-05

2015-09-30本文編輯：趙魯楓）

祁?。?966-），男，副主任中藥師，主要從事中藥制劑配制、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和制劑管理工作。

韓曉珂（1981-），女，碩士，主要從事中藥制劑配制、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。