溫經(jīng)止痛凝膠膏劑體外釋放度及透皮特性的研究

張錦炳　李　周　張　艷　王利勝.廣東省韶關市中醫(yī)院藥劑科，廣東韶關　506；.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州廣東　50006

溫經(jīng)止痛凝膠膏劑體外釋放度及透皮特性的研究

張錦炳1李周2張艷2王利勝2
1.廣東省韶關市中醫(yī)院藥劑科，廣東韶關512026；2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州廣東510006

目的 研究溫經(jīng)止痛凝膠膏劑的體外釋放及透皮特性以及揮發(fā)油包合技術對揮發(fā)油透皮特性的影響，為開發(fā)溫經(jīng)止痛處方貼敷預防和治療痛經(jīng)的藥物新型給藥系統(tǒng)提供實驗支持。方法 分別以透析膜和大鼠皮膚為屏障，以擴散池法進行體外釋放和透皮實驗，以方中君臣藥當歸、川芎的主要有效成分之一的藁本內(nèi)酯為指標，利用高效液相色譜法分析，測定溫經(jīng)止痛凝膠膏劑釋放介質和透皮接收液中的藥物濃度，分別以累積釋放量和透皮量對時間進行回歸計算，計算12 h的累計釋放率和24 h的透皮速率。結果 藁本內(nèi)酯自溫經(jīng)止痛凝膠膏劑中體外釋放的方程為Q=4.37t+1.79，r=0.993，釋放速率為4.37μg/（cm2·h），12 h累計釋放率為90.9%；24 h溫經(jīng)止痛凝膠膏劑揮發(fā)油包合組的透皮特性方程為：Q=1.45t+6.06，透皮速率為1.45μg/（cm2·h）；揮發(fā)油包合組24 h的透皮特性方程為Q=2.65t+11.99，透皮速率為2.65μg/（cm2·h）。結論 藁本內(nèi)酯的釋放速率遠大于透皮速率，釋放速率可保證其穩(wěn)定透皮的動力，其透皮過程不受其釋放的限制；包合技術可使藁本內(nèi)酯的透皮速率降低，但是影響不大，揮發(fā)油可包合后再加入凝膠膏劑中。

溫經(jīng)止痛凝膠膏劑；體外釋放度；透皮特性；藁本內(nèi)酯

凝膠膏劑又稱為巴布劑，系指藥材提取物、藥物與適宜的親水基質混勻后，涂布與無紡布上制成的外用制劑，凝膠膏劑具有載藥量大、貼敷性和保濕型好、無致敏與刺激性等優(yōu)點。作為一種經(jīng)皮給藥制劑、凝膠膏劑不經(jīng)過肝臟“首過作用”和胃腸道的破壞，能維持穩(wěn)定持久的血藥濃度并降低毒副作用，進而提高療效，減少給藥次數(shù)［1-5］。溫經(jīng)止痛凝膠膏劑作為一種經(jīng)皮給藥制劑，藥物中有效成分只有從基質中釋放出來并透過皮膚才能發(fā)揮藥效作用，因此研究藥物的釋放度和透皮特性是評價經(jīng)皮給藥制劑的必要內(nèi)容。

溫經(jīng)止痛凝膠膏劑處方由當歸、川芎、冰片、延胡索、吳茱萸、肉桂、細辛等7味中藥組成，在治療寒凝瘀滯、氣滯血瘀所致的痛經(jīng)時效果顯著，其中當歸、川芎分別為處方的君臣藥。溫經(jīng)止痛凝膠膏劑制備時加入的揮發(fā)油由當歸、川芎、細辛、吳茱萸等中藥材提取而得，為了增加揮發(fā)油的穩(wěn)定性，在凝膠膏劑的制備過程中，首先對揮發(fā)油進行了包合，但揮發(fā)油包合之后可能會對其透皮特性產(chǎn)生一定影響［6］。為了考察溫經(jīng)止痛凝膠膏劑的釋放度、透皮特性以及包合技術對揮發(fā)油透皮特性的影響，本研究擬以當歸、川芎的主要有效成分之一的藁本內(nèi)酯為指標成分［7-14］，對溫經(jīng)止痛凝膠膏劑的體外釋放度及體外透皮特性進行考察。

1　儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀包括515泵，2487紫外檢測器（美國Waters公司）；N3000色譜工作站（浙江大學）；TK12A透皮擴散儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；KQ500型超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；DLB200電子天平（日本島津公司）。

藥物干浸膏、揮發(fā)油皆為實驗室自制（處方中揮發(fā)油由當歸、川芎等中藥材提取而得，揮發(fā)油中藁本內(nèi)酯的含量為0.08 g/mL）。藁本內(nèi)酯對照品（成都普菲德生物技術有限公司，批號：121204）；β-環(huán)糊精（β-CD，湖北新穎河化工有限公司）；聚丙烯酸鈉（NP700，廣州市升彤京海淀會精細化工廠）；甘油，丙二醇（廣州化學試劑廠）；油酸（OA，廣州化學試劑廠）；氮酮（Azone，天津市北聯(lián)精細化學試劑廠），冰片（江西吉安市林科天然冰片廠）；色譜純甲醇（迪馬公司），水為蒸餾水，透析袋（上海金穗生物科技有限公司，MWCO：8000～14000）；其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1揮發(fā)油包合物的制備

取處方量的揮發(fā)油0.3mL，加0.6 mL的無水乙醇溶解；另取2.4 gβ-CD，在60℃的恒溫水浴下，將β-CD攪拌溶解于其24 mL的蒸餾水中；將制好的β-CD溶解置于磁力攪拌器上，控制溫度40℃，攪拌速度500 r/min，將揮發(fā)油乙醇溶液緩緩加入到β-CD溶液中，在磁力攪拌器上攪拌0.5 h后，將加入揮發(fā)油乙醇溶液的β-CD水溶液置于冰箱中靜置過夜，過濾，濾渣在40℃真空干燥箱中干燥5 h后取出，置于避光陰涼處備用，濾液用封口膜封存，置于冰箱中備用，即得揮發(fā)油包合物。

2.2溫經(jīng)止痛凝膠膏劑的制備

取卡波姆-980 0.035 g加入1.62mL的水以及包合物濾液1.64mL中溶脹24 h，并加入藥物干膏粉1 g和揮發(fā)油包合物0.19 g，作為A相；取冰片0.05 g、甘油2.0 g、NP-700 0.35 g和乙醇0.4 mL置于燒杯中，攪拌均勻，作為B相；取甘羥鋁0.07 g、酒石酸0.05 g、氮酮0.2 g、丙二醇0.1 g、水0.4mL于50mL燒杯，混勻，作為C相。將C相緩緩加入到A相中，混勻，然后再加入B相，攪拌5 min，即得黏度適宜的正常對照組凝膠膏劑。

2.3藁本內(nèi)酯含量測定方法的建立［15］

2.3.1色譜條件 Platisil ODS色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：328 nm；柱溫25℃；進樣量10μL。以藁本內(nèi)酯色譜峰面積計算，保留時間為7.5min，理論塔板數(shù)按藁本內(nèi)酯峰計應不低于5000。色譜圖見圖1。

綠色經(jīng)濟發(fā)展評價指標體系應具有實際可操作性，要考慮數(shù)據(jù)獲取的難易程度以及可收集性，數(shù)據(jù)最好是統(tǒng)計部門在同一時段按同一口徑、同一標準收集的公開資料。

2.3.2對照品貯備液的制備采用微量進樣器吸取藁本內(nèi)酯對照品適量，置于10 mL容量瓶中，精密稱定其質量為5.04mg，用甲醇定容至刻度，搖勻即得濃度為504μg/mL的藁本內(nèi)酯標準母液。

2.3.3陰性樣品與供試品溶液的制備將生理鹽水加入無水乙醇使兩者比例為6∶4，即得空白接收液（陰性樣品）；另取溫經(jīng)止痛凝膠膏劑體外透皮接收液，過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3.4標準曲線的繪制精密吸取標準母液0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mL，分別置于10mL容量瓶中，定容及搖勻，即得濃度2.52、5.04、12.6、25.2、37.8、50.4μg/mL的系列標準溶液。按照“2.3.1”項下色譜條件，依次進樣，進樣量10μL，重復3次。取平均峰面積（Y）與濃度（X）進行直線回歸分析，得回歸方程為Y=17 238X-3875.4，r=0.9998。結果表明藁本內(nèi)酯在質量濃度為2.52～50.4μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.5精密度試驗取質量濃度25.2μg/mL的對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，連續(xù)重復進樣6次，各10μL，測得藁本內(nèi)酯峰面積，并計算其RSD為0.49%，表明該儀器的精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測定溶液中藁本內(nèi)酯的峰面積，并計算其RSD值為1.14%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)測定是穩(wěn)定的。

2.3.7加樣回收率試驗精密量取已測藁本內(nèi)酯含量的透皮吸收液6份，分別精密加入藁本內(nèi)酯對照品溶液，按上述色譜條件進行測定，計算回收率。結果平均回收率為98.9%，RSD為1.38%，表明該方法準確性良好，可作為制劑的體外釋放度研究的含量測定方法。

2.4體外釋放度測定

圖1　藁本內(nèi)酯HPLC圖

其中Qn：第n個時間點的累積面積透過量（μg/cm）；V：接收室中接受液的總體積（8 mL）；Vi：每次的取樣體積（1 mL）；Cn：第n個取樣點測得的藥物質量濃度（μg/mL）；A：有效擴散面積（3.14 cm2）；m：1 g溫經(jīng)止痛凝膠膏劑中藁本內(nèi)酯的量（200μg）。求得累積滲透量之后，將累積滲透量（Q）對時間（t）進行方程擬合，分別有下列3種方式：零級方程：Q=a t+b；一級方程：ln Q=a t+b；Higuchi方程：Q=a t1/2+b［20-21］。將累計滲透量（Q）對時間（t）用上述3種方式進行回歸，求得回歸方程，并求得回歸系數(shù)（r），回歸系數(shù)最大的方程即為最佳擬合方程，也是能說明溫經(jīng)止痛凝膠膏劑釋藥方式的最佳方程。由表1可以得知，溫經(jīng)止痛凝膠膏劑中藁本內(nèi)酯接近零級速率方程，藥物累計滲透量與時間成正比，12 h溫經(jīng)止痛凝膠膏劑中藁本內(nèi)酯的累計釋放量達到181.9μg，累計釋放率達90.9%，說明溫經(jīng)止痛凝膠膏劑12 h的釋藥特性良好，溫經(jīng)止痛凝膠膏劑的制備工藝合理，滿足經(jīng)皮給藥制劑的要求。實驗數(shù)據(jù)及結果見表1。

2.5包合技術對揮發(fā)油體外透皮特性的影響

2.5.1離體鼠皮的制備與保存取健康小鼠，用電動剃毛機剃去小鼠腹部毛，再用6%的硫化鈉溶液對剩余的毛發(fā)進行脫除，2 d后小鼠脫臼處死，小心剝離腹部皮膚，剔除皮下脂肪組織及粘連物，用生理鹽水反復沖洗干凈，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?（一周內(nèi)使用完）。實驗前自然解凍，每次實驗前檢查皮膚的完整性，不能有任何破損。

表1　溫經(jīng)止痛凝膠膏劑12 h累計釋放量（n=3）

2.5.2離體大鼠透皮試驗以藁本內(nèi)酯24 h的透皮速率及累計透皮量為指標，按照“2.4”項下操作（將Franz擴散池中供給池和接收池之間的屏障換成離體鼠皮、角質層面向供給池）分別對揮發(fā)油包合組及揮發(fā)油未包合組（“2.2”項下包合物換成揮發(fā)油，包合物濾液換成同體積純水）凝膠膏劑藁本內(nèi)酯的透皮特性進行考察，從而包合技術對揮發(fā)油透皮效果的影響，從表2和表3可以看出，未包合組藁本內(nèi)酯的累計透過量明顯高于包合組，說明揮發(fā)油用β-環(huán)糊精包合之后，其透皮特性受到影響，透皮特性降低，但是仍然具有較好的透皮性能，但是揮發(fā)油包合之后能降低其揮發(fā)性能，較大程度地提高穩(wěn)定性，因此最后選擇將揮發(fā)油包合之后再加入到凝膠膏劑之中。見表2～3。

表2　揮發(fā)油包合組與未包合組24 h藁本內(nèi)酯的透皮數(shù)據(jù)（n=3）

表3　揮發(fā)油包合組與未包合組Q-t方程及相應參數(shù)（n=3）

3　討論

“2.2”項下溫經(jīng)止痛凝膠膏劑制備時，A相中加入了制備揮發(fā)油包合物時的濾液（制備時，揮發(fā)油加入β-CD飽和溶液中，攪拌，靜置，過濾得揮發(fā)油飽和物，濾液則加入A相），是因為揮發(fā)油在采用飽和β-CD溶液包合時，未包合的揮發(fā)油溶于或分散在β-CD溶液中，若棄去此部分，將會造成揮發(fā)油的浪費，減少了處方的用量［22］。因此在計算藁本內(nèi)酯的累計釋放率時，溫經(jīng)止痛凝膠膏劑中藁本內(nèi)酯的含量即按加入的揮發(fā)油中所含的藁本內(nèi)酯計算。

冰片是溫經(jīng)止痛凝膠膏劑處方中的藥物之一，為了減少損失冰片并沒有和處方中其他藥物一起提取制備浸膏，而是磨成極細粉之后直接加入到B相；另外冰片還有促滲劑的作用，能促進處方中其他藥物成分的透皮吸收［23］，說明了處方組成的合理性。

溫經(jīng)止痛凝膠膏劑是將中藥復方提取物直接制成的凝膠膏劑，有效成分較多，本研究僅以藁本內(nèi)酯為指標成分考察其藥物的釋放特性，可能不能反映對全方整體的釋放特性［24］，但也是一次有意義的探討，今后將對多個代表性的指標成分進行釋放度的考察。

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Study on release and permeation behavior of Wenjingzhitong Gel Paste in vitro

ZHANG Jinbing1LI Zhou2ZHANG Yan2WANG Lisheng2
1.Department of Pharmacy，Shaoguan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Province，Shaoguan 512026，China；2.School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Province，Guangzhou510006，China

Objective To study the release and permeation behavior of Wenjingzhitong Gel Paste in vitro to be used in the treatment of dysmenorrehea prevention and care and to study the influence of inclusion technique to the permeation behavior of essential oil.Methods Dialysis membrane and rat skin were used as the barriers respectively.The release and permeation experiment were carried out with Franz diffusion cell in vitro.Ligustilide，the main active ingredient of the monarch drug（Angelica sinensis）and ministerial drug（Ligusticum wallichii）in the prescription，was used as a marker，and measured by high performance liquid chromatography（HPLC）method.The accumulated and permeation amount were regressed linearly to time to calculate the release and permeation rate separately.Results The release equation of ligustilide from Wenjingzhitong Gel Paste was Q=4.37t+1.79，r=0.993；the release rate was 4.37μg/（cm2·h）and the accumulated release ratio in 12 h was 90.9%.Permeation equation of Wenjingzhitong Gel Paste with inclusion technique applied to essential oil in 24 h was Q=1.45t+6.06 and the release rate was 1.45μg/（cm2·h），while permeation equation without inclusion technique was Q=2.65t+11.99 and the release rate was 2.65μg/（cm2·h）.Conclusion The release rate of ligustilide from Wenjingzhitong Gel Paste is much greater than the permeation one，which can make ligustilide permeate sustainedly.Inclusion technique makes the permeation rate decrease little，thus the essential oil can be included in the cyclodectrin first and then be added into the hydrogel patch.

Wenjingzhitong Gel Paste；Release in vitro；Permeation behavior；Ligustilide

R284.1

A

1673-7210（2016）01（c）-0035-05

2015-10-12本文編輯：趙魯楓）

廣東省廣州市科技計劃項目（2013J4100080）。

王利勝（1968.7-），男，博士，教授，博士生導師，主要從事藥物制劑新劑型與新技術研究。