生育期金雀異黃素干預(yù)對(duì)親代大鼠生育能力的影響

孫曉溪　張?jiān)撇ā」o(jì)鵬　那曉琳哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江哈爾濱　150081

生育期金雀異黃素干預(yù)對(duì)親代大鼠生育能力的影響

孫曉溪張?jiān)撇üo(jì)鵬那曉琳
哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江哈爾濱150081

目的 探討生育期金雀異黃素干預(yù)對(duì)親代大鼠體重及生育能力的影響。方法 SPF級(jí)性成熟8周齡雌雄SD大鼠實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周后，隨機(jī)分為4組，分別為高劑量組、中劑量組、低劑量組以及對(duì)照組，每組雌鼠8只，雄鼠4只。按雌雄比例為2∶1進(jìn)行合籠交配，同時(shí)給予含有相應(yīng)劑量的金雀異黃素的高脂飼料干預(yù)3周。其中，低、中、高劑量金雀異黃素組每千克飼料分別加入金雀異黃素600、1800、5400mg，對(duì)照組不添加金雀異黃素。實(shí)驗(yàn)期間每周稱量體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取臟器稱重，觀察雄性大鼠精子密度及母鼠懷孕率。結(jié)果 與對(duì)照組比較，高劑量金雀異黃素可以降低母鼠及父鼠體重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)高劑量金雀異黃素可以降低雄性大鼠精子密度，降低母鼠受孕率。結(jié)論 生育期金雀異黃素干預(yù)可以顯著降低親代大鼠的生育能力。

金雀異黃素；生育能力；精子密度；受孕率

金雀異黃素是一種大豆體內(nèi)天然存在的異黃酮類物質(zhì)，能與機(jī)體內(nèi)雌激素受體結(jié)合而顯示出一定的類雌激素樣作用［1］。近年來，許多研究表明，金雀異黃素具有抗氧化、抗癌、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、預(yù)防心血管疾病、改善婦女更年期癥狀、抗衰老等諸多生理功能［2-5］。近年來，隨著大豆深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，出現(xiàn)了大量的大豆?jié)饪s制品以及大豆異黃酮制劑等大豆類提純產(chǎn)品，人們對(duì)金雀異黃素的接觸也超過了傳統(tǒng)意義上的膳食接觸水平。金雀異黃素作為一種環(huán)境雌激素，其潛在的毒性作用也越來越受人們重視［6-7］。而現(xiàn)有的研究中，缺乏金雀異黃素暴露對(duì)生育期母鼠及雄鼠生殖系統(tǒng)的影響。本實(shí)驗(yàn)即通過孕期及哺乳期高劑量金雀異黃素干預(yù)母鼠及父鼠，探討其對(duì)親代大鼠生殖系統(tǒng)的影響，同時(shí)觀察其對(duì)子鼠產(chǎn)量的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及動(dòng)物

受試樣品：大豆異黃酮總含量為98%（西安奧澤生物科技有限公司）。SPF級(jí)8周齡SD大鼠48只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，合格證號(hào)：NO.1140070 0005694），雌性32只，雄性16只。體重為180～200 g。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1飼料配制

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料在AIN-93M基礎(chǔ)上進(jìn)行配制，將不同劑量的金雀異黃素均勻混合在飼料中。分為高劑量組、中劑量組、低劑量組以及對(duì)照組。低、中、高劑量金雀異黃素組每千克飼料分別加入金雀異黃素600、1800、5400mg，對(duì)照組不添加金雀異黃素。飼料配方：成分玉米淀粉350 g/kg、酪蛋白160 g/kg、糊精化玉米淀粉89.5 g/kg、蔗糖100 g/kg、玉米油50 g/kg、豬油150 g/kg、纖維素50 g/kg、混合礦物質(zhì)35 g/kg、混合維生素10 g/kg、L-胱氨酸3 g/kg、豬膽鹽2.5 g/kg。

1.2.2動(dòng)物分組與處理

8周齡性成熟雌雄大鼠，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周后進(jìn)行隨機(jī)分組，每組雌鼠8只，雄鼠4只。分別為：高劑量組、中劑量組、低劑量組和對(duì)照組。按雌雄比例為2∶1進(jìn)行合籠交配，各組同時(shí)給予含有相應(yīng)劑量的金雀異黃素的高脂飼料。各組大鼠自由攝食，待子鼠完全出生后處死母鼠及父鼠，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.3.1實(shí)驗(yàn)期間觀察孕鼠的生長和攝食情況，每周稱量體重1次。

1.2.3.2實(shí)驗(yàn)期間觀察父鼠的生長和攝食情況，每周稱量體重1次，記錄飼養(yǎng)3周后的體重。

1.2.3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各臟器稱重，雌性大鼠取子宮、卵巢稱重，雄性大鼠取睪丸、附睪稱重。

1.2.3.4檢測(cè)精子密度，取兩側(cè)附睪置于一次性試管中，加入4 mL生理鹽水，剪碎組織后于37℃水浴孵育4min。取中間懸浮液10μL置于2mL EP管中，加入990μL生理鹽水，稀釋100倍后，取100μL鋪片后，10×10倍鏡下觀察。

1.2.3.5受孕率，受孕率=（受孕只數(shù)/母鼠例數(shù)）×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)期間不同劑量金雀異黃素對(duì)母鼠及父鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)期間不同劑量金雀異黃素對(duì)母鼠：實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；金雀異黃素干預(yù)后，各實(shí)驗(yàn)組的體重逐漸產(chǎn)生差異；大豆異黃酮干預(yù)1周時(shí)，高劑量組母鼠體重明顯降低，與其他三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；大豆異黃酮干預(yù)3周時(shí)，高、中劑量組與對(duì)照組相比，體重顯著降低（P＜0.05）；同時(shí)，隨著劑量的增加，雌鼠的體重明顯降低，具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)期間金雀異黃素對(duì)父鼠體重的影響：實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；金雀異黃素干預(yù)1周后，高劑量組父鼠體重增長緩慢；到3周末，高劑量和低劑量金雀異黃素干預(yù)可以降低父鼠體重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

2.2不同劑量金雀異黃素干預(yù)對(duì)母鼠及父鼠臟體比的影響

高劑量金雀異黃素干預(yù)可以顯著降低母鼠及父鼠脂肪的臟體比（P＜0.05）。同時(shí)有增加母體子宮臟體比的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其對(duì)母鼠其他臟器如腦、肝臟、腎臟、卵巢的臟體比無明顯影響（P＞0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素對(duì)父鼠睪丸及附睪的臟體比無明顯影響（P＞0.05）。見表2。

2.3不同劑量金雀異黃素干預(yù)對(duì)父鼠精子密度及產(chǎn)子量母鼠受孕率的影響

表1　實(shí)驗(yàn)期間不同劑量金雀異黃素干預(yù)對(duì)母鼠及父鼠體重的影響（g，±s）

表1　實(shí)驗(yàn)期間不同劑量金雀異黃素干預(yù)對(duì)母鼠及父鼠體重的影響（g，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別　母鼠只數(shù)　0周　1周　2周　3周父鼠只數(shù)　0周　1周　2周　3周高劑量組中劑量組低劑量組對(duì)照組8888 219.34±10.24 219.05±5.33 219.33±8.47 219.38±8.11 231.81±12.36*245.37±8.1 251.98±6.91 256.17±15.65 243.63±11.75*261.42±19.67 276.93±16.18 279.6±19.36 241.33±10.54*271.97±25.37*289.8±18.74 307.47±36.16 4444 272.45±7.66 267.70±12.64 267.80±6.71 269.00±7.70 294.20±12.85*311.47±28.22 312.13±7.78 328.87±8.83 357.15±46.14 391.40±22.86 389.37±21.37 403.03±14.80 385.00±13.14*422.67±20.13 399.67±18.5*443.33±9.45

高劑量及中劑量金雀異黃素顯著降低父鼠精子密度（P＜0.05）。同時(shí)，隨著金雀異黃素劑量的增加，母鼠受孕率顯著減少（P＜0.05）。并且隨著劑量的增加，子鼠雌性比例增高（P＜0.05）。見表3。

圖1　實(shí)驗(yàn)期間不同劑量金雀異黃素干預(yù)對(duì)母鼠及父鼠體重的影響

3　討論

金雀異黃素對(duì)大鼠的影響目前國內(nèi)外的結(jié)果都不盡相同，但大部分集中在其作為雌激素替代劑對(duì)絕經(jīng)后雌鼠的影響以及對(duì)腫瘤的抑制作用。其原因可能與給藥劑量、給藥時(shí)間、接觸期限以及給藥方式等有關(guān)［8-10］。本實(shí)驗(yàn)中，采用孕期及懷孕準(zhǔn)備期同時(shí)給予母鼠及父鼠金雀異黃素，探討其對(duì)母鼠及父鼠體重、臟體比以及生殖能力的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量金雀異黃素干預(yù)可以降低母鼠及父鼠的體重，同時(shí)降低母鼠的脂肪臟體比，并且具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。此外，高劑量及中劑量金雀異黃素干預(yù)可以顯著降低父鼠的精子密度，同時(shí)降低雌鼠的受孕率。

目前對(duì)于孕期金雀異黃素干預(yù)對(duì)母鼠體重的影響國內(nèi)鮮有報(bào)道，且大部分都是以大豆異黃酮為干預(yù)對(duì)象。Kishida等［11］發(fā)現(xiàn)通過飲食攝入100～300mg/kg飼料大豆異黃酮可以顯著降低7周齡雌鼠的體重，Zhang等［12］發(fā)現(xiàn)3600 mg/kg飼料大豆異黃酮顯著降低去卵巢雌鼠的體重，其原因是通過抑制攝食量引起的體重降低。這與本研究的結(jié)果基本一致。

表2　不同劑量金雀異黃素干預(yù)對(duì)母鼠及父鼠臟體比的影響（±s）

表2　不同劑量金雀異黃素干預(yù)對(duì)母鼠及父鼠臟體比的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別　母鼠只數(shù)　脂肪　子宮　卵巢父鼠只數(shù)　脂肪　睪丸　附睪高劑量組中劑量組低劑量組對(duì)照組8888 1.28±0.59*1.60±0.66 2.13±0.89 3.45±1.06 0.23±0.07 0.21±0.05 0.19±0.09 0.17±0.04 0.06±0.01 0.05±0.01 0.05±0.01 0.05±0.01 4444 1.93±0.41*2.46±0.44 1.96±0.18*2.82±0.44 0.77±0.05 0.73±0.05 0.85±0.06 0.74±0.10 0.32±0.02 0.31±0.08 0.33±0.02 0.33±0.09

表3　不同劑量金雀異黃素干預(yù)對(duì)父鼠精子密度及產(chǎn)子量母鼠受孕率的影響（±s）

表3　不同劑量金雀異黃素干預(yù)對(duì)父鼠精子密度及產(chǎn)子量母鼠受孕率的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別雌性子鼠比例（%）父鼠只數(shù)　精子密度（×108）母鼠只數(shù)　受孕率（%）高劑量組中劑量組低劑量組對(duì)照組4444 132.25±26.55*214.67±19.01*222.33±30.07 285.00±49.50 8888 0.00 37.50*50.00*87.50*0.00 61.11*56.25*47.82*

Caceres等［13］發(fā)現(xiàn)高劑量大豆異黃酮干預(yù)雄鼠，大鼠體重和體重增重量均明顯減輕，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。說明其影響了雄性大鼠的體重增長，對(duì)雄鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生了負(fù)面作用。

本研究中，發(fā)現(xiàn)各劑量組金雀異黃素干預(yù)對(duì)母鼠及父鼠腦、肝臟、腎臟、脾臟等臟器的臟體比均無顯著性影響，但顯著降低脂肪的臟體比。這與Zhang等［14］的研究一致。其機(jī)制可能是與其誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞凋亡有關(guān)［15-16］。

大豆異黃酮具有雌激素樣作用和抗雌激素樣作用，其是否對(duì)雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生副作用仍存在爭(zhēng)論［17］。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量和中劑量的金雀異黃素干預(yù)可以顯著降低父鼠的精子密度，同時(shí)降低母鼠的受孕率。崔洪斌等［18］發(fā)現(xiàn)高劑量的大豆異黃酮破壞了雄性大鼠的睪丸結(jié)構(gòu)，使其功能喪失，不能產(chǎn)生成熟精子，因此影響了雄性大鼠的性發(fā)育。孫合濤等［19］研究發(fā)現(xiàn)孕期暴露大豆異黃酮對(duì)雄性子鼠的生殖發(fā)育的影響跟大豆異黃酮存在關(guān)系，當(dāng)大豆異黃酮?jiǎng)┝枯^高時(shí)將對(duì)雄性子鼠生殖發(fā)育產(chǎn)生毒性作用。大豆異黃酮孕期和出生后暴露可干擾子鼠雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育，ER-β受體表達(dá)變化可能是其機(jī)制之一［20］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加，子鼠中雌鼠比例增高，這可能與金雀異黃素的雌激素樣作用有關(guān)。

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Effect of genistein on fertility of parental rats in the period of mating

SUN Xiaoxi ZHANG YunboGUO JipengNA Xiaolin
Public Health College，Harbin Medical University，Heilongjiang Province，Harbin150081，China

Objective To explore the effect of genistein on body weight and fertility of parental rats in the period of mating.Methods After adaption for 1 week，8 weeks female and male SD rats were randomized to 4 groups:high-dose group，middle-dose group，low-dose group and control group，8 female rats and 4male rats in each group.Female and male rats were mating at ratio of 2∶1.Different dosage of genistein were given at the beginning of mating fed with highfat diet for 3 weeks.The high，meddle and low dose groups were given 5400，1800，600mg genistein into every kg fodder diet respectively.No genistein was added in control group.Body weight was weighted every week.The organ weights of male and female rats were weighted，the sperm density of male rats and pragnancy rate of female rats were observed at the end of experiment.Results Compared with control group，body weight of female rats in high-dose group decreased，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Meanwhile，the sperm density of male rats and pregnancy rate of female rats reduced in high-dose genistein group.Conlusion Genistein can reduce fertility of parental rats in the period of mating.

Genistein；Fertility；Sperm density；Pregnancy rate

R285

A

1673-7210（2016）01（c）-0004-04

2015-10-11本文編輯：蘇暢）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81202190）。

孫曉溪（1987-），女，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)環(huán)境衛(wèi)生學(xué)專業(yè)2013級(jí)在讀碩士研究生；研究方向：大豆異黃酮的效能。

那曉琳（1964-），女，博士，教授；研究方向：植物雌激素活性。