NB-UVB對HaCaT細(xì)胞CCL22表達(dá)的影響

王延婷　李舒麗　楊鈺琪　高天文　李春英

NB-UVB對HaCaT細(xì)胞CCL22表達(dá)的影響

王延婷李舒麗楊鈺琪高天文李春英

目的： 明確NB-UVB對HaCaT細(xì)胞CCL22的影響。方法： 常規(guī)培養(yǎng)后的HaCaT細(xì)胞分為兩組，一組給予不同劑量NB-UVB（0、100、200、400 mJ/cm2）照射；一組給予NF-κB抑制劑PDTC（1、12.5、25 μmol/L）預(yù)處理后再進(jìn)行NB-UVB照射，采用Real-time PCR及ELISA檢測CCL22表達(dá)；采用Western blot方法檢測NF-κB p65磷酸化水平。結(jié)果： CCL22表達(dá)和NF-κB p65磷酸化的水平隨著NB-UVB照射劑量增強(qiáng)而上調(diào)；PDTC處理后，NB-UVB誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞CCL22表達(dá)及和NF -κB p65磷酸化水平較直接給予NB-UVB明顯下調(diào)，且PDTC濃度越高越明顯。結(jié)論： NB-UVB照射可能通過激活NF-κB信號通路促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞CCL22表達(dá)及分泌。

窄譜中波紫外線； 角質(zhì)形成細(xì)胞； CCL22

NB-UVB廣泛應(yīng)用于多種炎癥性皮膚病如白癜風(fēng)、銀屑病、蕈樣肉芽腫的治療，療效顯著且副作用小。目前關(guān)于NB-UVB治療皮膚病的作用機(jī)制，比較公認(rèn)的觀點是其可直接作用于淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并減少炎癥因子分泌［1］。最新研究提出，NBUVB可促進(jìn)白癜風(fēng)皮損局部Treg細(xì)胞數(shù)量增加，但具體機(jī)制不清［2］。CCL22作為Treg細(xì)胞皮膚遷移的重要趨化因子，在表皮中的表達(dá)水平對Treg皮膚遷移及后續(xù)功能至關(guān)重要。然而目前尚缺乏NB-UVB照射與CCL22表達(dá)關(guān)系的研究。本課題旨在體外細(xì)胞水平研究NB-UVB對角質(zhì)形成細(xì)胞CCL22表達(dá)及分泌的影響，并探討可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑 UV-236B型紫外線光療儀為德國沃曼公司生產(chǎn)，燈管光譜值311 nm。HaCaT細(xì)胞系本室常規(guī)保存，1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自日本Takara公司。兔抗人CCL22抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人NF-κB p65單抗、兔抗人磷酸化NF-κB p65單抗均購自Cell signaling technology公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Sigma公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG購自康為世紀(jì)生物科技公司。ELISA檢測試劑盒購自美國RD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及NB-UVB照射 HaCaT常規(guī)復(fù)蘇、傳代，使用含10%FBS的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將HaCaT細(xì)胞接種于6孔板（1×105個細(xì)胞/孔），待細(xì)胞生長至50%～60%融合時更換無血清培養(yǎng)基，16 h后去除培養(yǎng)基，加入200 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）后接受不同劑量NB-UVB（0，100，200，400 mJ/cm2）照射，照射后用PBS沖洗細(xì)胞2次，予以含10%FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)特定時間點，收集細(xì)胞裂解液Real-time PCR檢測CCL22 mRNA及蛋白表達(dá)水平，收集上清液ELISA檢測培養(yǎng)基中CCL22的分泌水平。同上進(jìn)行NB-UVB照射，予以含10%FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h后檢測NF-κB活化情況。

2　結(jié)果

2.1NB-UVB照射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞CCL22 mRNA表達(dá)及蛋白分泌情況 NB-UVB照射后細(xì)胞裂解液中CCL22 mRNA表達(dá)水平顯著升高，并呈現(xiàn)NB-UVB劑量依賴性（圖1a）。NB-UVB照射后細(xì)胞上清液中CCL22分泌水平顯著增強(qiáng)，與CCL22 mRNA表達(dá)變化一致（圖1b）；HaCaT細(xì)胞經(jīng)400 mJ/cm2NB-UVB照射后，收集不同時間點細(xì)胞上清，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)CCL22分泌水平呈時間依賴方式顯著上調(diào)（圖1c）。以上結(jié)果提示，UVB照射以劑量和時間依賴方式促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞CCL22的表達(dá)及分泌。

圖1　a:NB-UVB照射HaCaT細(xì)胞后CCL22 mRNA表達(dá)（n=4，??P＜0.01，???P＜0.001）；b、c:NB-UVB照射HaCaT細(xì)胞后CCL22蛋白分泌（n=4，?P＜0.05，???P＜0.001）

圖2　NB-UVB照射HaCaT細(xì)胞后CCL22表達(dá)及NF-κB信號通路活化情況

2.2NB-UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞CCL22表達(dá)信號活化情況 HaCaT細(xì)胞經(jīng)NB-UVB照射后2 h，隨著NB-UVB照射劑量增強(qiáng)，磷酸化的NF-κB p65水平顯著升高，同時CCL22蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢（圖2），表明NF-κB p65信號活化可能參與NBUVB誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞CCL22的表達(dá)。

2.3抑制NF-κB p65信號對NB-UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞 CCL22 mRNA表達(dá)及蛋白分泌的影響 在HaCaT細(xì)胞接受400 mJ/cm2NB-UVB照射前，使用NF-κB活化的特異性抑制劑PDTC（1、12.5、25 μM）預(yù)處理30 min，發(fā)現(xiàn)PDTC預(yù)處理可明顯抑制NF-κB p65的磷酸化（圖3a），且PDTC預(yù)處理顯著抑制NBUVB對HaCaT細(xì)胞CCL22 mRNA的誘導(dǎo)效應(yīng)，高劑量PDTC（12.5、25 μM）處理組更為明顯（圖3b）。ELISA檢測結(jié)果也顯示同樣的趨勢（圖3c）。以上結(jié)果提示NF-κB是NB-UVB誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞CCL22表達(dá)及分泌的重要機(jī)制。

圖3　a:PDTC抑制NF-κB活化；b:PDTC抑制NB-UVB對HaCaT細(xì)胞CCL22 mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用（n=3，?P＜0.05，??P＜0.01，???P＜0.001）；c:PDTC抑制CCL22蛋白的分泌（n=5，???P＜0.001）

3　討論

NB-UVB廣泛應(yīng)用于臨床多種炎癥性皮膚病的治療。以往研究表明，NB-UVB抑制皮膚免疫炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制主要包括:抑制Th1細(xì)胞，調(diào)節(jié)Th1/ Th2的平衡；誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞DNA損傷及凋亡，減少炎性細(xì)胞因子分泌；誘導(dǎo)真皮淺層朗格漢斯細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其向周圍淋巴結(jié)遷移，以及促進(jìn)表皮IL-10分泌誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化，促進(jìn)Treg細(xì)胞免疫抑制功能等［1，2］。近年來，由于 Treg細(xì)胞強(qiáng)大的免疫抑制作用，NB-UVB照射對Treg細(xì)胞的作用成了皮膚專家關(guān)注的重點。

CCL22是介導(dǎo)Treg細(xì)胞組織定向遷移的重要趨化因子。針對白癜風(fēng)患者Treg細(xì)胞功能研究，發(fā)現(xiàn)即使是外周存在正常數(shù)量的Treg細(xì)胞及功能活性，但Treg細(xì)胞皮膚遷移能力降低，皮膚局部自身免疫不能被有效抑制導(dǎo)致疾病發(fā)生進(jìn)展［3］。隨后 Klarquist等研究確定，白癜風(fēng)患者皮損區(qū)Treg細(xì)胞浸潤減少源于表皮趨化因子CCL22表達(dá)分泌降低［4］。最近一項研究表明，對白癜風(fēng)小鼠模型予以CCL22基因槍治療，可顯著增強(qiáng)Treg細(xì)胞皮膚遷移，有效抑制皮膚免疫，促進(jìn)白斑復(fù)色［5］。我們的研究結(jié)果顯示，NB-UVB照射可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞趨化因子CCL22表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)其分泌。該結(jié)果為Hegazy等研究發(fā)現(xiàn)NB-UVB照射后白癜風(fēng)皮損局部Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增多提供了合理的解釋［2］。由此提示，NB-UVB照射誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞CCL22表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了Treg細(xì)胞的皮膚遷移，從而抑制皮損局部免疫炎癥反應(yīng)達(dá)到治療效果。

值得注意的是，Ekman等對比NB-UVB照射前后銀屑病患者外周趨化因子表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)NB-UVB對患者外周CCL22以及其他Th1、Th2、Th17型趨化因子均無顯著影響［6］。Shimauchi等也發(fā)現(xiàn)，NBUVB照射對蕈樣肉芽腫患者外周CCL22表達(dá)水平亦無影響［7］。由于趨化因子介導(dǎo)免疫細(xì)胞遷移遵循從低濃度向高濃度遷移原則，結(jié)合我們的研究結(jié)果，即NB-UVB照射誘導(dǎo)表皮CCL22表達(dá)上調(diào)，支持Treg細(xì)胞自外周向皮損組織遷移的可能性。但由于受臨床取材的限制，目前尚無NB-UVB治療前后皮損局部CCL22表達(dá)及Treg細(xì)胞浸潤的檢測，有待進(jìn)一步研究。

以往研究證實，ERK、EGFR、p38 MAPK、JNK、NF -κB、STAT1均是角質(zhì)形成細(xì)胞中誘導(dǎo)CCL22表達(dá)的重要信號機(jī)制［8，9］，各刺激條件決定不同的活化方式。本研究結(jié)果顯示，NB-UVB照射可激活NF-κB信號通路，且抑制NF-κB信號活化顯著下調(diào)CCL22 mRNA表達(dá)及蛋白分泌，表明NF-κB信號是角質(zhì)形成細(xì)胞CCL22表達(dá)的關(guān)鍵信號機(jī)制，在NB-UVB治療炎癥性皮膚病中起重要作用。

綜上，本研究證實NB-UVB可通過活化NF-κB信號促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)分泌趨化因子CCL22，可能參與有效的促進(jìn)Treg細(xì)胞皮膚遷移，從而抑制皮損局部自身免疫反應(yīng)，達(dá)到臨床治療目的。

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（收稿:2016-01-13 修回:2016-01-27）

Effects of NB-UVB on the exPression of CCL22 in HaCaT cells

WANG Yanting，LI Shuli，YANG Yuqi，GAO Tianwen，LI Chunying.

Department of Dermatology，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710032，China Corresponding author:LI Chunying，E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective:To determine the effects of NB-UVB on the expression of CCL22 from HaCaT cells. Methods:The cultrued HaCaT cells were divided into two groups.The HaCaT cells in one group were treated with different dose of NB-UVB（0，100，200，400 mJ/cm2）and those in the second group were treated with NB-UVB（400 mJ/cm2）after the pretreatment with PDTC.The expression of CCL22 was detected by Realtime PCR and ELISA.The level of NF-κB p65 phosphorylation was detected by western blot.Results:The expression of CCL22 and the level of NF-κB p65 phosphorylation in HaCaT cells treated with NB-UVB were increased as the dose of of NB-UVB was increasing.The expression of CCL22 and the level of NF-κB p65 phosphorylation in HaCaT cells pretreated by PDTC were lower than those treated with NB-UVB only and the higher the concentration of PDTC，the effects were more obvious.Conclusion:The CCL22 expression induced by NB-UVB in keratinocytes may through activation of NF-κB pathway.

NB-UVB；keratinocytes；CCL22

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，陜西西安，710032

李春英，E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

1.2.2NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理實驗 HaCaT常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%～80%融合時更換無血清培養(yǎng)基，實驗組予以NF-κB抑制劑PDTC（1，12.5，25 μmol/L）預(yù)處理30 min，對照組予以DMSO處理，之后進(jìn)行400 mJ/cm2NB-UVB照射。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞裂解液及上清檢測CCL22 mRNA表達(dá)及分泌。

1.2.3Real-time PCR檢測CCL22的表達(dá) Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，按照試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR檢測。CCL22引物設(shè)計及合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，上游引物:5’-ATCGCCTACAGACTGCACTC-3’，下游引物:5’-GACGGTAACGGACGTAATCAC-3’。β-actin為內(nèi)參。

1.2.4Western blot印跡檢測CCL22及NF-κB信號通路活化情況 收集實驗處理組及對照組HaCaT細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白含量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（5%濃縮膠，12%分離膠）。PVDF膜經(jīng)甲醇激活后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用TBST稀釋的5%脫脂奶粉室溫封閉1～4 h，予NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、CCL22及β-actin等一抗4℃孵育過夜。次日予以辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育50 min。使用化學(xué)發(fā)光儀檢測結(jié)果。

1.2.5ELISA檢測CCL22表達(dá) 收集實驗組及對照組細(xì)胞上清，嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒操作說明檢測CCL22分泌水平。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。組間檢驗采用one-way anova檢驗法，各組數(shù)據(jù)兩兩比較，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。