低分子殼聚糖對缺氧復(fù)氧大鼠心肌細胞的保護作用

林玲輝，衛(wèi)茹，胡亞平，王卓，李迎娟

(邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北邢臺054300)

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低分子殼聚糖對缺氧復(fù)氧大鼠心肌細胞的保護作用

林玲輝，衛(wèi)茹，胡亞平，王卓，李迎娟

(邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北邢臺054300)

目的 探討低分子殼聚糖(LMCTS)對缺氧復(fù)氧大鼠心肌細胞的保護作用，并探討其作用機制。方法原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞，將其分為空白對照組、模型組及低、中、高LMCTS組。空白對照組正常培養(yǎng)，不予任何處理；模型組用真空缺氧處理1 h后復(fù)氧24 h；低、中、高LMCTS組分別加入含200、400、600 μg/mL LMCTS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后再用真空缺氧處理1 h后復(fù)氧24 h。ELISA法測定各組細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6，Western blot法檢測心肌細胞解偶聯(lián)蛋白-2(UCP-2)表達。結(jié)果 低、中、高LMCTS組心肌細胞存活率均較模型組升高(P均<0.01)。模型組心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6水平高于空白對照組(P均<0.01)，低、中、高LMCTS組均低于模型組，以高LMCTS組最低(P均<0.01)。模型組心肌細胞UCP-2表達較空白對照組升高，低、中、高LMCTS組較模型組降低，以高LMCTS組最低(P均<0.01)。結(jié)論LMCTS對缺氧復(fù)氧心肌細胞具有保護作用，其機制與抑制炎癥反應(yīng)、降低UCP-2表達有關(guān)。

殼聚糖；缺氧復(fù)氧；解偶聯(lián)蛋白-2；心肌細胞；大鼠

低分子殼聚糖(LMCTS)是一種天然的帶正電荷的生物高分子線形多糖，是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，有較高的溶解度，易被吸收和利用。研究表明，殼聚糖具有降血脂、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種特性，廣泛用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域[1～3]。缺氧復(fù)氧損傷指心肌細胞在缺氧復(fù)氧過程中產(chǎn)生各種氧自由基，對細胞膜及生物大分子造成過氧化損傷，破壞細胞膜的正常結(jié)構(gòu)，對心肌細胞造成嚴重損傷[4]。2014～2015年，我們觀察了LMCTS對缺氧復(fù)氧大鼠心肌細胞的保護作用，及其對解偶聯(lián)蛋白-2(UCP-2)表達的影響，探討LMCTS保護大鼠心肌細胞的機制。

1　材料與方法

1.1材料出生72 h內(nèi)的清潔級Wistar大鼠，雌雄不限，由邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實驗動物中心提供。LMCTS購于濟南海得貝海洋生物工程有限公司；UCP-2大鼠單克隆抗體購自Abcam公司；羊抗鼠IgG購于天津三箭生物技術(shù)有限公司；Alexa Fluor 488標記的羊抗鼠IgG抗體購自沃特司生物系統(tǒng)有限公司；UCP-2引物購自上海生工公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；第1鏈cDNA合成試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、TRIzol、胰蛋白酶、青鏈霉素混合溶液均購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；胎牛血清為GIBICO公司產(chǎn)品；高糖DMEM培養(yǎng)基購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司。

1.2大鼠原代心肌細胞培養(yǎng)取大鼠心臟，剪成1 mm3大小的組織塊，加入胰蛋白酶消化，加入PBS，離心棄上清。加入DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液，再加入10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液。差速貼壁90 min后，小心吸出未壁貼細胞懸液至新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.3大鼠缺氧復(fù)氧模型的建立取培養(yǎng)72 h的大鼠心肌細胞，饑餓處理24 h后，隨機分成空白對照組、模型組和低、中、高LMCTS組預(yù)處理組，每組設(shè)6個復(fù)孔，空白對照組正常培養(yǎng)，不予任何處理；模型組用真空缺氧處理1 h后復(fù)氧24 h；低、中、高LMCTS組分別加入含200、400、600 μg/mL LMCTS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，再用真空缺氧處理1 h后復(fù)氧24 h。

1.4心肌細胞活力測定采用MTT比色法。細胞計數(shù)后在96孔板上以1×104/孔接種細胞。每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，室溫低速震蕩30 min充分溶解。酶標儀測定各孔在570 nm波長的吸收值。細胞存活率=(實驗組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

1.5細胞上清中TNF-α、IL-6水平檢測采用ELISA法。收集各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，最后使用酶標儀檢測TNF-α、IL-6。

1.6心肌細胞UCP-2蛋白表達檢測采用Western blot法。將各組細胞用200 μL RIPA裂解液裂解，用干凈的細胞刮將細胞迅速刮下，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，冰上裂解30 min，離心取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE電泳，濃縮膠80 V恒壓，分離膠160 V恒壓，將蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上。TBST溶液洗膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜3次，再用UCP-2抗體(1∶1 000)室溫搖床上孵育2 h，加入羊抗鼠IgG抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，加入ECL顯色液，多功能成像系統(tǒng)顯影。以各組UCP-2蛋白的灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值之比作為UCP-2蛋白的相對表達量。

2　結(jié)果

2.1各組心肌細胞存活率比較空白對照組、模型組及低、中、高LMCTS組細胞存活率分別為100%±1%、67%±39%、70%±29%、78%±7%、89%±2%。模型組細胞存活率較空白對照組降低，低、中、高LMCTS組均較模型組升高(P均<0.01)。

2.2各組心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6水平比較模型組心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6水平高于空白對照組(P均<0.01)，低、中、高LMCTS組均低于模型組，以高LMCTS組最低(P<0.01)。見表1。

表1　各組心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6水平比較(n=6，pg/mL)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與空白對照組比較，#P<0.05。

2.3各組心肌細胞UCP-2蛋白表達比較空白對照組、模型組及低、中、高LMCTS組心肌細胞UCP-2蛋白的相對表達量分別為1.00±0.01、1.50±0.10、1.49±0.12、1.30±0.03、1.06±0.04。模型組心肌細胞UCP-2表達較空白對照組顯著升高；中、高LMCTS組均較模型組降低，且以高LMCTS組最低(P均<0.01)。

3　討論

缺氧復(fù)氧損傷可引起心律失常、急性心力衰竭及心源性休克等，白細胞和許多炎癥因子直接參與或間接調(diào)動更多炎癥介質(zhì)導(dǎo)致心肌損傷。研究證實，殼聚糖能通過提高SOD活性，降低MDA含量，提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，降低脂質(zhì)氧化含量，增強機體抗氧化應(yīng)激能力；抑制腹主動脈再狹窄，在一定范圍內(nèi)具有調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞和血管成纖維細胞增殖的能力[5]。趙英政等[6]報道，殼聚糖可顯著提高鎘中毒大鼠腎組織中SOD活性并降低MDA含量。瞿春瑩等[7]報道，殼聚糖能增強抗氧化酶活性，減輕胃潰瘍局部炎癥介導(dǎo)的氧自由基損傷，進而促進潰瘍愈合。袁菊萍等[8]報道，殼聚糖能降低MDA水平，升高SOD活性，提高其對體內(nèi)氧化自由基的清除能力，減少脂質(zhì)過氧化物生成。高穎暉等[9]測定負荷訓(xùn)練結(jié)束后大鼠肝臟的抗氧化酶系活性時，發(fā)現(xiàn)補充殼聚糖能顯著增強大鼠肝臟抗氧化酶活性，促進SOD編碼基因表達。

UCP-2是一種哺乳動物獨有的、位于線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子載體蛋白，其將H+從線粒體內(nèi)膜滲漏到基質(zhì)中，使氧化磷酸化解偶聯(lián)，導(dǎo)致ATP合成減少。UCP-2廣泛分布于骨骼肌、脂肪、心、肺、腎、肝、腦，與機體能量代謝、心臟功能等有密切聯(lián)系[10]。研究表明，UCP-2在調(diào)控ROS、抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等方面均可發(fā)揮重要作用。Koziel等[11]發(fā)現(xiàn)，UCP-2能減少大鼠心肌ROS產(chǎn)生，降低細胞內(nèi)Ca2+濃度，對細胞起到保護作用。Derdak等[12]發(fā)現(xiàn)，UCP-2能通過抑制NF-κB的產(chǎn)生，減少炎癥介質(zhì)的釋放和ROS的生成而保護心肌。還有研究表明，UCP-2能抑制平滑肌細胞的增殖和遷移，并防止內(nèi)皮細胞和心肌細胞凋亡[13，14]。殼聚糖對大鼠心肌細胞的保護作用是否與UCP2表達有關(guān)，目前未見文獻報道。

本研究顯示，與空白對照組相比，模型組心肌細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6水平顯著增高，表明心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷可引起明顯的炎癥反應(yīng)。不同濃度LMCTS處理后可顯著降低缺氧復(fù)氧心肌細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6水平，表明LMCTS能夠抑制炎癥反應(yīng)，且濃度越高，其抑制炎癥反應(yīng)的作用越明顯。在正常心肌細胞中，UCP-2呈低水平表達；在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的無LMCTS預(yù)處理的心肌細胞損傷模型中，UCP-2表達明顯升高；而LMCTS對缺氧復(fù)氧損傷心肌細胞UCP-2表達均具有抑制作用，其中以600 μg/mL LMCTS作用最明顯。表明LMCTS對缺氧復(fù)氧心肌細胞具有保護作用，該作用與其抑制炎癥反應(yīng)、降低UCP-2表達有關(guān)。

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河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目(QN2014303)。

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A

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