miRNA-200b通過靶向VEGF抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲

劉越峰　羅衛(wèi)民　張勇　鐘曉東

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·基礎(chǔ)研究論著·

miRNA-200b通過靶向VEGF抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲

劉越峰羅衛(wèi)民張勇鐘曉東

目的明確miRNA-200b是否通過調(diào)控靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲，進(jìn)一步揭示miRNA-200b抗腫瘤的分子機(jī)制。方法將視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞分成6組：miRNA-200b、miRNA-NC、sh-VEGF、shRNA-NC、miRNA-200b+sh-VEGF、miRNA-NC+shRNA-NC組。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-200b對(duì)VEGF的3’-非翻譯區(qū)熒光素酶活性的影響；蛋白免疫印跡法檢測(cè)sh-VEGF轉(zhuǎn)染的干擾效果；MTS實(shí)驗(yàn)與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)上述各組對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖與侵襲的影響。結(jié)果熒光素酶報(bào)告檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-200b能特異性地與VEGF的3’-非翻譯區(qū)結(jié)合，并抑制其熒光素酶的活性；蛋白免疫印跡法顯示，sh-VEGF轉(zhuǎn)染組中VEGF的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下調(diào)；MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-200b 組與sh-VEGF組48 h后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存率均低于各自對(duì)照組(P均<0.05)；而共轉(zhuǎn)染miRNA-200b+sh-VEGF組 48 h后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存率低于對(duì)照組、miRNA-200b組、sh-VEGF組(F=9.887,P均<0.05)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-200b組與sh-VEGF組48 h后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的穿膜能力均低于各自對(duì)照組(P均<0.05)；而共轉(zhuǎn)染miRNA-200b+sh-VEGF組 48 h后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的穿膜能力低于對(duì)照組、miRNA-200b組、sh-VEGF組(P均<0.05)。結(jié)論miRNA-200b通過靶向調(diào)控VEGF的表達(dá)而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；微小RNA-200b；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)；侵襲

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療目的以根治腫瘤和保護(hù)有效視力為主，但是一些放射治療和化學(xué)治療的方式可能引起干眼病、視神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障或繼發(fā)于眼眶發(fā)育不良的面部畸型等病癥，眼球的摘除術(shù)會(huì)使病人永久性的喪失患側(cè)視力；而繼發(fā)的腫瘤及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移更是致命性的，因此現(xiàn)有的治療效果常常是有限的[1]?；蛑委煹陌l(fā)展也為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療提供了新的方法，可避免徹底地眼球摘除或放化療等帶來的繼發(fā)疾病，因此有效作用靶點(diǎn)的尋找也成為了一個(gè)熱點(diǎn)。

微小RNA(miRNA)為內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，包括個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等多方面。研究表明，miRNA-200b與多種腫瘤的生長(zhǎng)增殖及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，如胃癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等[2-4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)為一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，高表達(dá)的VEGF不僅可促進(jìn)腫瘤的血管新生，且與腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。VEGF的高表達(dá)意味著腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性增強(qiáng)，術(shù)后的生存期下降[5]。VEGF也可減低小鼠足細(xì)胞的黏附性，激活PI3K/Akt信號(hào)通路[6]。本研究中，我們擬證實(shí)miRNA-200b可通過靶向調(diào)控VEGF蛋白的表達(dá)而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲，并進(jìn)一步探討miRNA-200b在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的抑瘤功能及內(nèi)在分子機(jī)制。

材料與方法

一、主要材料

miRNA-200b 模擬物(miRNA-200b)及無關(guān)序列對(duì)照(miRNA-NC)從美國(guó)Ambion公司購(gòu)買，miRNA-200b 模擬物序列為，5’-TCATCATTACCAGGCAGTATTA-3’，miRNA-NC序列為 5’-AATGGAACGATACAGAGTAGATT-3’， VEGF Short Hairpin RNA(shRNA) Lentiviral Particles (Human, sc-108080)重組載體pRFP-C-RS(VEGF shRNA)及其對(duì)照為shRNA-NC，鼠單抗人VEGF和鼠單抗GAPDH購(gòu)買于美國(guó)Santa cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購(gòu)買于武漢博士德公司。pcDNA 3.1-VEGF重組載體(A DNA sequence encoding the mature form of human VEGF)、VEGF、pcDNA3.1空載體對(duì)照(vector)、突變型VEGF的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)的熒光素酶報(bào)告載體(VEGF-mut)和野生型VEGF的3’-UTR的熒光素酶報(bào)告載體(VEGF-wt)由廣州市復(fù)能基因公司成功構(gòu)建。雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于美國(guó)Promega公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol購(gòu)買于美國(guó)Invitrogen公司。PRIM1640和Opti-MEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司。MTS細(xì)胞生長(zhǎng)增殖/毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司。人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞購(gòu)買于中科院上海生化細(xì)胞研究所。蛋白提取試劑盒購(gòu)買于上海 BestBio 貝博生物公司。BCA和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(Enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購(gòu)買于美國(guó)Pierce公司，Transwell小室及基質(zhì)膠等相關(guān)試劑購(gòu)買于美國(guó)BD公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清(FBS)，1%青霉素-鏈霉素溶液和2 mmol/L的谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。Y79細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)呈單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，傾棄培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，隨后用0.25% 胰酶消化，在顯微鏡下觀察見細(xì)胞間隙增大后，隨即傾棄胰酶，加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，并吹打細(xì)胞使其成單細(xì)胞懸液，常規(guī)傳代。

三、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA和質(zhì)粒

收集培養(yǎng)瓶中預(yù)先培養(yǎng)至約80%左右密度的細(xì)胞，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋，吹打制成5×104細(xì)胞/ml的單細(xì)胞懸液，按2 ml/孔鋪至6孔板中，100 μl/孔鋪至96孔板中，并放置在5% CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)60%～80%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。接種細(xì)胞于6孔或96孔板中，待完全培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)至30%～50%密度時(shí)，在無菌EP管中配好Lipofectamin 2000及待轉(zhuǎn)染試劑；室溫放置20 min，使脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合體；用無血清培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞。然后向復(fù)合體中加入無血清培養(yǎng)液(不含抗生素)，溫和地混勻，加入到待轉(zhuǎn)染的6或96孔板中；置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中，48 h后，收集細(xì)胞并抽提蛋白。

四、熒光素酶活性檢測(cè)miRNA-200b是否與VEGF的3-UTR區(qū)結(jié)合

將實(shí)驗(yàn)分成4組：miRNA-200b+VEGF-wt、miRNA-NC+VEGF-wt、miRNA-200b+VEGF-mut、miRNA-NC+VEGF-mut。分別共轉(zhuǎn)染上述4組于Y79細(xì)胞48 h后，收獲細(xì)胞。按熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)的說明書用單光子檢測(cè)儀(美國(guó)Biorad公司)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶的活性。計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性，公式為螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

五、蛋白免疫印跡法檢測(cè)Y79細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)改變

將實(shí)驗(yàn)分2組：miRNA-200b與miRNA-NC、VEGF與vector。分別轉(zhuǎn)染上述各組于Y79細(xì)胞48 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定各組蛋白濃度。每孔分別取30 μg樣本，進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%胎牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入1∶200鼠抗人VEGF抗體或1∶1 000鼠抗人GAPDH抗體，4℃過夜。TBST洗膜30 min，加入1∶10 000辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗，并且室溫孵育1～1.5 h，TBST洗膜30 min后加入ECL發(fā)光劑，X片曝光、顯影、定影。掃描條帶后獲取并保存圖片。Quantity One軟件分析，以目的蛋白質(zhì)條帶的灰度值和內(nèi)參GADPH的 蛋白灰度值比值來表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

六、MTS法檢測(cè)miRNA-200b mimics和VEGF對(duì)Y79細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性的影響

將實(shí)驗(yàn)分成6組：miRNA-200b、miRNA-NC、sh-VEGF、shRNA-NC、miRNA-200b+sh-VEGF、mi-RNA-NC+shRNA-NC。分別轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在未接種細(xì)胞的孔中加入RPMI-1640培養(yǎng)基來作為調(diào)零孔。轉(zhuǎn)染后放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μl MTS檢測(cè)試劑，37℃孵育2 h后，每孔中加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min至使結(jié)晶物充分融解。隨后用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)的吸光度值(OD492)。增殖活性計(jì)算公式為：(處理組-調(diào)零孔)/(對(duì)照組比-調(diào)零孔)×100%，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。先轉(zhuǎn)染好細(xì)胞，然后把轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞消化并接種到96孔板，接種后再培養(yǎng)48 h。

七、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室中鋪加基質(zhì)膠稀釋液，放置過夜使其成膜。次日取100 μl細(xì)胞稀釋液接種于小室的上腔，下腔中加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，取出并擦棄小室上層的細(xì)胞，并用甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。PBS緩沖液清洗，倒置并晾干。在光學(xué)顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并取平均值。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、VEGF為miRNA-200b直接調(diào)控的靶基因

通過TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)，VEGF為miRNA-200b預(yù)測(cè)的靶基因；隨后將miRNA-200b和miRNA-NC分別共轉(zhuǎn)染到VEGF-wt與VEGF-mut兩組中，采用單光子檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果表明miRNA-200b在VEGF-mut和VEGF-wt組中熒光素酶活性強(qiáng)度分別為(0.974±0.091，0.543±0.062)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.876, P=0.018)；而miRNA-NC在VEGF-mut和VEGF-wt組的活性強(qiáng)度分別為(0.921±0.116，0.861±0.083)，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.421, P=0.695)，見圖1。

二、過表達(dá)miRNA-200b和下調(diào)VEGF表達(dá)抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖

為驗(yàn)證miRNA-200b對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖的影響，分別轉(zhuǎn)染sh-VEGF(100 nmol/L)和對(duì)照組(shRNA-NC)到Y(jié)79細(xì)胞中，蛋白免疫印跡法檢測(cè)干擾效果，結(jié)果表明sh-VEGF組(OD=0.547±0.041)中VEGF蛋白表達(dá)低于shRNA-NC組(OD=1.063±0.148)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.831, P=0.014，見圖2A)。

MTS法結(jié)果表明(圖2B)，轉(zhuǎn)染miRNA-200b 組Y79細(xì)胞的生存率(56±6%)低于miRNA-NC組(97±5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.379, P=0.005)；轉(zhuǎn)染sh-VEGF 組Y79細(xì)胞的生存率(55±4%)低于shRNA-NC組(95±7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.850, P=0.008，圖2B)；而共轉(zhuǎn)染miRNA-200b+sh-VEGF組Y79細(xì)胞的生存率(31±4%)低于對(duì)照組、miRNA-200b組、sh-VEGF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.887, P<0.05)。即過表達(dá)miRNA-200b和下調(diào)VEGF的表達(dá)均能抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，且過表達(dá)miRNA-200b和下調(diào)VEGF的表達(dá)具有協(xié)同作用。

圖1　miRNA-200b的靶基因預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告載系統(tǒng)驗(yàn)證圖

A：VEGF的基因3'非編碼區(qū)(UTR)上含有一個(gè)miRNA-200b的結(jié)合位點(diǎn)； B：熒光素酶報(bào)告載系統(tǒng)檢測(cè)miRNA-200b對(duì)VEGF 3’UTR的熒光酶活性的影響；*P<0.05

圖2　MTS法檢測(cè)過表達(dá)miRNA-200b對(duì)Y79細(xì)胞增殖能力的作用

A：蛋白免疫印跡法檢測(cè)sh-VEGF轉(zhuǎn)染的干擾效果；B：各轉(zhuǎn)染組Y79細(xì)胞生存率的統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

三、miRNA-200b通過靶向VEGF抑制Y79細(xì)胞的侵襲能力

Transwell結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-200b組穿出基底膜細(xì)胞數(shù)為(95±10)，低于miRNA-NC組(168±6，t=5.667, P=0.004)；轉(zhuǎn)染sh-VEGF組穿出基底膜細(xì)胞數(shù)為(84±6.2)，低于shRNA-NC組(164±13，t=5.578, P=0.005)；而共轉(zhuǎn)染miRNA-200b+sh-VEGF組穿出基底膜細(xì)胞數(shù)為(51±5)，低于對(duì)照組、miRNA-200b組、sh-VEGF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.607, P=0.001)，見圖3。表明過表達(dá)miRNA-200b或下調(diào)VEGF的表達(dá)均能抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲，且過表達(dá)miRNA-200b與下調(diào)VEGF的表達(dá)具有協(xié)同作用。

圖 3　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)miRNA-200b對(duì)Y79細(xì)胞侵襲能力的作用

A：穿過基底膜的Y79細(xì)胞顯微照片(×200) ；B：各轉(zhuǎn)染組Y79細(xì)胞穿出數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

討　　論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是一種常見于兒童及新生兒的視網(wǎng)膜惡性腫瘤，在美國(guó)5歲以下的兒童該病的發(fā)病率達(dá)1/18 000，且發(fā)展十分迅速，在南美及中美地區(qū)和發(fā)展中國(guó)家，發(fā)病率及死亡率更高[7]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤有遺傳和非遺傳型之分，遺傳型為常染色體顯性遺傳，多數(shù)雙眼發(fā)病，發(fā)病早且易轉(zhuǎn)移而致死；后者的基因突變僅發(fā)生在視網(wǎng)膜細(xì)胞，常見于單側(cè)或散發(fā)型，發(fā)病晚，無陽性家族史[8-9]。臨床上常用的治療手段包括化學(xué)治療、外放射治療、冷凍治療、溫?zé)嶂委煛⒐饽讨委?、光?dòng)力學(xué)治療和眼球摘除手術(shù)。

miRNA-200家族在腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著極其重要的作用[10-11]。許多研究顯示miRNA-200b在細(xì)胞，組織和不同的腫瘤中均表達(dá)異常[12-16]。但迄今為止，很少有關(guān)于miRNA-200b在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中表達(dá)情況及相關(guān)功能的研究。

在本研究中，首先我們通過熒光素酶活性檢測(cè)證實(shí)VEGF為miRNA-200b的靶基因。為進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-200b對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖的影響，我們分別轉(zhuǎn)染sh-VEGF及對(duì)照組(shRNA-NC)到Y(jié)79細(xì)胞中，通過蛋白定量和蛋白免疫印跡法證實(shí)sh-VEGF對(duì)VEGF表達(dá)的抑制作用后，MTS法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性驗(yàn)證過表達(dá)miRNA-200b和下調(diào)VEGF的表達(dá)具有協(xié)同作用，即均能抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。在分別轉(zhuǎn)染VEGF及對(duì)照組(vector)到Y(jié)79細(xì)胞中，通過蛋白定量和蛋白免疫印跡法證實(shí)轉(zhuǎn)染VEGF可增加VEGF的蛋白表達(dá)后，MTS法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性驗(yàn)證過表達(dá)VEGF能夠逆轉(zhuǎn)miRNA-200b對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制作用。最后我們通過分別轉(zhuǎn)染VEGF、vector以及miRNA-200b與miRNA-NC、VEGF與vector、miRNA-200b+VEGF與miRNA-NC+vector到Y(jié)79細(xì)胞中，統(tǒng)計(jì)基底膜細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)miRNA-200b能通過靶向VEGF抑制Y79細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，miRNA-200b可通過直接靶向VEGF抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)與侵襲，miRNA-200b可能為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的潛在的治療靶點(diǎn)，為今后該疾病的防治提供了新的切入點(diǎn)。

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(本文編輯：楊江瑜)

miRNA-200b inhibits retinoblastoma cell proliferation and invasion by targeting VEGF

Liu Yuefeng, Luo Weimin, Zhang Yong, Zhong Xiaodong.

Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China Corresponding author, Luo Weimin, E-mail: luoweimin0803@sina.com

ObjectiveTo explore whether miRNA-200b inhibits retinoblastoma cell proliferation and invasion by targeted-regulating the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), and further elucidate the molecular mechanism underlying the anti-tumor function of miRNA-200b. MethodsRetinoblastoma cell line Y79 was divided into miRNA-200b, miRNA-NC, sh-VEGF, shRNA-NC, miRNA-200b+sh-VEGF and miRNA-NC+shRNA-NC groups. The effect of miRNA-200b upon the luciferase activity of VEGF 3’-UTR was evaluated by luciferase assay. The intervention effect of sh-VEGF transfection was assessed by Western blot. The proliferation and invasion ability of Y79 cells in each group were evaluated by MTS and Transwell assays when transfected with miRNA-200b and miRNA-NC, sh-VEGF and shRNA-NC, miRNA-200b+sh-VEGF and miRNA-NC+shRNA-NC, respectively. ResultsLuciferase assay revealed that miRNA-200b could specifically bind with the 3’-UTR of VEGF and suppress the luciferase activity. Western blot detected that the expression of VEGF protein in the sh-VEGF transfection group was significantly down-regulated compared with that in the shRNA-NC group (P<0.05). MTS assay revealed that the survival rates of Y79 cells at 48 h after miRNA-200b and sh-VEGF transfection were considerably lower compared with those in corresponding control groups (both P<0.05). At 48 h following co-transfection with miRNA-200b and sh-VEGF, the survival rate of Y79 cells was significantly lower than those in corresponding control, miRNA-200b and sh-VEGF groups (all P<0.05). Transwell assay showed that the invasion ability of Y79 cells through the basement membrane was significantly lower compared with those at 48 h after miRNA-200b and sh-VEGF transfection (both P<0.05). At 48 h after co-transfection with miRNA-200b and sh-VEGF, the invasion ability of Y79 cells through the basement membrane was considerably lower than those in the corresponding control, miRNA-200b and sh-VEGF groups (all P<0.05). ConclusionmiRNA-200b inhibits the proliferation and invasion of retinoblastoma cells by targeted regulation of VEGF expression.

Retinoblastoma; MiRNA-200b; Vascular endothelial growth factor; Proliferation;Invasion

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.08.005

十堰市科技課題(14Y40)；湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目(B2015477)

442000 十堰，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院眼科中心

，羅衛(wèi)民，E-mail: luoweimin0803@sina.com

2016-01-06)