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    局部聯(lián)合移植hUCMSCs與VEGF對MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響

    2016-09-06 01:05:10偉遼寧醫(yī)學(xué)院遼寧錦州121000
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2016年11期
    關(guān)鍵詞:充質(zhì)腦缺血干細胞

    王 盼 單 偉遼寧醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121000

    局部聯(lián)合移植hUCMSCs與VEGF對MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響

    王盼單偉▲
    遼寧醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州121000

    目的將血管內(nèi)皮生長因子(vascu1ar endothe1ia1 growth factor,VEGF)與體外培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbi1ica1 cord derived mesenchyma1 stem ce11s,hUCMSCs)聯(lián)合植入腦缺血(midd1e cerebra1 artery occ1usion,MCAO)模型大鼠腦內(nèi),觀察神經(jīng)功能改善情況。 方法選擇75只SD大鼠,實驗分組如下:MCAO組,僅制備缺血模型;假手術(shù)組,僅分離頸總動脈,不栓塞;VEGF組,缺血24 h后,局部缺血區(qū)給予VEGF治療;hUCMSCs組,缺血24 h后,局部缺血區(qū)給予hUCMSCs治療;hUCMSCs+VEGF聯(lián)合組,缺血24 h后,局部缺血區(qū)給予hUCMSCs+ VEGF治療。觀察缺血前、缺血后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d各個時間點改良神經(jīng)功能評分(mNSS)變化。結(jié)果hUCMSCs的增殖及分化不受Brdu標記的影響;缺血后,隨著治療時間的延續(xù),單因素治療組內(nèi)(VEGF組、hUCMSCs組)大鼠的mNSS評分減低,聯(lián)合組治療效果優(yōu)于單獨因素處理組,且在不同時間點之間有顯著性差異(F= 5.018,P<0.01)。MCAO組的mNSS評分高于VEGF組、hUCMSCs組和聯(lián)合組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在所選擇觀察的6個時間點內(nèi),聯(lián)合組21 d時mNSS評分得分最低。結(jié)論VEGF聯(lián)合hUCMSCs移植入MCAO模型大鼠腦內(nèi),可促進缺血模型大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。

    腦缺血;臍帶間充質(zhì)干細胞;血管內(nèi)皮細胞生長因子;神經(jīng)功能

    [Abstract]Objective To imp1ant vascu1ar endothe1ia1 growth factor(VEGF)and human umbi1ica1 cord derived mesenchyma1 stem ce11s(hUCMSCs)together into the brain of mode1 rats with midd1e cerebra1 artery occ1usion(MCAO)and observe the nerve function improvement situation.Methods Seventy-five SD rates were divided into the fo11owing groups:MCAO group,in which on1y ischemia mode1 was estab1ished,fake surgery group,in which on1y common carotid artery was separated without embo1ism,VEGF group,in which VEGF treatment was given in 1oca1 ischemic region 24 hours after ischemia,hUCMSCs group,in which hUCMSCs treatment was given in 1oca1 ischemic region 24 hours after ischemia,and hUCMSCs+VEGF combination group,in which hUCMSCs+VEGF treatment was given in 1oca1 ischemic region 24 hours after ischemia.The changes of modified neuro1ogica1 severity scores(mNSS)before ischemia and 1 day,4 days,7 days,14 days and 21 days after ischemia were observed.Results Pro1iferation and differentiation of hUCMSCs were not inf1uenced by Brdu mark.After ischemia,as treatment continued,mNSS scores of the sing1e factor treatment groups(VEGF group and hUCMSCs group)reduced,and combined treatment group was better than sing1e factor treatment group in treatment effects,with significant differences at different time points(F=5.018,P<0.01).Compared with the VEGF group,hUCMSCs group and combined group,the score of mNSS of the MCAO group was higher,and the difference was statistica11y significant(P<0.05),score of mNSS in the combined group showed the 1owest scoring at the 21 d,in the se1ected six time point.Conclusion Combined transp1antation of VEGF and hUCMSCs into brain of MCAO mode1 rates can promote the nerve function recovery of ischemic mode1 rats.

    [Key words]Cerebra1 ischemia;Umbi1ica1 cord mesenchyma1 stem ce11s;Vascu1ar endothe1ia1 growth factor;Nerve function

    腦缺血是臨床上神經(jīng)系統(tǒng)疾病中較為常見,并且在臨床上有著高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的三大顯著特點,尤其是對老年人群的危害性更為明顯[1,2],這也就要求我們研究者給予更多的關(guān)注。今年來隨著科技的不斷進步,越來越多的實驗已經(jīng)證實干細胞對于腦缺血可以發(fā)揮神經(jīng)保護作用,從不同程度上可以緩解腦組織急性缺血所帶來的損傷。作為間充質(zhì)干細胞中取材、培養(yǎng)都有著獨特優(yōu)勢的臍帶間充質(zhì)干細胞,可以對腦缺的癥狀有一定的恢復(fù)[3]。而血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作為血管再生過程中最為重要的經(jīng)典因子在腦缺血后的保護作用也從血管再生方面引起了人們越來越多的重視[4]。本研究將hUCMSCs與VEGF聯(lián)合移植入缺血模型大鼠局部腦區(qū),在不同時間點比較聯(lián)合組與單一因素處理組之間的大鼠神經(jīng)功能情況,從而來進一步為探討兩者聯(lián)合對腦缺血的神經(jīng)保護作用提供實驗依據(jù)?,F(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1材料來源

    75只成年SD健康大鼠,雌雄均可,體重290~320 g,由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗所需編號為G1161的人臍帶間充質(zhì)干細胞,來源于天津國家干細胞中心。本實驗于2010年3月~2011年12月期間于遼寧醫(yī)學(xué)院完成。

    1.2實驗方法

    1.2.1hUCMSCs的培養(yǎng)、標記 將純化的第3代hUCMSCs用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)進行消化、處理后,重新鋪培養(yǎng),待細胞之間有70%融合后,5-溴脫氧尿苷(BrdU)進行標記,培養(yǎng)時間為48 h,當大部分細胞在90%融合的條件下,觀察,1×PBS清洗、收集,便于細胞移植備用。

    1.2.2Brdu陽性細胞的檢測及計數(shù)將細胞爬片取出,4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS漂洗3次,每次5 min。含5%BSA封閉液4℃封閉1 h,一抗羊抗兔BrdU單克隆抗體(1∶200)4℃冰箱,過夜結(jié)合。室溫復(fù)溫1 h,1×PBS液體漂洗3次,滴加相應(yīng)二抗,室溫孵育1 h。DAB顯色,永久封片劑封片。Leica DM4000顯微鏡下,明視野400倍下觀察,采集圖像。

    1.2.3缺血動物模型的制備 根據(jù)Longa等[5]所建立的改良線栓法,制備大鼠腦缺血模型,每組各個時間點制備缺血模型5只。假手術(shù)組:僅有一側(cè)的頸總動脈不給予線栓,也不給予任何治療;MCAO僅分離頸總動脈,將自制的魚線插入大腦中動脈,制備缺血模型;VEGF組,模型制備成功24 h后,在缺血區(qū)和缺血區(qū)周圍注射VEGF;hUCMSCs組,模型制備成功24 h后,在缺血區(qū)和缺血區(qū)周圍注射hUCMSCs;聯(lián)合組則是在模型制備成功24 h后,在缺血區(qū)和缺血區(qū)周圍注射hUCMSCs+VEGF。

    1.2.4移植10 μL Brdu標記的hUCMSCs用于移植hUCMSCs組,濃度為1×106個/μL。收集含VEGF的細胞懸液10 μL,VEGF濃度為10 ng/mL,用于聯(lián)合組。將大鼠麻醉后,固定在立體定位儀上,根據(jù)圖譜確定具體注射位點為:皮質(zhì)區(qū)(AP=-1.0 mm;ML=2.0 mm;DV=2.0 mm);缺血邊緣區(qū)(AP=-1.0 mm;ML=4.0 mm;DV=4.5 mm)1 μL/min采用微量注射器緩慢注射,留針5 min。術(shù)畢,骨窗用骨蠟予以封閉。

    1.3神經(jīng)功能評分

    以mNSS評分標準[6]為評分依據(jù),在以下6個時間點對動物進行改良神經(jīng)功能評分判定,具體時間點為:對缺血前、缺血后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d 6個時間點。根據(jù)各組間所得分數(shù)進行比較,0分為正常,18分為最高功能障礙。

    1.4統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以()表示,采用析因方差分析、t檢驗,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1純化標記的細胞檢測效果

    光鏡下觀察細胞的形態(tài)、確定標記后的細胞增殖及分化均未受到外界影響。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后,48 h,標記率可達到98%以上,深棕色為Brdu標記的細胞核。見封三圖1。

    2.2mNSS評分

    未造模前各組大鼠的神經(jīng)功能正常;造模24 h后,除假手術(shù)組外,各組大鼠神經(jīng)功能評分之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);所觀察的各個時間段,不同處理組之間的評分不同,除假手術(shù)組、MCAO組外,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。處理因素與治療時間兩者有協(xié)同作用(F=5.595,P<0.01),交互效應(yīng)圖見封三圖2;MCAO組的mNSS評分高于VEGF組、hUCMSCs組和聯(lián)合組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在所選擇觀察的6個時間點內(nèi),聯(lián)合組21 d時mNSS評分得分最低。見表1。

    表1 不同組別大鼠在不同時間的mNSS評分(,n=5)

    表1 不同組別大鼠在不同時間的mNSS評分(,n=5)

    注:不同時間點各組間(F總=220.249,P<0.01),假手術(shù)組內(nèi)(P>0.05),MCAO組內(nèi)(F=4.713,P>0.05),hUCMSCs組(F=5.212,P<0.05),VEGF組(F=5.695,P<0.05),聯(lián)合組(F=5.018,P<0.01)?!c假手術(shù)組比較,缺血后1 d,t=2.368、2.287、2.276、2.201,缺血后4 d,t=2.469、2.398、2.167、2.248;缺血后7 d,t=2.618、2.541、2.609、2.264;缺血后14 d,t=2.63、2.386、2.371、2.296;缺血后21 d,t=2.628、2.308、2.316、2.281;P<0.05;*與MCAO組比較,缺血后7 d,t=2.636、2.576、3.108;缺血后14 d,t=2.416、2.916、3.108;缺血后21 d,t=2.371、2.812、2.989;P<0.05,△與hUCMSCs組比較,t=2.579、2.627、2.631,P<0.05;#與VEGF組比較,t=2.682、2.618、2.718,P<0.05

    組別 缺血前假手術(shù)組MCAO組hUCMSCs組VEGF組聯(lián)合組缺血后1 d 缺血后4 d 缺血后7 d 缺血后14 d 缺血后21 d 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2.24±0.64 13.83±0.75※13.67±1.03※13.58±1.36※13.67±1.21※1.30±0.32 13.33±2.08※12.67±2.92※12.47±3.50※11.57±3.42※1.15±0.19 12.62±0.93※11.63±0.89※*11.80±1.41※*10.97±0.50※*△#0.00±0.00 11.67±1.03※11.22±0.35※*11.00±1.67※*10.45±0.31※*△#0.00±0.00 11.42±3.02※10.22±3.28※*10.58±2.02※*8.92±2.73※*△#

    3 討論

    眾所周知,在腦缺血后的一段時間內(nèi)會有神經(jīng)的自我恢復(fù),在這一過程中常與神經(jīng)元及其突觸可塑性是相伴隨而發(fā)生的[7]。人臍帶間充質(zhì)干細胞最易于應(yīng)用于臨床,是因為其可以取自于本人,能夠避免異體移植所帶來的排斥反應(yīng),取材也十分便利,避免了倫理道德的爭議。雖然目前干細胞治療腦缺血的實驗機制尚未明確,但其對于大鼠腦缺血癥狀的改善已經(jīng)得到了證實。本實驗結(jié)果顯示,hUCMSCs組和MCAO組的神經(jīng)功能評分相比較,表明移植干細胞可以治療腦缺血,機制可能是缺血區(qū)有hUCMSCs的遷移,從而改善了腦缺血的癥狀。

    在腦缺血發(fā)生的過程中,缺血梗死區(qū)及缺血區(qū)得周邊可能會發(fā)生一系列的病理變化[8-9],包括:細胞凋亡、炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)內(nèi)分泌改變等,可以影響所移植細胞的分化率和存活率。到目前為止,研究者們?nèi)匀辉谔接懸浦哺杉毎笏浦布毎拇婊盥室约按婊顮顟B(tài)[10]。VEGF是具有較高活性的多聚肽類物質(zhì),已有研究證實,VEGF可以作為直接促進神經(jīng)再生。并且能否誘導(dǎo)下游的Src家族激酶,可以對抗腦缺血后血管滲漏,并且可以發(fā)揮阻止水腫形成的作用。另一方面,也能夠直接抑制神經(jīng)元細胞凋亡的數(shù)量,從而提高學(xué)習(xí)及記憶的能力[11,12]。因此,本實驗顯示,移植VEGF 21 d后,VEGF組和MCAO組比較神經(jīng)功能評分有明顯改善。

    本實驗采用聯(lián)合移植于腦缺血區(qū)的局部,觀察其行為學(xué)神經(jīng)功能評分的改變。mNSS評分從5個方面進行神經(jīng)功能的綜合評分,通過有無異常運動、感覺方面、運動方面、運動是否喪失、平衡木實驗等這5個方面評分能夠?qū)Υ笫蟮纳窠?jīng)功能改變進行權(quán)威的評判。實驗數(shù)據(jù)顯示,最為顯著的指標是運動功能的改變。在經(jīng)過聯(lián)合組,治療后21 d后,缺血鼠的神經(jīng)功能狀態(tài)得以改善,運動方面功能恢復(fù),缺血后患側(cè)肢體向?qū)?cè)屈曲的程度有所好轉(zhuǎn),隨著給予治療時間的延長,可以看出聯(lián)合治療組與MCAO組比較統(tǒng)計學(xué)差異更為顯著(P<0.05),與VEGF和hUCMSCs組比較有顯著差異(P<0.05),提示聯(lián)合治療能夠改善缺血大鼠神經(jīng)癥狀。VEGF和hUCMSCs兩者聯(lián)合的協(xié)同效應(yīng)可能是由于一方面干細胞與缺血區(qū)代償?shù)哪X部神經(jīng)干細胞進行整合;另一方面,兩者共同存在情況下能夠促微血管再生,使缺血區(qū)的血運增加,進而發(fā)揮對缺血的治療作用[13-15]。

    綜上,VEGF聯(lián)合hUCMSCs移植入MCAO模型大鼠腦內(nèi),可促進缺血模型大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。

    [1]Tsui W,Pierre K,Masse1 D.Patient reperfusion preferences in acute my ocardia1 infarction:Morta1ity versus stroke,benefits versus costs,high techno1ogy versus drugs[J]. Can J Cardio1,2005,21(5):423-431.

    [2]Fahed R,Redjem H,B1anc R,et a1.Endovascu1ar management of acute ischemic strokes with tandem occ1usions[J]. Cerebrovasc Dis,2016,12,41(5-6):298-305.

    [3]Liao W,Zhong J,Yu J,et a1.Therapeutic benefit of human umbi1ica1 cord derived mesenchyma1 stroma1 ce11s in intracerebra1 hemorrhage rat:Imp1ications of anti-inf1ammation and angiogenesis[J].Ce11 Physio1 Biochem,2009,24 (3-4):307-316.

    [4]Thurston G,Rudge JS,Ioffe E,et a1.Angiopoietin-1 protects the adu1t vascu1ature against p1asma 1eakage[J].Nat Med,2000,6(4):460-463.

    [5]Longa EZ,Weinstein PR,Car1son S,et a1.Reversib1e midd1e cerebra1 artery occ1usion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989,20(1):84-91.

    [6]王盼,李德華.hUCMSCs與VEGF聯(lián)合移植對腦缺血大鼠腦損傷修復(fù)的實驗研究[D].遼寧醫(yī)學(xué)院,2012.

    [7]Yuan T,Liao W,F(xiàn)eng NH,et a1.Human induced p1uripotent stem ce11-derived neura1 stem ce11s survive,migrate,differentiate,and improve neuro1ogic function in a rat mode1 of midd1e cerebra1 artery occ1usion[J].Stem Ce11 Res Ther,2013,4(3):73.

    [8]Hicks A,Jo1kkonen J.Cha11enges and possibi1ities of intravascu1ar ce11 therapy in stroke[J].Acta Neurobio1 Exp (Wars),2009,69(1):1-11.

    [9]Parr AM,Tator CH,Keating A.Bone marrow-derived mesenchyma1 stroma1 ce11s for the repair of centra1 nervous system injury[J].Bone Marrow Transp1ant,2007,40(7):609-619.

    [10]Carmichae1 ST.Trans1ating the frontiers of brain repair to treatments:Starting not to break the ru1es[J].Neurobio1 Dis,2010,37(2):237-242.

    [11]Kim HS,Choi SM,Yang W,et a1.PSA-NCAM(+)neura1 precursor ce11s from human embryonic stem ce11s promote neura1 tissue integrity and behaviora1 performance in a rat stroke mode1[J].Stem Ce11 Rev,2014,10(6):761-771.

    [12]Roux S,Leotot J,Cheva11ier N,et a1.Mesenchyma1 stroma1 ce11s:Bio1ogica1 properties and c1inica1 prospects[J]. Transfus C1in Bio1,2011,18(1):1-12.

    [13]Ma Y,Qiang L,He M.Exercise therapy augments the ischemia-induced proangiogenic state and resu1ts in sustained improvement after stroke[J].Int J Mo1 Sci,2013,18,14(4):8570-8584.

    [14]Hao P.Monitoring of rena1 ischemia reperfusion injury in rabbits by u1trasonic contrast and its re1ationship with expression of VEGF in rena1 tissue[J].Asian Pac J Trop Med,2016,9(2):188-192.

    [15]Diao YP,Cui FK,Yan S,et a1.Nerve growth factor promotes angiogenesis and ske1eta1 musc1e fiber Remode1ing in a murine mode1 of hind1imb ischemia[J].Chin Med J (Eng1),2016,129(3):313-319.

    Influence of local combined transPlantation of hUCMSCs and VEGF on nerve function of MCAO rats

    WANG PanSHAN Wei
    Laioning Medica1 Co11ege,Jinzhou121000,China

    R743.31

    A

    1673-97O1(2O16)11-OO17-O3

    遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目(L2013332)▲

    2016-02-29)

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